Method Article

Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

DOI:

10.3791/65145

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами1. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопроте....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса

  1. Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NT
    1. Разморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин.
    2. Как только весь лед растает, аккуратно и осторожно перемешайте пипеткой 50 мкл клеток в трансформационную пробирку на льду.
    3. Добавьте в клеточную смесь 5 мкл, содержащих 50 нг плазмидной ДНК (последовательность см. в дополнительной таблице 1). Осторожно переверните тюбик четыре или пять раз, чтобы перемешать. Не вихревые.
    4. Поместите смесь на лед на 30 минут.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществами
В описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образовались нанодиски и что биологически активный агент был растворен. Часто биологически активные агенты поглощают свет в видимой области длин волн (например, ampB, куркумин, лютеин, коэнзим Q10), и в этих случа.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки широкого спектра гидрофобных молекул (таблица 1). К ним относятся малые молекулы, натуральные и синтетические препараты, фитонутриенты, гормоны и т.д. Стратегия составления рецептуры обычно следует стандартному протоколу, который.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R37 HL-64159).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Амфотерицин BCayman Chemical Company11636ND Состав & Стандартный препарат
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Расширение
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/AПреобразование
Перегородка КолбаНью-Брансуик ScientificН/ДРасширение & Экспрессия
BL21 компетентная E. coliNew England BiolabsC2527IТрансформационная
центрифуга флаконыNalgene3140-0250Экспрессия
хлороформаFisher ScientificG607-4ND Формула
DMSOSigma Aldrich472301Стандартная препартация
ДимиристоилфосфатидилхолинAvanti липиды850345PND Рецептура
колбы ЭрленмейераBellco BiotechnologyN/AExpansion & Экспрессия
Сокол ТубыSarstedt Ag & CoD51588Анализ жизнеспособности дрожжей
Стеклоборосиликатные трубкиVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (программное обеспечение)DotmaticsN/AАнализ жизнеспособности дрожжей
Подогреваемая ультразвуковая ваннаVWRN/AND Formulaton
Модуль нагрева и азотаThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Гепарин HP (5 мл)GE Healthcare17-0407-03Очистка
изопропила &бета;-D-1-тиогалактопиранизид Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14Rotor Beckman Coulter339247Экспрессия
ЛиофилизаторLabconco7755030ND Состав
МетанолFisher ScientificA452-4ND Состав
Газообразный азотPraxairUN1066ND Рецептура
NZCYM средаRPI Research ProductsN7200-1000.0Расширение и Экспрессия
Pet-22B векторGenScriptN/AТрансформация
чашка ПетриFisher ScientificFB0875718Transformation &
Расширение кварцевых кюветокFisher Brand14385 928AСпектральный анализ
Встряхивающий инкубаторНью-Брансуик ScientificM1344-0004Трансформация, расширение и Экспрессия
Slide-A-Lyzer БуиThermo Scientific66430Очистка
Диализная трубкаSnakeSkin Thermo Scientific68100Очистка
Диализная трубкаSnakeSkin Thermo Scientific88243Очистка
хлорида натрияFisher ScientificS271Очистка
двухосновногофосфата натрияFisher ScientificS374-500Очистка
Одноосновной фосфатнатрия Fisher ScientificBP329-500Спектры очистки
/POR взвешенные закрытияСпектр Медицинская промышленность132736Спектрометр
очистки Shimadzu UV-1800220-92961-01спектральный анализ
Настольная центрифугаBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Программное обеспечение)ShimadzuN/AСпектральный анализ
Вакуумный фильтрMillipore9004-70-0Экспрессия и Очистительный
вакуумный насосGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Очистка
VortexFisher Scientific12-812ND Формула
ДрожжиН/ДBY4741Анализ жизнеспособности дрожжей
Экстракт-пептон-декстрозаBD242820Анализ жизнеспособности дрожжей

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanodisk FormulationBioactive NanodisksAmphotericin B NanodisksScaffold ProteinLipid Bilayer NanoparticlesDrug Delivery NanodisksUV Visible SpectroscopyDialysis TubingYeast Growth InhibitionHydrophobic Bioactive Agents

Related Articles