Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание устройства для депривации сна у мышей

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65157

⸱

22 сентября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описывается метод создания экономически эффективного устройства на основе платформы Rocker, используемого для индуцирования депривации сна у мышей. Это устройство доказало свою эффективность в вызывании нарушений в режиме сна, подтвержденном электроэнцефалограммой (ЭЭГ), а также в индуцировании метаболических и молекулярных изменений, связанных с депривацией сна.

Аннотация

Нарушение циркадного ритма относится к рассинхронизации между внешней средой или поведением и эндогенными молекулярными часами, что значительно ухудшает здоровье. Недосыпание является одной из наиболее распространенных причин нарушения циркадного ритма. Сообщалось о различных способах (например, платформы на воде, мягкое обращение, скользящие стержневые камеры, вращающиеся барабаны, орбитальные шейкеры и т. д.) для индуцирования депривации сна у мышей, чтобы исследовать его влияние на здоровье. В настоящем исследовании представлен альтернативный метод депривации сна у мышей. Было разработано автоматизированное устройство на основе платформы коромысел, которое является экономичным и эффективно нарушает сон у мышей, содержащихся в группе, через регулируемые промежутки времени. Это устройство вызывает характерные изменения недосыпания с минимальной реакцией на стресс. Следовательно, этот метод может оказаться полезным для исследователей, заинтересованных в изучении влияния и лежащих в их основе механизмов депривации сна на патогенез многих заболеваний. Кроме того, это экономичное решение, особенно когда требуется параллельная работа нескольких устройств для лишения сна.

Введение

Нарушение циркадного ритма относится к рассинхронизации между внешней средой или поведением и эндогенными биологическими часами. Одной из наиболее распространенных причин нарушения циркадного ритма является недостатоксна1. Недосыпание не только негативно сказывается на здоровье человека, но и значительно повышает риск многих заболеваний, в том числерака2 и сердечно-сосудистыхзаболеваний3. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе пагубных последствий лишения сна, остаются в значительной степени неизвестными, и создание моделей депривации сна имеет важное значение для улучшения нашего понимания в этом отношении.

Сообщалось о различных методах депривации сна у мышей, таких как использование водных платформ4, бережное обращение5, скользящие стержневые камеры6, вращающиеся барабаны7 и протоколы перемешивания клеток 5,8,9. Раздвижные стержневые камеры автоматически перемещают прутья по дну клетки, заставляя мышей ходить по ним и бодрствовать. Протоколы перемешивания в клетке включают размещение клеток на лабораторных орбитальных шейкерах, что приводит к эффективному нарушению сна. Несмотря на то, что эти методы являются автоматическими и эффективными, они могут быть дорогостоящими, когда требуется параллельная работа нескольких устройств, особенно для конкретных исследований, в которых участвует большое количество мышей, лишенных сна, необходимых для профилирования циркадных генов. С другой стороны, водные платформы и протоколы бережного обращения являются более дешевыми и простыми методами, обычно используемыми для того, чтобы вызвать лишение сна. Тем не менее, водная платформа не позволяет автоматически контролировать заранее заданные циклы депривации-отдыха10,11, и бережное обращение требует от исследователей постоянной бдительности, чтобы нарушить сон. Кроме того, другие модальности, такие как вращающиеся барабаны, могут быть искажены социальной изоляциейили стрессом.

Вдохновленные орбитальным встряхивающим методом, мы стремимся внедрить протокол для создания устройства на основе рокера для депривации сна у мышей. Этот метод дешевый, эффективный, минимально стрессовый, контролируемый и автоматизированный. Нынешний протокол позволяет создать устройство на базе рокеровой платформы по стоимости примерно в десять раз дешевле, чем у орбитальных шейкеров, исходя из нашей доступности. Это устройство эффективно нарушало сон у мышей, содержащихся в группах, и вызывало характерные изменения депривации сна с минимальной реакцией на стресс. Она будет особенно полезна исследователям, заинтересованным в изучении влияния и лежащих в ее основе механизмов депривации сна на патогенез множественных заболеваний, особенно когда исследование включает в себя параллельную депривацию сна в нескольких группах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы экспериментов на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по этике благополучия лабораторных животных больницы Жэньцзи, Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун. В исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Основные компоненты, необходимые для установки устройства, перечислены на рисунке 1A.

1. Подготовка устройства для депривации сна

  1. Закрепите один конец стального швеллера с прорезями диаметром 50 см в середине стального швеллера с прорезями диаметром 40 см с помощью винтов (см. Таблицу материалов), чтобы получилась Т-образная конструкция; повторить процесс и сделать две такие Т-образные конструкции (рисунок 1Б-а).
  2. Сделайте так, чтобы две Т-образные конструкции стояли параллельно вверх на расстоянии 30 см друг от друга, и соедините нижнюю часть двух Т-образных конструкций с помощью 30-сантиметрового стального цилиндра, совместимого с винтами (см. Таблицу материалов) с помощью винтов (Рисунок 1B-b).
  3. Поместите стальную прямоугольную платформу (20 × 25 см) (см. Таблицу материалов) между двумя Т-образными конструкциями (Рисунок 1B-c).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если готовые стальные прямоугольные платформы указанного размера недоступны, их можно изготовить путем сварки плоских сталей толщиной 2 мм.
  4. Закрепите каждый конец 30-сантиметрового совместимого с винтом стального цилиндра, прикрепленного к платформе, к двум подшипникам, закрепленным на каждой из Т-образных конструкций на расстоянии 10 см вниз от верха (рис. 1B-d).
  5. Закрепите крепление двигателя (см. Таблицу материалов) на одной из Т-образных конструкций на расстоянии 25 см сверху с помощью винтов (рис. 1B-e).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать строительный клей для крепления опоры двигателя на Т-образной конструкции вместо экипажей.
  6. Установите двигатель (см. Таблицу материалов) на опору двигателя с помощью винтов (Рисунок 1B-f).
  7. Закрепите вентилятор охлаждения (см. Таблицу материалов) с помощью самоблокирующихся лент на Т-образной конструкции под двигателем (Рисунок 1B-g).
  8. Прикрепите подшипниковый конец шатуна к углу платформы, обращенному к двигателю, с помощью винтов (Рисунок 1B-h).
  9. Закрепите другой конец шатуна на валу двигателя с помощью винтов (рисунок 1B-i).
  10. Просверлите два отверстия диаметром 4 мм в каждом из четырех углов пластикового контейнера или стандартной клетки для животных (см. Таблицу материалов) с помощью электрической дрели и просверлите два отверстия диаметром 4 мм и нижнее отверстие диаметром 6 мм с левой стороны клетки (Рисунок 1B-j).
  11. Закрепите клетку на прямоугольной платформе самоблокирующимися лентами через угловые отверстия (рисунок 1B-k).
  12. Просверлите отверстие диаметром 5 мм в крышке центрифужной пробирки объемом 50 мл с помощью электродрели и заткните отверстие длинной насадкой, оснащенной шаровым краном, чтобы предотвратить утечку воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель будет альтернативным вариантом для водоснабжения, если изготовление бутылок для воды по индивидуальному заказу затруднено.
  13. Закрепите индивидуальную бутылку с водой с левой стороны клетки с помощью самоблокирующихся лент через два отверстия диаметром 4 мм, при этом сопло проходит через отверстие диаметром 6 мм (рис. 1B-l).
  14. Подсоедините выходные электрические провода адаптера блока питания к двум клеммам двигателя (рисунок 1B-l).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подключения проводов к клеммам двигателя нет особых требований к полярности.
  15. Подсоедините входные электрические провода адаптера блока питания к контактору времени (рис. 1B-m).

2. Индукция депривации сна

  1. Нажимайте крайние правые кнопки со знаком «плюс» на левой и правой половинах контактора времени (см. Таблицу материалов) соответственно до тех пор, пока на механических счетчиках с обеих сторон не появится «М» (рис. 1C-a).
  2. Нажимайте средние кнопки со знаком плюс на левой и правой половинах контактора времени до тех пор, пока на механических счетчиках с обеих сторон не появится «5M» (рис. 1C-b).
  3. Нажимайте крайнюю левую кнопку со знаком «плюс» на левой половине контактора до тех пор, пока на левом механическом счетчике не появится «15M» (рис. 1C-c).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затем контактор времени будет включен в течение 15 минут и выключен в течение 5 минут в циклическом режиме.
  4. Помещайте мышей в клетку с водой и едой вволю.
  5. Подайте питание на контактор времени и вентилятор охлаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь платформа будет раскачиваться со скоростью 10 оборотов в минуту.
  6. Взвешивайте каждую мышь по времени Zeitgeber 0 (ZT0) каждый день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свет горит с 8 утра (ZT0) до 8 вечера (ZT12).

3. Пероральный глюкозотолерантный тест

  1. Измерьте уровень глюкозы натощак у голодных мышей, взяв кровь из хвостовых вен.
  2. Ввести раствор глюкозы каждой мыши (2 г/кг массы тела) внутрибрюшинно с помощью шприцев по 1 мл.
  3. Соберите образцы крови через хвостовую вену и проверьте уровень глюкозы в крови через 15 мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин после инъекции глюкозы соответственно.
  4. Поместите мышей обратно в клетку с едой и водой вволю после теста.

4. Забор мозговых тканей

  1. Обезглавливайте мышей после адекватной анестезии, подвергая их воздействию изофлурана (2%) в течение 3-5 минут.
  2. Обнажите череп и сделайте вертикальный надрез на черепе диаметром 1 см хирургическими ножницами.
  3. Удалите череп с помощью комарных гемостатов (см. Таблицу материалов), чтобы обнажить мозговую ткань.
  4. Аккуратно извлеките весь мозг из полости черепа с помощью изогнутого пинцета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозговая ткань должна быть удалена в соответствии с местными правилами.
  5. Промойте ткани мозга с помощью холодного фосфатного солевого раствора (1x PBS, 4 °C).
  6. Snap заморозьте неповрежденную ткань мозга в жидком азоте и перенесите ткань до -80 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80°C замороженная ткань мозга стабильна в течение не менее 6 месяцев.

5. Определение экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  1. Разморозьте ткани мозга при 4 °C или на льду.
  2. Перенесите ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и извлеките общую РНК с помощью метода13 на основе TRIzol.
  3. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (см. таблицу материалов) после экстракции РНК.
  4. Выполните обратную транскрипцию общей РНК (1 мкг) в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью коммерческого набора14.
  5. Измерение уровней экспрессии генов с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Установленное устройство для депривации сна у мышей показано на рисунке 1D. На 7-й день после начала депривации сна электроэнцефалограмма (ЭЭГ) и электромиография (ЭМГ)16 показали, что устройство значительно сокращает продолжительность сна и увеличивает продолжительность бодрствования у мышей (рис. 2A-D). Между тем, текущий протокол значительно увеличил накопление аденозина и уровни мРНК Homer1a ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышиные модели депривации сна необходимы для изучения влияния нарушения сна на различные заболевания, включая сердечно-сосудистые заболевания21, психические состояния22 и неврологические расстройства23. Среди существующих стратегий лишения сна у мышей наиболее часто используются физические подходы, которые включают повторяющееся кратковременное прерывание сна 5,7,12

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82230014, 81930007, 82270342), Шанхайской программы выдающихся академических лидеров (18XD1402400), Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), Шанхайской программы талантов Пуцзян (2020PJD030), SHWSRS (2023-62), Шанхайского центра клинических исследований старения и медицины (19MC1910500) и Программы последипломных инноваций Медицинского колледжа Бенбу (byycxz21075).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 млAxygenMCT-150-C-S
Центрифуга объемом 50 мл ЦентрифугаNEST602002
Набор для ИФА с аденозином ТехнологияRuifan технологияRF8885
Клетка для животныхZeYa techMJ2
ГлюкометрYuYue580
C57BL/6J МышиJieSiJie Лабораторное животноеН/ДВозраст: 8-10 недель
ШатунShengXiang TechН/ДДлина:  20 см
Вентиляторохлаждения LiMingEFB0805VHНапряжение питания: 5 В; Потребляемая мощность: 1,2 Вт; Расход воздуха: 26,92 куб. футов в минуту; Размеры: 40 мм * 40 мм * 56 мм
Кортикостерон ИФА наборElabscienceE-OSEL-M0001
Система регистрации и анализа ЭЭГ/ЭМГPinnacle Technology8200-K1-iSE3
ИзофлуранRWD20071302
комаров гемостатикиFST13011-12Хирургический инструмент
Мотор и моторное креплениеMingYangMY36GP-555Напряжение питания: 24 В постоянного тока; Диаметр вала: 8 мм; Максимальный выходной крутящий момент: 100 Kgf.cm; Максимальная выходная скорость: 10 об/мин
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Адаптер блока питанияMingYangQiYe-0243Входное напряжение: 110-220 В переменного тока; Выходное напряжение: 24 В постоянного тока; Выходной ток: 2 А; Длина кабеля: 2 м
Коммерческий набор для количественной ПЦРVazymeQ711-02
Измерительное оборудование для количественной ПЦРПлатформа Roche480
Прямоугольная платформа, прикрепленная к стальному цилиндру, совместимому с винтамиИндивидуальныйН/ДШирина: 20 см; длина: 25 см; длина цилиндра: 30 см, толщина: 2 мм
Коммерческий набор с обратной РНК в кДНКVazymeR323-01
Винт и гайкаGuwanjiN/AВнутренний диаметр: 6 мм, 12 мм
Совместимый с винтом стальной цилиндрИндивидуальныйН/ДДлина: 300 мм
Шлицевые стальные каналыИндивидуальныйН/ДДлина: 400 мм или 500 мм, толщина: 2 мм
Временной контакторLiXiangDH48S-SНапряжение питания: 110-220 В переменного тока; Измеряемые единицы: часы, минуты, секунды; Контактная конфигурация: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

Ссылки

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292(2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90(2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35(2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559(2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430(2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017(2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Создание устройства для депривации сна у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.