Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммуноцитохимическая визуализация белков из клеток цианобактерий с высокой аутофлуоресценцией фикоэритрина и фикурубилина

703 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65168

⸱

15 сентября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, The Czech Academy of Sciences, 2Japan Fisheries Research and Education Agency, 3National Marine Fisheries Research Institute, 4Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает визуализацию и количественную оценку определенного белка в клетках на клеточном уровне для цианобактерии, содержащей фикоэритрин, Crocosphaera watsonii.

Аннотация

Представлен протокол визуализации и количественного определения специфического белка в клетках на клеточном уровне для морской цианобактерии Crocosphaera watsonii, важнейшей первичной продуценты и фиксатора азота в олиготрофных океанах. Одной из проблем для морских автотрофных фиксаторов N2 (диазотрофов) является различение сигналов флуоресценции, полученных от зондов, от автофлуоресценции. C. watsonii был выбран для представления хлорофилл-, фикоэритрин- и фикуробилин-содержащих цианобактерий. Протокол позволяет проводить простую и полуколичественную визуализацию белков C. watsonii на уровне одной клетки, что позволяет исследовать производство белка в различных условиях окружающей среды для оценки метаболической активности целевых цианобактерий. Кроме того, методы фиксации и пермеабилизации оптимизированы для усиления сигналов флуоресценции от белков-мишеней, чтобы отличить их от автофлуоресценции, особенно от фикоэритрина и фикурубилина. Усиленный сигнал может быть визуализирован с помощью конфокальной или широкопольной флуоресцентной микроскопии. Кроме того, интенсивность флуоресценции была полуколичественно определена с помощью программного обеспечения Фиджи. Этот рабочий процесс анализа отдельных клеток позволяет оценить межклеточные вариации содержания определенного белка. Протокол может быть выполнен в любой медико-биологической лаборатории, так как для него требуется только стандартное оборудование, а также он может быть легко адаптирован к другим фикоэритрин-содержащим клеткам цианобактерий.

Введение

Физиологические вариации от клетки к клетке (обычно называемые «гетерогенностью») метаболической активности микроорганизмов, включая цианобактерии, были задокументированы в исследованиях клонированных культур 1,2,3,4. Эта гетерогенность охватывает различные метаболические активности, такие как деление клеток5, ассимиляция углерода 6,7,8 и усвоение азота 9,10. Например, недавние исследования показали, что активность фиксацииN2 у колониальных цианобактерий C. watsonii и C. subtropica (Cyanothece) проявляет изменчивость на уровне отдельных клеток, присутствуя в субпопуляциях клеток и отсутствуя в других в сообществе. Примечательно, что поглощение азота или активность фиксацииN2 также демонстрируют вариабельность среди клеток in situ 11,12,13. Эти результаты были подтверждены анализами стабильных изотопов 15N, проведенными с помощью масс-спектрометров изотопных отношений (NanoSIMS)14,15. Однако, несмотря на то, что NanoSIMS предлагает новый способ анализа изотопного состава на уровне отдельных клеток, его использование остается ограниченным из-за его технической сложности и стоимости.

Альтернативным подходом к наблюдению внутриклеточной гетерогенности метаболической активности является иммунодетекция. Более ранние отчеты продемонстрировали иммунообнаружение нитрогеназы в отдельных клетках, но это создает проблемы из-за автофлуоресценции, испускаемой их фотосинтетическими пигментами 16,17,18. Морские цианобактерии, особенно приспособленные к океаническим водам, такие как основные океанические диазотрофы C. watsonii и Trichodesmium, содержат значительное количество фикобилинов, которые излучают автофлуоресценцию в более коротких волнах: фикоэритрин и фикуробилин19. Чтобы обойти эту автофлуоресценцию, для исследований цианобактерий предпочтение отдавалось флюорохромам, излучающим синий цвет, с возбуждением ультрафиолетом 16,20,21. Тем не менее, эта стратегия не всегда приносила успех, так как клетки, обработанные исключительно первичными антителами, излучали сильную синюю или голубовато-желтую автофлуоресценцию под воздействием ультрафиолета20,21. Были предприняты усилия по смягчению этой проблемы путем воздействия на клетки синего или ультрафиолетового света перед наблюдением и использования полупроводниковыхнанокристаллов22. В настоящем исследовании используется другая стратегия, которая усиливает сигналы флуоресценции белков с использованием системы усиления сигнала тирамида (TSA) для визуализации белков с низким содержанием клеток.

TSA, также известный как катализированное репортерное осаждение (CARD), является высокочувствительным ферментативным методом, позволяющим обнаруживать мишени с низким содержанием в иммуноцитохимии. Этот метод использует каталитическую активность пероксидазы для ковалентного осаждения меченого тирамида в непосредственной близости от целевых белков in situ 23,24. В присутствии перекиси водорода пероксидаза катализирует окислительную конденсацию тирамида в реакционноспособные радикалы тирамида, которые затем связываются с богатыми электронами фрагментами, такими как тирозин, фенилаланин и триптофан25. Это усиливает сигнал до 10-200 раз по сравнению со стандартными методами, что делает сигнал обнаруживаемым с помощью стандартных хромогенных или флуоресцентных методов. Следовательно, этот метод способствует быстрой и одновременной оценке нескольких белков наряду с фенотипическими маркерами в гетерогенных популяциях и редких подмножествах клеток. Примечательно, что на данный момент объединение систем иммуномаркировки и TSA для цианобактерий ограничено одним исследованием, в котором визуализировался сакситоксин у Cylindrospermopsis raciborskii26.

Описанный здесь метод позволяет исследовать продукцию белка в различных условиях окружающей среды на уровне отдельных клеток, что позволяет оценить метаболическую активность в целевых цианобактериях. Доступность цельноклеточного иммунофлуоресцентного обнаружения белка позволяет быстро и полуколичественно визуализировать белки C. watsonii на уровне отдельных клеток. Более того, этот метод может быть легко адаптирован для использования с другими клетками цианобактерий, содержащими фикурубилин и фикоэритрин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование цианобактерий

  1. Культивируйте клетки Crocosphaera watsonii PS0609 в колбах Эрленмейера или фотобиореакторах в среде YBCII27. Чтобы определить плотность культуры, измерьте плотность клеток с помощью выбранного метода (например, микроскопия, проточная цитометрия, счетчик клеток и т. д.).
  2. Поддерживайте плотность клеток в диапазоне от ~1 × 104 до ~5 × 106 клеток мл-1.

2. Приготовление реагентов

  1. Хранить 100% метанол при температуре -20 °C.
  2. Фосфатно-солевой буфер (PBS): Растворите 1,36 г KH2PO4, 1,42 г Na2HPO4, 8,0 г NaCl и 0,224 г KCl в 0,8 л дистиллированной воды, заполните до 1 л, отрегулируйте pH на уровне 7,4 и автоклавируйте (см. Таблицу материалов).
  3. 1% параформальдегида (PFA) в PBS
    1. Добавьте 50 мл PBS в стеклянный стакан на перемешивающей плите в вентилируемой вытяжке, нагрейте его до 60 °C и перемешайте с помощью мешалки.
    2. В подогретый раствор PBS введите 0,5 г порошка параформальдегида. Постепенно повышайте pH, подавая 1 N NaOH из пипетки до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.После того как параформальдегид полностью растворится, понизьте температуру и приступайте к фильтрации раствора.
    3. Отрегулируйте объем раствора до 40 мл с помощью PBS. Отрегулируйте pH с помощью небольшого количества разбавленного HCl примерно до 6,9. Хранить раствор при температуре -20 °C.
  4. Блокирующий раствор ПБГ (0,2% желатин + 0,5% бычий сывороточный альбумин; BSA, см. Таблицу материалов)
    1. Растворите 0,2 г желатина и 0,5 г BSA в 100 мл PBS в стеклянной мензуре объемом 200 мл. Нагрейте смесь до 60 °C и перемешайте. Затем переложите его в пробирку объемом 15 мл и храните при температуре -20 °C.
  5. 0,2% Triton X-100 в PBS: добавьте 20 мкл Triton X-100 в 10 мл PBS. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
  6. 0,5 М ЭДТА: Растворите 1,46 г ЭДТА в 10 мл дистиллированной воды (DW) и отрегулируйте pH до 8,0 (ЭДТА не растворится при pH < 8,0). Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
  7. 1 M Tris HCl: Растворите 1,58 г Tris HCl в 10 мл DW и отрегулируйте pH до 8,0. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
  8. 50 мМ Tris HCl: Растворите 0,079 г Tris HCl в 10 мл DW и отрегулируйте pH до 7,0. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
  9. Добавьте 10 мг/мл лизоцима: добавьте 100 мг лизоцима, 1 мл 0,5 M EDTA (pH 8) и 1 мл 1 M Tris HCl (pH 8). Добавьте DW до 10 мл в пробирку объемом 15 мл. Приготовьте его свежим в день использования.
  10. 10 000 ЕД/мл ахромопептидазы: Растворите 0,011 г 900 ЕД/мг ахромопептидазы (см. Таблицу материалов) до 1 мл DW, хорошо перемешайте и сохраните при -20 °C.
  11. Рабочий раствор ахромопептидазы 60 ЕД/мл: Добавьте 3 мкл 10 000 ЕД/мл ахромопептидазы в 0,5 мл 50 мМ Tris HCl. Приготовьте его свежим в день использования.
  12. Приготовьте 100-кратный стоковый раствор тирамида: растворите реагент тирамида в 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Хранить при температуре 2-8 °C до 6 месяцев.
  13. 1x Реакционный буфер: Добавьте 1 каплю 20x Реакционного буфера в 1 мл DW. Его можно заменить на буфер Tris, pH 7,4.
  14. Реагентные растворы для остановки реакции
    1. Исходный раствор реагента Reaction stop: Добавьте 1,45 мл 95% этанола в один флакон реагента Reaction stop, содержащегося в наборе для усиления сигнала тирамида (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре -20 °C в течение 6 месяцев
    2. Рабочий раствор реагента остановки реакции: развести стоковый раствор реагента (1:11) в PBS. Приготовьте его свежим в день использования.
  15. 100x H2O2 раствор: Добавьте 1 каплю (около 50 мкл) H2O2 в 1 мл DW. Приготовьте его свежим в день использования.
  16. Рабочий раствор тирамида (для конечного объема 510 мкл): Добавьте 5 мкл 100-кратного стокового раствора тирамида, 5 μЛ 100-кратного раствора H2O2 и 500 μЛ 1x Реакционного буфера в 1,5 мл пробирки в указанном порядке и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Приготовьте его свежим в день использования.

3. Сборочные клетки

  1. Соберите 10 мл культуры C. watsonii в пробирку объемом 15 мл, соберите клетки центрифугированием при 5500 × г при 4 °C в течение 8 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Держите образцы на льду между процедурами.
  2. Повторно суспендируйте гранулу с оставшимся надосадочным веществом, переложите ресуспендированный подобразец в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте в промывку 1 мл PBS. Соберите клетки центрифугированием (5 500 × г, 4 °C, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.

4. Фиксация и консервация клеток

  1. Добавьте 1 мл 1% раствора PFA и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
  2. Центрифугируйте клетки при 5 500 × г, 4 °C, 5 минут, удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный контейнер для химических отходов, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте его.
  3. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее. Добавьте 1 мл 100% метанола (при температуре -20 °C) и повторно суспендируйте с помощью вихревого смесителя. Подобразцы выдерживают при температуре -20 °C от 15 минут до ночи.

5. Пермеабилизация и блокировка

  1. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость (метанол) с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный для этого контейнер для химических отходов, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте.
  2. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость пипеткой и выбросьте ее, добавьте 1 мл 0,2% Triton X-100 и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость Triton X-100 пипеткой и выбросьте ее, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте.
  4. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 0,5 мл лизоцима (см. Таблицу материалов) и 0,5 мл PBG (шаг 2,4) и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C.
  5. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный для этого мусорный бак, добавьте 0,5 мл 60 единиц ахромопептидазы (шаг 2,10) и 0,5 мл PBG и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
  6. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость из ахромопептидазы с помощью пипетки, выбросьте ее в предназначенный для этого мусорный бак и добавьте необходимое количество PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество должно определяться количеством подобразцов, которые необходимо исследовать (один подобразец составляет 90 мкл для круга диаметром ~2 см). Убедитесь, что вы подготовили отрицательный контроль; без1-го и2-го антитела, а также без1-го антитела.

6. Подготовка образцов к визуализации

  1. Поместите образцы на предметное стекло и добавьте 1-е антитело28.
    1. Нарисуйте два круга диаметром около ~2 см на стекле с полилизиновым покрытием с помощью жидкоотталкивающего маркера для слайдов (см. Таблицу материалов). Нанесите на круги 90 мкл подобразцов. Высушите нанесенный подобразец в химическом колпаке. Время в пути около 30-60 минут.
    2. Регидратируйте подобразец и промойте его 90 мкл PBS, инкубируйте в течение 2 минут и выбросьте PBS. Повторите эти действия 2 раза.
    3. Разведите1-е антитело28 (1 мг мл-1) в 200 раз в блокирующем растворе ПБГ. Регулируйте количество раствора в зависимости от количества образцов.
      1. Нанесите 90 мкл первичного (1ст) антитела28 на каждый подобразец, кроме отрицательного контроля. Положите в камеру отстоянную влажную от воды папиросную бумагу, закройте ее крышкой, и обмотайте прививочной лентой. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
  2. Применяют2-е антитело.
    1. Удалите избыток1-го антитела, позволив предметному стеклу постоять своей длинной стороной на папиросной бумаге, переверните его, чтобы поднять клетки вверх, и добавьте 0,2% Triton X-100 в каждый круг с помощью пипетки и инкубируйте 2 мин для промывания клеток. Повторите 5 раз.
    2. Аккуратно нанесите конъюгированное вторичное (2-е) антитело к пероксидазе поли-хренской редьки (HRP) (козье, антикроличье IgG) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре. Аккуратно промойте клетки PBS в течение 10 минут; Повторите 3 раза.
  3. Усиление тирамидного сигнала
    1. Добавьте 90 μл рабочего раствора тирамида в образцы и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте раствор, позволив предметному стеклу встать на длинную сторону папиросной бумаги. Добавьте 90 μл реагента, остановившего реакцию, и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре. Выбросьте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации следует проверять для каждого целевого белка или для каждого микроскопа. Время инкубации может быть сокращено или опущено, чтобы наблюдать за распределением белка с помощью конфокального микроскопа, чтобы избежать перенасыщения сигнала.
  4. Промывайте клетки PBS (5 раз) каждые 30 минут. Промойте клетки DW. Быстро удалите воду. Добавьте одну каплю монтажного носителя (см. Таблицу материалов) и установите покровное стекло.
  5. Осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы удалить излишки монтажного материала, и дайте ему высохнуть около 30 минут. Заклейте его прозрачным лаком для ногтей и храните в темноте.

7. Детектирование флуоресцентного сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа

  1. Питание от флуоресцентного микроскопа, компьютера и источника ультрафиолетового излучения. Откройте программное обеспечение для камеры, подключенной к микроскопу (см. Таблицу материалов). Настроен на мониторинг изображения в реальном времени. Выключите свет в комнате.
    1. Вставьте предметное стекло с клетками в предметный столик для образца. Используйте объектив с наименьшим увеличением и отрегулируйте объектив и конденсорную линзу для точной настройки фокусировки. Меняйте объектив на большее увеличение одно за другим.
    2. Нанесите погружное масло на верхнюю часть покровного стекла и замените линзу на масляную иммерсионную линзу 100x. Закройте источник света от источника света, выберите набор фильтров DAPI для анализа тирамида-350 и откройте возбуждающую УФ-световую заслонку.
    3. Протестируйте 3-4 времени экспозиции и определите наилучшее время экспозиции без перенасыщения. Выберите набор фильтров FITC для наблюдения за фикоэритрином, повторите процедуру и определите наилучшее время воздействия. Рассмотрите возможность использования режима повышенного усиления или биннинга на камере, чтобы ускорить процедуру и смягчить ухудшение сигнала из-за фототоксичности. Установите режим усиления и биннинга обратно для получения изображения.
  2. Выберите поле зрения, сделайте снимок для изображения яркого поля, изображения тирамида и изображения фикоэритрина с выбранным временем экспозиции для каждого изображения.

8. Детектирование под конфокальным микроскопом

  1. Включите конфокальный микроскоп и компьютер и запустите программное обеспечение для микроскопии. Нагревайте лазер в течение 60 минут. Выключите свет в комнате. Поместите предметное стекло с клетками на предметный столик с помощью иммерсионного масла на линзу объектива.
  2. Выберите лазер с длиной волны 405 нм и установите главные светоделители (MBS) 405. Установите мощность лазера на 0,5%. Задайте параметры измерения для получения размера пикселя 0,03 мкм, зум 10 (размер изображения 512 х 512 пикселей). Установите время задержки пикселей равным 0,02 мс, что дает общее время сканирования как 5,06 с.
  3. Установите диапазон детектора от 410 нм до 695 нм на спектральном детекторе GaAsP, обеспечив спектральное разрешение 9 нм. Установите оптимальное усиление (800-900). Запустите лямбда-сканирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное усиление должно быть оптимизировано для каждого микроскопа.

9. Количественно оцените интенсивность сигнала с помощью Фиджи

  1. Откройте изображение, полученное с помощью фильтра DAPI, под флуоресцентным микроскопом. Выделите ячейки на изображении яркого поля и определите область интереса (ROI). После определения ROI для всех ячеек сохраните ROI.
  2. Закройте изображение светлого поля и откройте флуоресцентное изображение. Разделите RGB-изображение на красный, синий и зеленый, чтобы извлечь сигнал Tyramide-350.
  3. Примените ROI, подготовленное по яркому полю, к синему изображению и измерьте интенсивность сигнала29. Сохраните результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Флуоресцентный сигнал наблюдался от внеклеточных веществ в отрицательном контроле, где1-е антитело не использовалось (рисунок 1А-С). Флуоресцентный сигнал реагента, усиленного тирамидами, конъюгированного с большой субъединицей белка Рубиско (RbcL), был успешно обнаружен у C. watsonii под флуоресцентным микроскопом с использованием фильтра DAPI с УФ-возбуждением (рис. 1D-F). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для цианобактерий система TSA нашла широкое применение в TSA-флуоресцентной гибридизации in situ (TSA-FISH, CARD-FISH), нацеливаясь на специфические рРНК. Тем не менее, его применение для белков остается ограниченным26. В данном исследовании была применена процедура TSA для обеспечения иммунодетектированияN-2-фиксирующей цианобактерии C. watsonii во всей клетке, включающей модификации, основанные на предыдущей ссылке2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Мы подтверждаем отсутствие конфликта интересов, связанного с этим исследованием.

Благодарности

Мы благодарим доктора Радека Кану и Барбору Шедиву за помощь в проведении конфокального микроскопического анализа, а также доктора Романа Соботку и доктора Катержину Бишову за советы по иммунодетекции и анализу флуоресцентной микроскопии. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Чешского исследовательского фонда GAČR (проект 20-17627S to OP и TM), проекта Mobility plus между JSPS и Чешской академией наук (JPJSBP 120222502) и JSPS KAKENHI (проект 23H02301).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АхромопептидадазаFUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952Тирамид-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254Тирамид-405
Alexa Fluor488 Тирамид SuperBoost KitThermo ScientificB40922Козий антикролик IgG
Бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA2153
ЦентрифугаEppendorf5804 R
Центрифуга пробирки (15 мл)VWR525-1085Для сбора клеток
Конфокальный микроскопZeissLSM880 Оснащен Airyscan
Флуоресцентный микроскопOlympusBX51DAPI фильтр: Ex.360-370 нм, Em. 420-460 нм
ЖелатинMerk4070
Высокоточный микроскоп защитные стекла для конфокального микроскопаDeckglä serNo. 1.5H
Блокиратор жидкости Regular/MiniDaido Sangyo Co., Ltd.Часть 6505Для удержания клеток на предметном стекле
ЛизоцимITW РеактивыA4972
МетанолCarl Roth67-56-1
Монокалия ФосфатPenta12290
МонокалийфосфатСреда Sigma-Aldrich345789-20MLFluorSave Реагент
Монтажная средаVectashildH-1300
Объектив, используемый в конфокальном микроскопеZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Масло DIC M27
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
Стекло с полилизиновым покрытиемSigma-AldrichP0425-72EA
Хлорид калия Lach-Ner
Безопасная запорная трубка (1,5 мл)Eppendorf0030 120.086Для обработки клеток и хранения химических веществ
Хлорид натрия Penta16610
Гидрофосфат натрия Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

Ссылки

  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Biotechnology. 62, 202-211 (2020).
  3. Takhaveev, V., Heinemann, M. Metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Microbiology. 45, 30-38 (2018).
  4. van Heerden, J. H., et al. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. Science. 343 (6174), 1245114(2014).
  5. Lindemann, D., Westerwalbesloh, C., Kohlheyer, D., Grunberger, A., von Lieres, E. Microbial single-cell growth response at defined carbon limiting conditions. RSC advances. 9 (25), 14040-14050 (2019).
  6. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J. L., Heinemann, M. Phenotypic bistability in Escherichia coli's central carbon metabolism. Molecular Systems Biology. 10 (7), 736(2014).
  7. Nikolic, N., et al. Cell-to-cell variation and specialization in sugar metabolism in clonal bacterial populations. PLoS Genetics. 13 (12), 1007122(2017).
  8. Solopova, A., et al. Bet-hedging during bacterial diauxic shift. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7427-7432 (2014).
  9. Schreiber, F., et al. Phenotypic heterogeneity driven by nutrient limitation promotes growth in fluctuating environments. Nature Microbiology. 1, 16055(2016).
  10. Zimmermann, M., et al. Substrate and electron donor limitation induce phenotypic heterogeneity in different metabolic activities in a green sulphur bacterium. Environmental Microbiology Reports. 10 (2), 179-183 (2018).
  11. Masuda, T., et al. Heterogeneous N2 fixation rates confer energetic advantage and expanded ecological niche of unicellular diazotroph populations. Communications Biology. 3, 172(2020).
  12. Mohr, W., Vagner, T., Kuypers, M. M., Ackermann, M., Laroche, J. Resolution of conflicting signals at the single-cell level in the regulation of cyanobacterial photosynthesis and nitrogen fixation. PLoS One. 8 (6), 66060(2013).
  13. Polerecky, L., et al. Temporal patterns and intra- and inter-cellular variability in carbon and nitrogen assimilation by the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Frontiers in Microbiology. 12, 620915(2021).
  14. Berthelot, H., et al. NanoSIMS single cell analyses reveal the contrasting nitrogen sources for small phytoplankton. ISME Journal. 13, 651-662 (2019).
  15. Foster, R. A., Sztejrenszus, S., Kuypers, M. M. Measuring carbon and N2 fixation in field populations of colonial and free-living unicellular cyanobacteria using nanometer-scale secondary ion mass spectrometry. Journal of Phycology. 49 (3), 502-516 (2013).
  16. Lin, S., Henze, S., Lundgren, P., Bergman, B., Carpenter, E. J. Whole-cell immunolocalization of nitrogenase in marine diazotrophic cyanobacteria, Trichodesmium spp. Applied and Environmental Microbiology. 64, 3052-3058 (1998).
  17. Berman-Frank, I., et al. Segregation of nitrogen fixation and oxygenic photosynthesis in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Science. 294, 1534-1537 (2001).
  18. El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A., Bergman, B. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology. 149, 1139-1146 (2003).
  19. Webb, E. A., Ehrenreich, I. M., Brown, S. L., Valois, F. W., Waterbury, J. B. Phenotypic and genotypic characterization of multiple strains of the diazotrophic cyanobacterium, Crocosphaera watsonii, isolated from the open ocean. Environmental Microbiology. 11 (2), 338-348 (2009).
  20. Taniuchi, Y., Murakami, A., Ohki, K. Whole-cell immunocytochemical detection of nitrogenase in cyanobacteria: improved protocol for highly fluorescent cells. Aquatic Microbial Ecology. 51, 237-247 (2008).
  21. Ohki, K., Taniuchi, Y. Detection of nitrogenase in individual cells of a natural population of Trichodesmium using immunocytochemical methods for fluorescent cells. Journal of Oceanography. 65, 427-432 (2009).
  22. Orcutt, K. M., Ren, S., Gundersen, K. Detecting proteins in highly autofluorescent cells using quantum dot antibody conjugates. Sensors. 9 (9), 7540-7549 (2009).
  23. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. 125, 279-285 (1989).
  24. Bobrow, M. N., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. Journal of Immunological Methods. 137, 103-112 (1991).
  25. Bobrow, M. N., Litt, G. J., Shaughnessy, K. J., Mayer, P. C., Conlon, J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. Journal of Immunological Methods. 150, 145-149 (1992).
  26. Piccini, C., Fabre, A., Lacerot, G., Bonilla, S. Combining immunolabeling and catalyzed reporter deposition to detect intracellular saxitoxin in a cyanobacterium. Journal of Microbiol Methods. 117, 18-21 (2015).
  27. Chen, Y. B., Zehr, J. P., Mellon, M. Growth and nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. Journal of Phycology. 32, 916-923 (1996).
  28. Ohki, K. Intercellular localization of nitrogenase in a non-heterocystous cyanobacterium (Cyanophyte), Trichodesmium sp. NIBB1067. Journal of Oceanography. 64, 211-216 (2008).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. McKnight, P. E., Najab, J. Mann-Whitney U Test. The Corsini Encyclopedia of Psychology. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2010).
  31. Steel, R. G. D. Some rank sum multiple comparison tests. Biometrics. 17, 539-552 (1961).
  32. M, S. H. K. Standard Deviation. International Encyclopedia of Statistical Science. Lovric, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  33. Gross, A. J., Sizer, I. W. The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by peroxidase. Journal of Biological Chemistry. 234 (6), 1611-1614 (1959).
  34. Eling, T. E., Thompson, D. C., Foureman, G. L., Curtis, J. F., Hughes, M. F. Prostaglandin H synthase and xenobiotic oxidation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 30, 1-45 (1990).
  35. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry Part A. 77 (11), 1020-1031 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Белки цианобактерийколичественное определение белковCrocosphaera watsoniiавтофлуоресценция фикоэритринаавтофлуоресценция фикоуробилинаконфокальная микроскопияфлуоресцентная микроскопияанализ отдельных клетокпрограммное обеспечение Fiji

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.