Методическая статья

Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей

DOI:

10.3791/65181

⸱

21 апреля 2023 г.

 ,  , 
1Chinese Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описана процедура визуализации кальциевых ответов в верхнем бугорке (СК) бодрствующих мышей, включая визуализацию активности одного нейрона с помощью двухфотонной микроскопии с оставлением коры нетронутой у мышей дикого типа, а также визуализацию всей СК с помощью широкопольной микроскопии у мутантных мышей с частичной корой.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Верхняя колликула (СК), эволюционно консервативная структура среднего мозга у всех позвоночных, является наиболее сложным зрительным центром до появления коры головного мозга. Он получает прямые входные данные от ~30 типов ганглиозных клеток сетчатки (RGC), каждый из которых кодирует определенную визуальную особенность. Остается неясным, наследует ли СК просто особенности сетчатки, или же в СК происходит дополнительная и потенциально de novo обработка. Чтобы выявить нейронное кодирование визуальной информации в СК, мы приводим здесь подробный протокол оптической регистрации зрительных реакций с помощью двух взаимодополняющих методов у бодрствующих мышей. Один метод использует двухфотонную микроскопию для визуализации активности кальция в разрешении одной клетки без абляции коры головного мозга, в то время как другой использует широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, кора головного мозга которой в значительной степени не развита. В этом протоколе подробно описаны эти два метода, включая подготовку животных, инъекцию вируса, имплантацию головной пластины, имплантацию пробки, сбор данных и анализ данных. Репрезентативные результаты показывают, что двухфотонная кальциевая визуализация выявляет визуально вызванные нейронные реакции при разрешении одной клетки, а широкопольная кальциевая визуализация показывает нейронную активность во всем СК. Комбинируя эти два метода, можно выявить нейронное кодирование в СК в разных масштабах, и такая комбинация может быть применена и к другим областям мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Верхний бугорок (СК) является важным зрительным центром у всех позвоночных. У млекопитающих он получает прямые входные сигналы от сетчатки и зрительной коры1. В то время как оптическая регистрация широко применяется в кореголовного мозга 2,3,4,5, ее применение в СК затруднено плохими оптическими доступами 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Целью данного протокола является предоставление подробной информации о двух взаимодополняющих методах оптической регистрации нейронной активности в СК.

СК располагается под корой головного мозга и поперечным синусом, что ограничивает оптический доступ к колликулярным нейронам. Один из подходов к преодолению этого ограничения заключается в аспирации коры головного мозга и обнажении передне-бокового SC 7,9,10,13,14,19. Однако, поскольку СК получает входные данные коры головного мозга, такая операция может повлиять на то, как нейроны СК реагируют на визуальные стимулы. Чтобы преодолеть это ограничение, мы подробно описали здесь альтернативный протокол визуализации поверхностного слоя заднемедиальной СК с помощью кремниевой пробки, оставляя кору нетронутой 8,11. В частности, для достижения одноклеточного разрешения мы применили двухфотонную микроскопию для получения изображений кальциевых ответов в заднемедиальном СК мышей дикого типа. Кроме того, чтобы добиться широкого охвата, мы применили широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, у которой задняя кора головного мозга не развилась20.

Два метода, описанные в этом протоколе, дополняют друг друга. Двухфотонная кальциевая визуализация без абляции коры головного мозга подходит для регистрации нейронной активности с разрешением одной клетки с интактными корковыми входами. Широкопольная кальциевая визуализация подходит для регистрации нейронной активности во всей СК при этом в ущерб пространственному разрешению.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями по благополучию животных и одобрены IACUC при Китайском институте исследований мозга в Пекине.

ПРИМЕЧАНИЕ: График этого протокола следующий: 1) сделать присоску; 2) ввести вирус; 3) имплантировать наголовную пластину; 4) через 3 недели имплантировать заглушку; 5) После ~3 дней восстановления и привыкания на беговой дорожке выполните двухфотонную / широкоугольную визуализацию.

1. Подготовка присоски (Рисунок 1А)

  1. Нанесите каплю фосфатно-солевого буфера (PBS, 1x) в акриловую посуду и коснитесь ее плоской иглой 21 г, чтобы заполнить кончик капиллярностью.
  2. Покройте кончик иглы полупрозрачным силиконовым клеем и поставьте примерно на ~10 минут.
  3. Нарежьте силиконовый клей ножницами на диск диаметром ~2 мм.

2. Подготовка заглушек (рисунок 1Б)

  1. Подготовьте пластиковую прокладку толщиной 0,75 мм и вырежьте в центре квадрат размером 1 см х 1 см. Подготовьте два акриловых блока. Промойте прокладку и акриловые блоки спиртом и протрите их бумагой для линз.
  2. Положите прокладку на один акриловый блок, поместите силиконовый клей в центр, чтобы заполнить ~90% отверстия (избегайте пузырьков), добавьте еще один акриловый блок и усилие ~1 кг и подождите 20 минут.
  3. Под операционным микроскопом скальпелем разрежьте силиконовый клей на треугольные призмы высотой 1 мм и шириной 1,5 мм над листом бумаги с напечатанными на нем треугольниками.
  4. Удалите пыль с треугольных призм с помощью пластиковой липкой ленты и наклейте ее на стеклянный покровный лист диаметром 5 мм и толщиной 0,15 мм.
  5. Поместите покровное стекло с треугольными призмами под протравливатель коронного разряда, включите устройство для обработки коронного разряда и поднесите его ближе к покровному покрытию, пока не появится осветление. Удерживайте их в таком положении несколько минут, пока они не прикрепятся друг к другу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может отличаться для других специалистов по лечению коронного разряда.
  6. Поместите пробки в чашку Петри и поместите ее в инкубатор при температуре 70 °C на ночь.

3. Подготовка животных и введение вирусного конструкта

  1. Используйте C57BL/6J (дикого типа) и Emx1-Cre:Pals1flox/wt (частичная кора)20 мышей обоего пола в возрасте 6 недель (9 недель на момент визуализации).
  2. Стерилизовать все материалы и инструменты, используемые для хирургической процедуры.
  3. Обезболивайте мышь 5% изофлураном, а затем поддерживайте изофлуран на уровне 1%-2% со скоростью потока 1 л/мин во время операции. Подтвердить уровень анестезии можно отсутствием пальцевого рефлекса.
  4. Голова-закрепите мышь на стереотаксической рамке с ушными планками. На протяжении всей операции наносите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание, и поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью термостатической грелки.
  5. Сбрейте мех и простерилизуйте поверхность кожи йодофором и 75% этиловым спиртом. Вводят лидокаин (5 мг/кг, подкожная инъекция [SQ]), тилидин (2 мг/кг, SQ) и мелоксикам (2 мг/кг, SQ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая процедура стерилизации, обезболивания и местной анестезии может отличаться в разных учреждениях.
  6. Хирургическими ножницами снимите кожу с СК, чтобы обнажить череп. Очистите череп ватным тампоном.
  7. Отрегулируйте стереотаксическую рамку до тех пор, пока поверхность черепа не станет плоской. Просверлите отверстие 0,5 мм сбоку и 0,42 мм кпереди от лямбды до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не обнажится.
  8. Вводят аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий GCaMP6m (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x 10 13 GC/мл, растворенный в1x PBS) на глубину 1 мм и 1,6 мм от лямбды с помощью микропипетки со скошенным углом (наконечник скошен до 25° при диаметре 40-50 мкм).
  9. На каждую глубину вводите по 100 нл со скоростью 50 нл/мин и ждите 5 мин после каждой инъекции. После инъекции медленно извлеките инжектор.

4. Имплантация головной пластины

  1. Очистите мышцы и ткани над черепом и поцарапайте череп лезвием. Если произошло кровотечение, остановите его гелевой пеной и очистите кровь. Прикрепите головную пластину (Рисунок 1C) к черепу с помощью самоотверждающегося стоматологического клейкого смоляного цемента. В частности, смешайте 3/4 ложки полимера, три капли мономера и одну каплю катализатора в керамической миске на льду. Нанесите смесь на голову и череп. Соедините их вместе и подождите 5 минут, пока клей схватится.
  2. Вводят антибиотики (цефтиофур натрия, 5 мг/кг, SQ) для профилактики инфекций. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и положите ее на грелку для восстановления. Верните его в домашнюю клетку после восстановления после наркоза. Для обезболивания дайте мыши питьевую воду, содержащую ибупрофен (0,5 мл/50 мл), в течение 3 дней после операции.

5. Имплантация заглушки (рисунок 2)

  1. Имплантируйте пробку через 3 недели после инъекции вируса. Обезболивайте и фиксируйте мышь на стереотаксическом каркасе, как описано в шагах 3.2-3.5. Приготовьте гелевую пену, смоченную в солевом растворе, чтобы остановить возможное кровотечение.
  2. Просверлите овал размером 3 мм x 2 мм с помощью микросверла, расположенного по центру на 0,5 мм позади лямбды. Прореживайте границу овала до тех пор, пока она не растрескается. Проредите череп перед овальным окошком записи, чтобы покровное стекло было близко к СК.
  3. Снимите костные лоскуты с помощью тонких щипцов. Сделайте надрез на твердой мозговой оболочке позади поперечной пазухи и удалите кусочек твердой мозговой оболочки. При необходимости добавьте в мозг искусственную спинномозговую жидкость (ОКСФ) с помощью шприца объемом 3 мл, чтобы предотвратить высыхание. Высушите череп и окно записи гелевой пеной и ватными палочками.
  4. Нанесите каплю силиконового клея в окно записи. Используйте присоску, чтобы удерживать вилку с отрицательным давлением. Используйте моторизованный микроманипулятор, чтобы переместить присоску и опустить пробку в силиконовый клей до тех пор, пока покровное стекло не коснется черепа. Затем переместите пробку вперед на ~1 мм, чтобы отодвинуть поперечную пазуху и обнажить СК. Этот шаг следует сделать за 1-2 минуты до того, как силиконовый клей станет липким.
  5. Очистите оголовье и нанесите бутилцианоакрилат и смоляной цемент вокруг границы заглушки, чтобы закрепить ее на головной пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте послеоперационный уход, как описано в шаге 4.2.

6. Двухфотонная визуализация (рис. 3)

  1. Зафиксируйте животное головой на вращающейся беговой дорожке с помощью головной пластины. Поместите беговую дорожку под двухфотонный микроскоп и отрегулируйте высоту до соответствующего положения. Поместите черный алюминиевый конус между объективом и наголовником, чтобы предотвратить световое загрязнение от монитора для визуальной стимуляции. Приучите мышь к ~15 мин.
  2. Выполняйте двухфотонную визуализацию на микроскопе с 16-кратным увеличением, числовой апертурой 0,8 и объективом с рабочим расстоянием 3 мм (WD). Используйте титан-сапфировый лазер с технологией синхронизации мод, управляемый двумя гальвосканерами, для возбуждения GCaMP6m на длине волны 920 нм. Отрегулируйте мощность лазера в плоскости образца в пределах 20-80 мВт.
  3. Сканирование в поле зрения 600 мкм x 600 мкм с частотой 4,8 Гц с пространственным разрешением 2,4 μ м/пиксель и нейронной активностью изображения на глубине до 350 μ м.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дискретизации и пространственное разрешение предназначены для гальванических сканеров и должны быть отрегулированы для резонансных сканеров.
  4. Соберите излучаемую флуоресценцию с помощью дихроичного зеркала и детектируйте ее с помощью фотоумножителя (ФЭУ) после пропускания через полосовой фильтр.
  5. Запишите передвижение мыши на беговой дорожке с помощью поворотного энкодера. Используйте камеру с объективом 50 мм для записи размера и положения зрачка. Синхронизируйте эти записи и полученные изображения с визуальной стимуляцией, записывая триггеры, посылаемые компьютером стимуляции.

7. Анализ кальциевых реакций, измеренных с помощью двухфотонной визуализации

  1. Корректируйте движение мозга во время визуализации с помощью SIMA21 или NoRMCorre22.
  2. Вручную нарисуйте область интереса (ROI) с помощью инструмента «Волшебная палочка ячейки» (ImageJ) и подгоните ее эллипсом в MATLAB. Извлеките флуоресцентные следы каждого ROI после удаления загрязнения нейропилем:
    figure-protocol-1
    F true и F raw— скорректированная и необработанная амплитуды флуоресценции ROI, соответственно, Fneuropil— амплитуда флуоресценции окружающего нейропиля, а r — фактор загрязнения нейропиля вне фокуса (0,7 для нашей установки). r оценивается путем измерения сигналов на кровеносном сосуде, для которого Ftrue = 0, как описано ранее23,24.
  3. Устраните медленные колебания базовой линии, вычитая значение восьмого процентиля из 15-секундного окна, центрированного на каждом кадре25.
  4. Определим зрительные реакции нейрона как относительное изменение амплитуды флуоресценции в его ROI в период стимула:
    figure-protocol-2
    Пик F — это пиковая амплитуда флуоресцентного следа во время визуальной стимуляции, а исходный уровеньF— это средняя амплитуда в течение 0,5 с до стимуляции.

8. Широкоугольная визуализация и анализ данных (рис. 4)

  1. Постройте широкоугольный макроскоп с тандемным объективом 4 (рис. 4А). Двухлинзовый макроскоп представляет собой два объектива камеры (50 мм и 105 мм), соединенных через переходник, а увеличение составляет ~2x.
  2. Подготовьте мутантных мышей с частичной корой головного мозга, как описано в шагах 3.2-3.5. Ввести 100 нл AAV, экспрессирующего GCaMP6m, на глубину 200 мкм в центре каждой стороны СК.
  3. Через ~3 недели имплантируйте покровное стекло диаметром 5 мм поверх СК. Выполните овальную трепанацию черепа размером 4 мм х 3 мм с центром в СК и истончите кость вокруг него. Затем прижмите покровный листок непосредственно к SC и зафиксируйте его смоляным цементом.
  4. Возбудить GCaMP6m с помощью синего светодиода (LED) с фильтром возбуждения (469 нм ± 35 нм). Получение изображений с помощью дополнительной КМОП-камеры после прохождения эмиссионного фильтра (525 нм ± 39 нм) с частотой 10 Гц. Камера охватывает площадь 5,36 мм x 2,85 мм с пространственным разрешением 2,63 мкм/пиксель.
  5. Сверните каждое полученное изображение с помощью нормализованного прямоугольного фильтра и уменьшите его разрешение до 1/4 от исходного размера. Для каждого пикселя изображения определите ответ, как описано в шаге 7.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте послеоперационный уход, как описано в шаге 4.2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунках 1A, B показано, как изготовить присоску и пробки соответственно. На рисунке 2 показано, как успешно имплантировать пробку. После имплантации пробки обнажается задне-медиальная СК, как показано на рисунке 2D. На рисунке 3 показаны кальциевые ответы нейронов SC на примере мыши дикого типа, изображенной с помощью двухфотонной микроскопии. Треугольная призма, которая легко улавл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в протоколе
Наиболее ответственным этапом является трепанация черепа на этапах 5.2 и 5.3. Во-первых, кость на 0,5 мм позади лямбды толстая и имеет кровеносные сосуды внутри, что может вызвать кровотечение в процессе сверления. Для остановки кровотечения следует приготовить соответствующую гелевую пену. Во-вторых, существует большая вероятность ангиорексии при удалении кости чуть выше поперечной пазухи. Для устранения неполадок один из альтернативных подходов заключается в том, чтобы и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32271060). Ю.-Т.Л. спроектировал исследование, провел эксперимент, проанализировал данные и написал рукопись. З.Л. и Р.В. проводили эксперимент.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16-кратный объективNikon
50 мм объективComputarM5018-MP2
5 мм покровное стеклоWarner instrumentsCS-5R
полосовой фильтрChroma TechnologyHQ575/250 m-2p
бутилцианоакрилатVetbond, фотоаппарат World Precision Instruments
для контроля зрачкаКамера FLIRBFS-U3-04S2M-CS
для широкоугольной визуализацииBasleracA2000-165µ m
коронный протравливательElectro-Technic ProductsBD-20AC
дихроичныйChroma TechnologyT600/200dcrb 
гальванометрыCambridge Technology
стерилизатор стеклянных шариковRWDRS1502
микродрельRWD78001
микроманипуляторSutter InstrumentsQUAD
фотоумножительHamamatsuR3896
роторный энкодерUSdigitalMA3-A10-125-N
Самоотверждающийся цемент на основе адгезивной смолы для стоматологии SuperBond C& B, Sun Medical Co, Ltd. Морияма, Япония
термостатическая грелка RWD69020
Ti:Сапфировый лазерSpectra-PhysicsMai Tai HP DeepSee
полупрозрачный силиконовый клей Квик-Сил, беговая дорожка World Precision Instruments
Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-gcamp6mVector Core в Китайском институте исследований мозга, Пекин
Animals
C57BL/6J дикого типаРесурсный центр лабораторных животных при Китайском институте исследований мозга, Пекин
Emx1-creЛаборатория Джексона 5628
Pals1flox/wtChristopher A. Walsh Lab
Software
ImageJNIH Image
LabviewNational Instruments
MATLABMathworks

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773(2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261(2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80(2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи