$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Трансплантатные патогены цитрусовых, ограниченные флоэмой, такие как вироиды, вирусы и бактерии, вызвали разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всех регионах мира, производящих цитрусовые. Цитрусовые вироиды являются ограничивающими факторами производства из-за болезней экзокортиса и кахексии, которые они вызывают у экономически важных видов цитрусовых, таких как тройчатые, трехлистные гибриды, мандарины, клементины и мандарины 1,2,3. В Калифорнии эти чувствительные к вироидам виды цитрусовых являются основой растущего и прибыльного рынка «легких очистителей», следуя меняющейся тенденции в предпочтениях потребителей к фруктам, которые легко очищаются от кожуры, сегментированы и не содержат косточек 4,5,6. Таким образом, вироиды цитрусовых регулируются в соответствии с Программой чистоты вредителей Сената 140 Департамента продовольствия и сельского хозяйства Калифорнии (CDFA), а лаборатории Отдела диагностики вредителей растений CDFA ежегодно проводят тысячи тестов на вироиды цитрусовых 7,8,9,10 . Вирус цитрусовых тристеза (CTV) стал причиной гибели более 100 миллионов цитрусовых деревьев с начала глобальной эпидемии в 1930-х годах: 3,9,10,11. В Калифорнии изоляты вируса, вызывающие точечную коррозию стеблей и разрыв тройчатых слоев, представляют серьезную угрозу для калифорнийской цитрусовой промышленности стоимостью 3,6 миллиарда долларов 12,13,14. Следовательно, CDFA классифицирует CTV как регулируемый вредитель растений класса А, а лаборатория Агентства по искоренению тристезы в Центральной Калифорнии (CCTEA) ежегодно проводит обширные полевые исследования и тысячи тестов на вирусы. Бактерия "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) и болезнь хуанлунбин (HLB), по оценкам, нанесли экономический ущерб Флориде на сумму около 9 миллиардов долларов в результате сокращения посевных площадей цитрусовых на 40%, сокращения производства цитрусовых на 57% и потери почти 8000рабочих мест. В Калифорнии гипотетическое сокращение посевных площадей цитрусовых на 20% из-за ГЛБ, по прогнозам, приведет к потере более 8200 рабочих мест и сокращению валового внутреннего продукта штата более чем на полмиллиарда долларов. Таким образом, Программа профилактики вредителей и болезней цитрусовых ежегодно тратит более 40 миллионов долларов на исследования по тестированию, выявлению и искоренению CLas в Калифорнии14,17,19,20.
Ключевым элементом борьбы с вироидами, вирусами и бактериями цитрусовых является использование для выращивания деревьев проверенных патогенами материалов для размножения (например, бутонов). Цитрусовые почки, проверенные на патогены, выращиваются и поддерживаются в рамках комплексных карантинных программ, в которых используются передовые методы уничтожения и обнаружения патогенов10,21. Программа защиты клональных пород цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде ежегодно тестирует тысячи образцов почек из сортов цитрусовых, недавно импортированных в штат и США, а также исходных деревьев цитрусовых, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые и поддержать функции Национальной сети чистых растений для цитрусовых10,17,22. Для обработки больших объемов тестирования цитрусовых высокопроизводительные, надежные и экономичные анализы для обнаружения патогенов являются фундаментальным компонентом успеха таких программ, как CCPP 7,10,22.
В то время как молекулярные методы обнаружения патогенов, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволили значительно увеличить пропускную способность лабораторий по диагностике растений, по нашему опыту, одним из наиболее критических узких мест при внедрении высокопроизводительных протоколов является этап обработки образцов растительных тканей. Это особенно актуально для цитрусовых, поскольку доступные в настоящее время протоколы обработки богатых флоэмой тканей, таких как черешки листьев и кора почек, являются трудоемкими, длительными и требуют дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. Эти протоколы требуют ручного измельчения, взвешивания, сублимационной сушки, измельчения и центрифугирования при низких температурах, чтобы избежать разложения нуклеиновых кислот 8,23,24. Например, в диагностической лаборатории CCPP обработка проб включает в себя (i) ручное измельчение (6-9 проб/ч на оператора), (ii) сублимационную сушку (16-24 ч), (iii) измельчение (30-60 с) и (iv) центрифугирование (1-2 ч). Этот процесс также требует специализированных расходных материалов (например, сверхпрочных трубок с предохранительным замком, мелющих шаров из нержавеющей стали, адаптеров, лезвий, перчаток) и нескольких единиц дорогостоящего лабораторного оборудования (например, морозильной камеры со сверхнизкой температурой, сублимационной сушилки, измельчителя тканей, криостанции жидкого азота, охлаждаемой центрифуги).
Как и в любой отрасли, проектирование оборудования и автоматизация процессов являются ключом к снижению затрат, увеличению производительности и обеспечению высококачественных, однородных продуктов и услуг. Цитрусовая промышленность нуждается в недорогих инструментах для обработки тканей, которые требуют минимальных навыков для работы и, как таковые, легко переносятся в диагностические лаборатории и полевые операции, чтобы обеспечить высокую производительность обработки образцов для быстрого обнаружения патогенов. Technology Evolving Solutions (TES) и CCPP разработали (т.е. спроектировали и изготовили) и валидировали (т.е. протестировали на образцах цитрусовых и сравнили со стандартными лабораторными процедурами) недорогой (т.е. устранил необходимость в специализированном лабораторном оборудовании) прибор для быстрой обработки богатых флоэмой тканей цитрусовых (т.е. бутонов), названный экстрактором тканей бутонов (BTE). Как видно на рисунке 1, BTE включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры с цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, содержащий буфер для экстракции, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без какой-либо дополнительной обработки или подготовки (рисунок 1). Система BTE также включает в себя безбумажное приложение для отслеживания образцов и интегрированное приложение для взвешивания, которые записывают информацию об обработке образца в онлайн-базу данных в режиме реального времени.
Система BTE увеличила возможности лабораторной диагностики CCPP более чем на 100% и обеспечивает стабильное производство экстрактов тканей цитрусовых, подходящих для очистки высококачественных нуклеиновых кислот и последующего обнаружения трансплантатных патогенов цитрусовых с помощью ПЦР-анализов. В частности, BTE сократила время обработки тканей с более чем 24 часов до ~3 минут на образец, заменила лабораторные инструменты стоимостью более 60 000 долларов США (рис. 2, шаги 2-4) и позволила обрабатывать образцы большего размера.
В этом документе представлены данные о высокопроизводительной обработке тканей коры цитрусовых, экстракции нуклеиновых кислот и валидации обнаружения патогенов с образцами цитрусовых почек с исходных деревьев, включая все соответствующие положительные и отрицательные контрольные данные карантинного центра CCPP Rubidoux и Фонда Lindcove, соответственно. Мы также представляем изменения производительности и времени обработки по сравнению с текущей лабораторной процедурой (рис. 2). Кроме того, в этой работе представлен подробный, пошаговый протокол для лабораторий по тестированию на патогены цитрусовых и показано, как BTE может поддерживать функции чистого от патогенов питомника, программ обследования и уничтожения.
Рисунок 1: Экстрактор тканей Budwood. Заушная труба включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без каких-либо дополнительных манипуляций или подготовки. Аббревиатура: BTE = экстрактор тканей из бутонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пошаговое сравнение между традиционной лабораторной процедурой ручного измельчения и заушной обработкой. Заушная обработка включает в себя высокопроизводительную обработку тканей коры цитрусовых, экстракцию нуклеиновых кислот и обнаружение патогенов. В скобках указано время каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.