Массив серийной анестезии для высокопроизводительного исследования летучих агентов с использованием Drosophila melanogaster

Существование побочных анестезирующих эффектов (т.е. эффектов, которые не наблюдаются сразу, но могут иметь отсроченные поведенческие последствия) является общепризнанным, но понимание их механизмов и факторов риска остается рудиментарным ^1,2. Их отсроченное проявление и тонкость ограничивают количество потенциально важных переменных, которые могут быть исследованы в моделях млекопитающих в разумные сроки и по приемлемой цене. Плодовая муха (Drosophila melanogaster) обладает уникальными преимуществами в контексте нейродегенеративных заболеваний³ и токсикологического скрининга⁴, которые до настоящего времени не применялись для изучения побочных эффектов анестезии.

Мы разработали массив серийной анестезии (SAA) для облегчения использования плодовых мушек в изучении фармакодинамики и фармакогенетики анестезии. Ключевым преимуществом SAA является одновременное воздействие идентичных экспериментальных условий нескольких когорт. В сочетании с экспериментальной гибкостью плодовых мушек высокая пропускная способность SAA позволяет исследовать биологические и экологические переменные в масштабах, невозможных в моделях млекопитающих.

В принципе, SAA представляет собой просто серию соединенных мест анестезии (камер из флаконов по 50 мл), через которые газ-носитель доставляет летучие агенты. Первая камера системы содержит дистиллированную воду, через которую газ-носитель увлажняется (мухи чувствительны к обезвоживанию), и она заканчивается простым индикатором потока, который показывает поток газа через систему. Тонкие сетки, размещенные на отверстиях соединительной трубки, разделяют камеры, чтобы предотвратить миграцию мух между камерами. Количество мест «последовательно» ограничено сопротивлением потоку газа без давления (насосно-компрессорные трубы, сетки).

Мы охарактеризовали кинетику этого прототипа SAA в предыдущей публикации⁵. Хотя точные фармакокинетические свойства будут варьироваться между ФАРМ, соответствующие основы, которые были проверены экспериментально, заключаются в следующем: (i) начальный поток 1,5-2 л / мин уравновешивает все камеры (общий объем ±550 мл) с желаемой концентрацией анестетика в течение 2 минут; (ii) концентрация анестетических паров, подаваемых в камеры, не изменяется заметно между первым и последним местом, поскольку количество анестетика, содержащегося в объеме газа в отдельной камере (50 мл), намного превышает количество, поглощаемое любым количеством мух; и (iii) после того, как камеры уравновешены, поток газа-носителя может быть уменьшен (50-100 мл/мин или менее), чтобы избежать отходов и загрязнения окружающей среды (летучие анестетики обладают свойствами парниковых газов). Минимальный расход, необходимый для поддержания стационарной концентрации пара, зависит, прежде всего, от негерметичности SAA, поскольку поглощение пара мухами незначительно. В этих стандартных условиях (2% изофлурана и поток газа-носителя 1,5 л/мин) мухи обезболиваются (т.е. неподвижны) во всех положениях массива в течение 3-4 минут, с незаметными различиями между положениями. VGA можно вводить от нескольких минут до нескольких часов, и наши типичные парадигмы воздействия находятся в диапазоне от 15 минут до 2 часов. Для промывки системы испаритель отключается, и поток поддерживается для обмена примерно 10-кратного объема массива (1,5 л/мин в течение 5 минут). Скорость выведения анестетика будет варьироваться в зависимости от заданной скорости потока.

Летучие анестетики взаимодействуют с многочисленными еще не идентифицированными мишенями, включая иммунно-воспалительную систему⁶. Вклад отдельных молекулярных мишеней в первичные и побочные исходы («анестезирующее состояние» по сравнению с долгосрочными и краткосрочными «побочными эффектами») плохо изучен. Таким образом, чувствительная, высокопроизводительная система мух ценна для информирования об экспериментах на высших животных, несмотря на очевидные различия между мухами и млекопитающими⁷. Некоторые различия могут, на самом деле, быть выгодными; Например, иммунная система мухи отличается от иммунной системы высших животных тем, что у нее отсутствует адаптивная рука ответа⁸. Хотя это может показаться ограничением для понимания болезни у людей, это дает уникальную возможность изучить взаимодействие VGA с врожденным иммунно-воспалительным ответом в отрыве от адаптивного ответа⁹. Это позволяет изучать фармакологические эффекты VGA на воспаление и их модуляцию различными генетическими фонами, присутствующими в популяции.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в протоколе.

1. Строительство САА

1. Изготовьте раму, распилив дерево и собрав раму, используя размеры, указанные на рисунке 1А.
2. Модифицируйте конические крышки пробирок объемом 50 мл.
   1. Просверлите по два отверстия в каждом колпачке сверлом 9/32 дюйма. Отшлифуйте отверстия, чтобы очистить рваный пластик. Отшлифуйте верхнюю часть колпачка, чтобы придать поверхности шероховатость (это помогает с адгезией клея).
   2. Разрежьте серологические пипетки объемом 5 мл по размеру (3 дюйма для притока и 1,5 дюйма для оттока), надрезав пластик, а затем разбив его на линии надбитых. Отшлифуйте концы разрезанных/сломанных пипеток.
   3. Приклейте сетку к тюбикам (обеспечьте надлежащее время высыхания клея). Обрежьте сетку по размеру трубки после того, как клей высохнет.
   4. Вставьте трубки в отверстия конических колпачков так, чтобы обе трубки выступали (на 3/4 дюйма) над крышкой; убедитесь, что впускная трубка простирается в трубку дольше, чем выпускная (рис. 1B).
   5. Нанесите клей на верхнюю часть колпачков вокруг тюбиков, чтобы скрепить детали вместе (прежде чем продолжить, обеспечьте надлежащее время высыхания клея).
3. Прикрепите колпачки к раме и проложите трубку (рис. 1C).
   1. Прикрепите к раме клейкие кабельные стяжки (3,25 дюйма друг от друга, от центра к центру).
   2. Прикрепите колпачки к раме с помощью стяжек; Коротко обрежьте концы бирки для застежки-молнии.
   3. Отрежьте и подсоедините отрезки (9 дюймов) трубок Tygon к входным/выпускным трубам на каждой модифицированной крышке (рис. 1D). Начиная с верхнего конца, прикрепите сначала к притоку, а затем впоследствии прикрепите трубку от оттока к притоку следующего положения.
   4. Добавьте индикатор расхода к самому последующему «притоку» (позиция 10, рис. 1E).
   5. Поместите коническую трубку объемом 50 мл в первое положение и наполните ее водой чуть ниже впускной трубки (рис. 1F).
4. Подготовьте сопряжение для испарителя. Снимите плунжеры, вырежьте насечки из двух дозирующих шприцев объемом 10 мл (1/2 дюйма в глубину x 1/4 дюйма в ширину, рис. 1G) и вставьте их во вход и выход испарителя так, чтобы насечки были обращены прямо к передней части испарителя, чтобы выровнять отверстия (рис. 1H). Дополнительно: Приклейте модифицированные шприцы на место. Если это возможно, используйте коммерческий коллектор (см. Таблицу материалов для одного из вариантов).
5. Подключите всю систему. Используйте трубку Tygon для соединения компонентов вместе в следующем порядке: газгольдер-носитель с регулятором > расходомер > испаритель > SAA (рис. 1C).
6. Заполните пустые позиции на массиве пустыми коническими пробирками объемом 50 мл. Включите бензобак, откройте расходомер до ~2 л/мин и включите испаритель на 0%. Подтвердите расход газа в системе, проверив расходомер перед испарителем и индикатор расхода после последней камеры SAA на предмет расхода. В качестве альтернативы вставьте конец трубки, расположенный ниже по потоку, в воду и ищите пузырьки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку система не находится под давлением, водяной столб выше пары сантиметров остановит поток. Если на нижнем конце массива нет потока, проверьте следующее: испаритель должен быть включен, чтобы обеспечить поток; убедитесь, что регулятор бака и расходомеры пропускают поток; проверьте положение массива, чтобы убедиться, что трубки плотно прикручены; и проверьте, нет ли утечек вокруг клея на модифицированных колпачках.

Рисунок 1: Конструкция САА. (А) Схема, с измерениями, деревянной рамы, поддерживающей САА. (B) Схематизированное поперечное сечение с измерениями модифицированного колпачка с входными и выпускными трубками, изготовленными из серологических пипеток объемом 5 мл. (C) Собранные SAA (воспроизведены из Olufs et ^al.5) (D) Детали модифицированного конического колпачка объемом 50 мл с изображением входных и выпускных трубок. (E) Последующий (позиция 10) отток с индикатором расхода. (F) Находящаяся выше по потоку (позиция 1) заполненная водой трубка для увлажнения газа-носителя. Красная стрелка указывает уровень воды. (G) Модифицированный дозирующий шприц объемом 10 мл для импровизированного коллектора. Красным кругом выделена вырезная выемка, расположенная между метками 8 мл и 10 мл (или 1/2 дюйма x 1/4 дюйма). (H) Вид испарителя Tec7 сзади с указанием установки и ориентации модифицированных шприцев. На этом снимке установлен только один шприц, чтобы слева было показано отверстие (красная стрелка), которое необходимо выровнять с выемкой модифицированного шприца. Примечание: Смещение этой выемки и выходного отверстия нарушит введение анестетика. Эта часть является потенциальным слабым местом в этой системе, изготовленной по индивидуальному заказу. При наличии средств следует использовать коммерческий коллектор. Аббревиатура: SAA = массив последовательной анестезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Перед воздействием анестетика

1. За двадцать четыре часа или более до воздействия анестетика отсортируйте когорты мух по мере необходимости для эксперимента, используя предпочтительный метод (например, CO₂ или эфир).

3. Деятельность САА

1. Переложите мух из пищевых флаконов в пустые конические пробирки объемом 50 мл (без CO₂).
   1. Подсчитайте и запишите всех мертвых мух до воздействия.
2. Снимите крышку и прикрутите конические пробирки объемом 50 мл с мухами к SAA.
3. Включите газ-носитель и установите желаемый расход.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем 1-2 л/мин.
4. Установите испаритель анестетика на желаемую концентрацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем 2% для изофлурана и 3,5% для севофлурана, которые являются эквипотентными дозами у млекопитающих¹⁰.
5. Экспонируйте мух в течение желаемого времени (мин.: 15 мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется минимальное время экспозиции 15 минут, чтобы избежать возможной изменчивости равновесия в разных положениях SAA. В этой системе требуется 2-3 минуты, чтобы анестетики уравновесились во всех положениях.
6. В конце экспозиции промывайте систему потоком свежего газа (испаритель установлен на 0%) со скоростью 1,5 л/мин в течение 5 мин, что соответствует примерно 10-кратному объему от общего объема SAA.

4. Контрольный список перед началом эксперимента

1. Полностью откройте регулятор высокого давления (сверху воздушного бака), а затем закройте его на пол-оборота, чтобы обеспечить поток газа-носителя.
2. Следуйте трубкам для каждой линии к i) расходомерам и ii) испарителю (убедитесь, что вход/отток подключены правильно) и iii) проверьте уровень анестетика в испарителях.
3. После загрузки камер испытуемыми убедитесь, что воздух / газ течет с помощью пузырькового теста или индикатора потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые испарители не пропускают поток воздуха, когда циферблат находится в выключенном положении.
4. Когда газ течет, убедитесь, что расходомер и индикатор расхода ниже по потоку показывают расход.
5. В конце эксперимента дайте 4-5 минутам воздушного потока вымыть анестетик.

Ссылка на видео SAA предоставлена здесь: Методы исследования Перуанского - Отделение анестезиологии - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Наша лаборатория использовала SAA для (i) изучения влияния генотипа на поведенческую чувствительность к анестетикам5; (ii) скрининг митохондриальных мутантов на предмет побочных эффектов анестетиков11; и (iii) исследовать фармакодинамику изофлурана и севофлурана в отношении исходов при черепно-мозговой травме (ЧМТ)12,13,14,15,16,17. Опубликованные результаты наглядно демонстрируют, что генетический фон влияет на фармакодинамику клинически применяемых ВГА как в отношении традиционного фенотипа анестезии, так и в отношении побочных эффектов анестезирующей токсичности, а также защиты тканей 5,11,13,14,15.

Репрезентативный пример 1 (рис. 2): Генетический дрейф в устойчивости к токсичности изофлурана, обнаруженный в надежно воспроизводимых экспериментальных условиях
Открытие постепенного количественного изменения смертности, индуцированной VGA, среди отдельно культивируемых мух ND2360114 является примером полезности надежных сравнений фармакодинамики анестетика в экспериментальных группах с использованием SAA. ND23 — ген, кодирующий субъединицу в ядре комплекса I mETC (аналог Ndufs8 у млекопитающих)18. Мутации в этой субъединице являются причиной синдрома Ли, смертельного митохондриального заболевания. Мы наблюдали постепенное ослабление фенотипа смертности, индуцированного изофлураном, с течением времени в различных гомозиготных запасах ND2360114 , культивируемых одновременно в стандартных лабораторных условиях (т.е. без воздействия VGA). Эта эволюционная адаптация к токсичности изофлурана происходила при отсутствии какого-либо воздействия VGA и, вероятно, является побочным эффектом «выживания наиболее приспособленных» в мутантных группах. Это постепенное изменение чувствительности к изофлурану осталось бы незамеченным без нашей уверенности в том, что экспериментальные условия были идентичны во всех анализах и с течением времени. Мы пришли к выводу, что отбор благоприятствует модификаторам эффектов ND2360114 с одновременной повышенной устойчивостью к токсичности изофлурана. Поскольку воспаление в центральной нервной системе играет важную роль в патогенезе синдрома Ли, наблюдаемая эволюция резистентности может быть связана с адаптивными изменениями во врожденном иммунно-воспалительном ответе, при этом резистентность к токсичности изофлурана является случайным побочным продуктом.

Рисунок 2: Изменение смертности, вызванной токсичностью изофлурана, в результате эволюционного давления у мух ND2360114. Семь линий (A-G), выделенных из одной популяции путем спаривания одной пары, расширенных и проверенных на 24-часовую смертность (PM24) после 2-часового воздействия 2% изофлурана (в возрасте 10-13 дней), демонстрируют вариабельность фенотипа, возникающего из одной популяции. Данные отображаются в виде прямоугольных и усовых графиков. Прямоугольники представляют собой второй и третий квартили данных, а усы простираются до минимальной и максимальной точек данных. Среднее значение и медиана обозначаются знаком «+» и горизонтальными линиями соответственно. Процент смертности индивидуума (N) показан в виде кругов. N = 3-4 флакона по 20-50 мух/флакон. P-значение для обычной односторонней ANOVA; p = 0,012 указывает на существенную разницу между средними значениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативный пример 2 (рис. 3): Иллюстрация высокопроизводительного применения SAA для выявления влияния генетического фона на фармакодинамику изофлурана
В качестве примера высокой пропускной способности системы на рисунке 3 показаны эффекты идентичного воздействия изофлурана (15 мин 2% изофлурана) до черепно-мозговой травмы (ЧМТ)16, протокол тестирования предварительного кондиционирования анестетика (АП) в этой моделимухи 13,15,19. Показания - смертность через 24 ч после ЧМТ с поправкой на естественное истощение (ИМ24). В этой модели все мухи восстановили подвижность (т.е. были живы) в течение 30 минут после ЧМТ, а смертность, зарегистрированная в MI24, была результатом вторичной черепно-мозговой травмы (sBI). В четырех линиях мух АР с изофлураном снижал ИМ24 в разной степени, что указывает на то, что реакция на АП является количественным признаком. Поскольку воспалительная реакция является важным фактором заболеваемости от sBI, AP может включать модуляцию иммунной системы20.

Рисунок 3: Влияние генетического фона на подавление смертности (ИМ24) путем прекондиционирования изофлураном. Предварительное кондиционирование мух с 15 мин 2% изофлурана (фиолетового) снижало индекс смертности через 24 ч (MI24) у штаммов w 1118 и y1w1118 (p < 0,0001 и p = 0,036 соответственно ). MI24 не был значительно ниже в предварительно подготовленных линиях Oregon R (OR) и Canton S (CS) (p = 0,16 и p = 0,27 соответственно ). Данные отображаются в виде прямоугольных и усовых графиков. Прямоугольники представляют собой второй и третий квартили данных, а усы простираются до минимальной и максимальной точек данных. Среднее значение и медиана обозначаются знаком «+» и горизонтальными линиями соответственно. Значения MI24 отдельных реплик (N) показаны в виде кругов. N = 15-33 флакона по 30-40 мух/флакон для мух, обработанных ЧМТ. N = 2-15 флаконов по 30-40 мух/флакон для необработанного контроля. P-значения из непарного двустороннего t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.