Method Article

Использование MouseWalker для количественной оценки локомоторной дисфункции в мышиной модели травмы спинного мозга

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предоставляется экспериментальный конвейер для количественного описания локомоторного паттерна свободно ходящих мышей с использованием набора инструментов MouseWalker (MW), начиная от первоначальных видеозаписей и отслеживания и заканчивая постколичественным анализом. Модель ушиба спинного мозга у мышей используется для демонстрации полезности системы MW.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполнение сложных и высоко скоординированных двигательных программ, таких как ходьба и бег, зависит от ритмической активации спинальных и надспинальных цепей. После травмы грудного отдела спинного мозга нарушается связь с вышестоящими цепями. Это, в свою очередь, приводит к потере координации, с ограниченным потенциалом восстановления. Следовательно, чтобы лучше оценить степень выздоровления после введения лекарств или терапии, необходимы новые, более подробные и точные инструменты для количественной оценки походки, координации конечностей и других тонких аспектов двигательного поведения на животных моделях повреждения спинного мозга. За прошедшие годы было разработано несколько анализов для количественной оценки поведения грызунов при свободном хождении; Однако им обычно не хватает прямых измерений, связанных со стратегиями шаговой походки, паттернами следа и координацией. Для устранения этих недостатков предоставляется обновленная версия MouseWalker, которая сочетает в себе проход полного внутреннего отражения (fTIR) с программным обеспечением для отслеживания и количественной оценки. Эта система с открытым исходным кодом была адаптирована для извлечения нескольких графических выходных данных и кинематических параметров, а набор инструментов постколичественной оценки может быть предназначен для анализа предоставленных выходных данных. Эта рукопись также демонстрирует, как этот метод, в сочетании с уже установленными поведенческими тестами, количественно описывает двигательный дефицит после травмы спинного мозга.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективная координация четырех конечностей характерна не только для четвероногих животных. Координация передних и задних конечностей у людей по-прежнему важна для выполнения нескольких задач, таких как плавание и изменение скорости при ходьбе1. Различные кинематические2 конечностей и двигательная программа 1,3,4, а также проприоцептивные цепиобратной связи 5 сохраняются между людьми и другими млекопитающими и должны учитываться при анализе терапевтических возможностей при двигательных расстройствах, таких как повреждение спинного мозга (ТСМ)6,7,8.

Для того, чтобы ходить, несколько позвоночных соединений от передних и задних конечностей должны быть правильно подключены и ритмично активированы, что требует входных данных от мозга и обратной связи от соматосенсорной системы 2,9,10. Эти связи достигают кульминации в центральных генераторах паттернов (CPG), которые расположены на шейном и поясничном уровнях для передних и задних конечностей, соответственно 1,9,10. Часто после ТСМ нарушение нейронных связей и образование ингибирующего глиального рубца12 ограничивают восстановление двигательной функции, при этом исходы варьируются от полного паралича до ограниченной функции группы конечностей в зависимости от тяжести травмы. Инструменты для точной количественной оценки опорно-двигательной функции после ТСМ имеют решающее значение для мониторинга выздоровления и оценки эффектов лечения или других клинических вмешательств6.

Стандартным метрическим анализом для моделей ушиба мышей при ТСМ является шкала мышей Бассо (BMS)13,14, непараметрическая оценка, которая учитывает устойчивость туловища, положение хвоста, подошвенный шаг и координацию передних и задних конечностей на арене открытого поля. Несмотря на то, что BMS чрезвычайно надежен для большинства случаев, для наблюдения за всеми углами движения животных требуется, по крайней мере, два опытных оценщика, чтобы учесть естественную изменчивость и уменьшить смещение.

Другие анализы также были разработаны для количественной оценки двигательных характеристик после ТСМ. К ним относятся испытание ротародом, в ходе которого измеряется время, затраченное на вращающийся цилиндр15; горизонтальная лестница, которая измеряет количество пропущенных перил и положительных захватовлестницы 16,17; и тест на ходьбу по лучу, который измеряет время, необходимое животному, и количество отказов, которые оно совершает при пересечении узкой балки18. Несмотря на то, что они отражают комбинацию двигательного дефицита, ни один из этих тестов не дает прямой локомоторной информации о координации передних и задних конечностей.

Чтобы конкретно и более тщательно проанализировать поведение при ходьбе, были разработаны другие анализы для реконструкции циклов шагов и стратегий ходьбы. Одним из примеров является тест на след, когда нарисованные чернилами лапы животного рисуют узор на листе белой бумаги19. Несмотря на простоту выполнения, извлечение кинематических параметров, таких как длина шага, является громоздким и неточным. Кроме того, отсутствие динамических параметров, таких как продолжительность цикла шага или координация ног, ограничивает его применение; Действительно, эти динамические параметры можно получить, только анализируя покадровые видео грызунов, идущих по прозрачной поверхности. Для исследований SCI исследователи проанализировали поведение при ходьбе с бокового обзора с использованием беговой дорожки, включая реконструкцию цикла шагов и измерение угловых вариаций каждого сустава ног 4,20,21. Несмотря на то, что этот подход может быть чрезвычайно информативным6, он по-прежнему ориентирован на определенный набор конечностей и не имеет дополнительных особенностей походки, таких как координация.

Чтобы восполнить эти пробелы, Хамерс и его коллеги разработали количественный тест на основе оптического сенсорного датчика с использованием фрустрированного полного внутреннего отражения (fTIR)22. В этом методе свет распространяется через стекло через внутреннее отражение, рассеивается при нажатии на лапу и, наконец, улавливается высокоскоростной камерой. Совсем недавно была выпущена версия этого метода с открытым исходным кодом, называемая MouseWalker, и этот подход сочетает в себе проход fTIR с пакетом программного обеспечения для отслеживания и количественной оценки23. Используя этот метод, пользователь может извлечь большой набор количественных параметров, включая шаги, пространственные и походочные паттерны, позиционирование следа и координацию передних и задних конечностей, а также визуальные выходы, такие как паттерны следа (имитирующие анализ чернильной лапы6) или фазы стойки относительно оси тела. Важно отметить, что из-за его природы с открытым исходным кодом новые параметры могут быть извлечены путем обновления пакета сценариев MATLAB.

Здесь обновлена ранее опубликованная сборка системы MouseWalker23 . Предоставляется описание того, как его настроить, со всеми шагами, необходимыми для достижения наилучшего качества видео, условий отслеживания и получения параметров. Также используются дополнительные инструменты постколичественной оценки для улучшения анализа выходного набора данных MouseWalker (MW). Наконец, полезность этого инструмента демонстрируется получением количественных значений общих двигательных характеристик, в частности циклов шагов и координации передних и задних конечностей, в контексте травмы спинного мозга (ТСМ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры по обращению, хирургии и послеоперационному уходу были одобрены Комитетом по молекулярному внутреннему уходу Института медицины (ORBEA) и Португальским комитетом по этике животных (DGAV) в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества (Директива 2010/63/ЕС) и португальским законом об уходе за животными (DL 113/2013) в соответствии с лицензией 0421/000/000/2022. Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6J в возрасте 9 недель. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество животных и уменьшить страдания животных, использованных в исследовании. Скрипт MATLAB и автономная версия программного обеспечения MW имеют открытый исходный код и доступны на GitHub
репозиторий (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Хотя программное обеспечение MW было разработано в MATLAB R2012b, оно было адаптировано для работы в MATLAB R2022b. На рисунке 1 показан рабочий процесс анализа MW.

1. Настройка аппарата MouseWalker (MW)

  1. Соберите аппарат MW, как описано ранее23, или адаптируйте его к конкретным потребностям экспериментального проекта (см. Таблицу материалов и дополнительный рисунок 1 для получения более подробной информации об установке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прогулочную арену можно сделать шире, чтобы разместить более крупных животных, таких как крысы.
  2. Убедитесь, что плексиглас, на котором гуляют животные, чистый и без царапин. Используйте гладкую чистящую ткань и сведите к минимуму использование органических растворителей, таких как аммиак или этанол в высоких концентрациях, которые могут повредить оргстекло (рекомендуется 3% перекись водорода, 7% этанол или любое совместимое и подходящее дезинфицирующее средство для оргстекла). При необходимости замените оргстекло.
  3. Настройте высокоскоростную камеру с светосильным объективом и большой диафрагмой (т. е. меньшими значениями диафрагмы) для захвата большого количества света, так как это помогает записывать сигналы fTIR (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив не должен создавать оптические искажения, особенно по краям изображения. Оптические искажения можно проверить, записав известную картину (например, полосы или квадраты), а затем измерив размер блоков на ImageJ/FIJI24 (используйте инструмент «Линия», а затем нажмите « Анализировать» > «Измерить»). Например, квадрат размером 1 см должен иметь одинаковые размеры в пикселях как в центре изображения, так и по краям. Вариации должны быть менее 5%.
  4. Зажгите разноцветную светодиодную ленту от фонового светового короба.
  5. Зажгите белую светодиодную ленту от светового короба дорожки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цветной светодиод также может быть использован25 для облегчения различения посадочного места/тела/фона.
  6. При выключенном свете в комнате проверьте интенсивность света фонового светового короба и дорожки. Отрегулируйте интенсивность, при необходимости, с помощью потенциометра или полупрозрачного пластика. Они должны быть оптимизированы таким образом, чтобы интенсивность пикселей увеличивалась в следующем порядке: тело животного < фон < следы.
    1. Чтобы проверить интенсивность пикселей тела/фона/следов животного, откройте последовательность изображений на ImageJ/FIJI24 и нажмите « Проанализировать > измерить». Сигнал следа не должен быть перенасыщен, так как это предотвратит определение границ следа (т. е. пальцев ног и подушечек стопы) (дополнительный рисунок 2).
  7. Отрегулируйте контрастность изображения дорожки с помощью программного обеспечения для записи видео. Контрастность можно регулировать двумя способами: затемнив или увеличив освещение на светодиодной ленте или отрегулировав диафрагму объектива камеры.
  8. Правильно расположите объектив так, чтобы он находился на одной высоте и в центре отражающего зеркала под углом 45° и перпендикулярно (90°) дорожке. Это будет генерировать постоянно пропорциональное изображение вдоль дорожки слева и справа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте изменения положения камеры (расстояния, высоты и ориентации) во время нескольких сеансов записи. При необходимости разметьте пол, на котором должен быть размещен штатив. Это сохранит характеристики изображения.
  9. Сфокусируйте линзу на поверхности оргстекла. Это можно проверить с помощью не повреждающего предмета, касающегося поверхности оргстекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При более низких значениях диафрагмы объектива глубина резкости будет уменьшаться, что затруднит фокусировку.
  10. Убедитесь, что все настройки остаются неизменными во время анализа, так как они могут изменить интенсивность пикселей записанных видео.

2. Получение видео

  1. Перед тестированием убедитесь, что мыши знакомы с помещением и аппаратом. Отложите хотя бы 1 день для привыкания (день 0). Чтобы избежать чрезмерных тренировок, выполняйте тест MW в день, отличный от других поведенческих тестов (желательно на следующий день).
  2. В программном обеспечении для записи видео убедитесь, что видно не менее 50 см дорожки.
  3. Отрегулируйте параметры записи, чтобы усечь область дорожки. Это уменьшит размер видео и оптимизирует получение видео.
  4. Фотографируйте или снимайте на видео обычную линейку перед каждым сеансом. Количество пикселей на сантиметр позже будет использоваться в «окне настроек» для калибровки видео.
  5. Начните сбор видео и поместите животное на край дорожки, взявшись за основание хвоста, чтобы избежать травм. Следите за тем, чтобы животные двигались вперед к крайнему краю платформы. Выполняйте видеозаписи со скоростью не менее 100 кадров в секунду, чтобы обеспечить плавные переходы походки.
    1. При необходимости мотивируйте животных двигаться, осторожно постукивая по стене дорожки или щелкая/хлопая пальцами. Однако избегайте физического подталкивания, так как это может повлиять на результаты.
    2. Сохраняйте видео непосредственно в виде последовательностей изображений в формате TIFF (со сжатием LZW), JPEG или PNG. Если камера записывает в виде необработанного файла MOV, преобразуйте видео в последовательности изображений, открыв файл в ImageJ / FIJI24 и щелкнув «Файл» > «Сохранить как последовательность изображений> (или с помощью другого программного обеспечения, такого как LosslessCut25).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство животных начинают ходить сразу после того, как их ставят на дорожку; Поэтому рекомендуется начать видеосъемку перед размещением животного.

3. Подготовка видеороликов для программного обеспечения для отслеживания MW

  1. Снимайте достаточно полных прогонов каждой отдельной мыши. Количество животных для съемки в каждом состоянии и количество полных прогонов должны определяться в соответствии с каждым экспериментальным проектом. Полный пробег — это когда мышь проходит все 50 см дорожки без длительных остановок (в этом эксперименте было выбрано три полных пробега).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от программного обеспечения для получения изображений видео может потребоваться обрезать до наименьшей рентабельности инвестиций. Это увеличит скорость отслеживания и генерации вывода.
  2. В ImageJ/FIJI24 выберите кадры, в которых мышь находится на экране, щелкнув Image > Stack > Tools > Make a substack. Слежение на MW требует, чтобы голова и хвост были видны на всех кадрах. Однако можно сделать несколько подстеков из одной видеозаписи, которые позже будут представлять каждый прогон.
  3. Сохраните каждый подстек отдельно в разных папках, щелкнув « Файл» > «Сохранить как последовательность изображений>». Программное обеспечение MW позже автоматически создает подпапку в каждом каталоге каждый раз, когда кто-то начинает анализировать запуск.

4. Отслеживание

  1. Откройте MATLAB, добавьте папку, содержащую сценарий MW, в рабочий каталог и запустите «MouseWalker.m» в главной командной строке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование программного обеспечения MW в MATLAB позволяет отслеживать сообщения об ошибках, которые можно просматривать на главной консоли MATLAB и выбирать желаемые выходные данные (открыв основной файл сценария «MouseEvaluate.m» и изменив выходные данные на 1 или 0: файл Excel, графики шагов, следы стойки и паттерны походки).
  2. Загрузите папку с видео как «Входной каталог». Можно также выбрать выходную папку; однако это не является обязательным требованием, поскольку программное обеспечение MW автоматически создает новую папку с именем «Результаты» внутри «Входного каталога».
  3. С помощью стрелок «<<», «<», «>>» и «>» проверьте, правильно ли загружены все видеокадры внутри программного обеспечения MW.
  4. Перейдите в «Окно настроек», где находятся все параметры калибровки и порога. Эти настройки могут изменяться в зависимости от интенсивности пикселей фона и посадочных мест, а также от минимального размера корпуса и посадочных мест, а также от других факторов (см. пример на дополнительном рисунке 2). Протестируйте эффект изменения некоторых параметров, нажав на кнопку Предварительный просмотр .
    1. Используйте различные стили графика, в том числе «тело + ноги + хвост», «только тело», «только ноги» и «только хвост», чтобы помочь различить части тела после настройки пороговых параметров.
    2. Воспользуйтесь инструментами на правой боковой панели, чтобы измерить яркость или размер (с помощью кнопок «яркость» и «линейка» соответственно). Все настройки могут быть сохранены как «по умолчанию» до тех пор, пока расстояние до камеры остается прежним.
  5. После настройки пороговых параметров убедитесь, что видео готово к автоматическому отслеживанию. Перейдите к первому кадру и нажмите « Авто », чтобы начать отслеживание. Этот шаг можно выполнить в режиме реального времени, и он занимает несколько минут, в зависимости от размера видео и производительности компьютера.
    1. Если автоматическое отслеживание неправильно помечает функции тела, отмените автоматическое отслеживание, введите новые настройки и перезапустите процесс.
  6. После завершения отслеживания проверьте, не требуется ли ручная коррекция. Чтобы исправить ситуацию, используйте среднюю панель для выбора или отмены выбора и укажите расположение правого переднего (RF), правого заднего (RH), левого переднего (LF) и левого заднего (LH) следов лап, головы, носа, тела (разделенных на два сегмента) и положения хвоста (разделенных на четыре сегмента). Сохраните изменения, нажав кнопку Сохранить .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все кнопки и большинство команд имеют сочетание клавиш (подробности см. в соответствующем руководстве23). Для облегчения прокрутки видео и выполнения сочетаний клавиш можно использовать аппаратный контроллер с программируемыми кнопками и челночным колесом, как у Contour ShuttlePro V2.
  7. Нажмите « Оценить », чтобы сгенерировать выходные файлы из отслеживаемого видео. В зависимости от выбранного желаемого результата (см. шаг 4.1) этот шаг может занять несколько минут.
  8. Убедитесь, что все графики графических выходных данных сохранены в папке «Результаты». Проверьте точность отслеживания, изучив некоторые графические результаты, такие как «Следы стойки», где можно проверить, все ли положения лап согласованы.
    1. Если обнаружена ошибка, вручную исправьте отслеживание (если это возможно; в противном случае удалите папку «Результаты» и снова выполните автоматическое отслеживание с новыми настройками) и снова нажмите на команду «Оценить ».
  9. Убедитесь, что все количественные измерения, сгенерированные программным обеспечением MW, сохраняются в электронной таблице Excel и суммируются в «1. Info_Sheet». Убедитесь, что параметры Excel для разделителей формул соответствуют сценарию. Десятичный разделитель должен быть «,», а тысячные разделители должны быть «;».
  10. Используйте сценарий "MouseMultiEvaluate.m" для объединения измерений из всех запусков в новый файл для анализа.
    1. Для начала сгенерируйте .txt файл, содержащий пути к папкам для всех видео (например, «Видеофайлы.txt»). Убедитесь, что каждая строка соответствует одному видео.
    2. Затем напишите «MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')» в командную строку. В рабочем каталоге будет сгенерирован файл Excel с именем «ResultSummary.xls» (см. пример в репозитории GitHub).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены графические выходы, полученные программным обеспечением MW из видеозаписей одного зарегистрированного животного.

5. Рабочий процесс анализа кинематических данных

  1. Отредактируйте лист Excel, созданный на шаге 4.10, который содержит данные для обработки с помощью предоставленных скриптов Python, в соответствии со следующими предварительными требованиями.
    1. В заголовке первого столбца укажите условие эксперимента. Назовите каждую строку после имени группы/условия (пользователи из одних и тех же групп должны иметь одно и то же имя). Первая группа должна быть контрольной или базовой линией (это обязательно только для построения тепловой карты, шаг 5.6).
    2. Во втором столбце укажите идентификатор животного. Это обязательно, хотя эта информация не будет использоваться для генерации графика.
    3. В третьем столбце выберите параметры двигателя, которые будут использоваться для анализа. Убедитесь, что в первой строке указано имя параметра (эти имена позже появятся на графиках).
  2. Откройте Anaconda Navigator и запустите Spyder, чтобы открыть предоставленные скрипты Python.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все скрипты были разработаны с помощью Python 3.9.13, были выполнены с помощью Spyder 5.2.2 в Anaconda Navigator 2.1.4 и доступны в таблице материалов и репозитории GitHub (куда включены дополнительные материалы, такие как пример видео, файл примера Excel и документ часто задаваемых вопросов). Можно выполнять скрипты вне Anaconda Navigator; Однако этот графический пользовательский интерфейс более удобен для пользователя.
  3. Используйте «Rawdata_PlotGenerator.py» для создания графиков необработанных данных. Это позволит визуализировать каждый параметр в зависимости от скорости.
    1. Откройте «Rawdata_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
    2. Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
    3. Графики необработанных данных появятся в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить графики, нажмите кнопку «Сохранить изображение » или « Сохранить все изображения » в консоли графика.
  4. Используйте скрипт "Residuals_DataAnalysis" для расчета остатков для анализа данных. Этот скрипт сгенерирует CSV-файл с расчетами остатков для всех параметров двигателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие из измеренных параметров походки, извлеченных MW, изменяются в зависимости от скорости (например, скорость качания, длина шага, продолжительность стойки, прямолинейность стойки и индексы походки). Поэтому рекомендуется выполнить наиболее подходящую регрессионную модель зависимости каждого отдельного параметра от скорости для базового эксперимента, а затем определить остаточные значения для каждой экспериментальной группы по отношению к этой регрессионной модели. Затем данные выражаются в виде разницы с остаточной нормализованной строкой26.
    1. Откройте «Residuals_DataAnalysis.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
    2. Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
    3. Сохраните CSV-файл в той же папке, что и данные. Обязательно, чтобы элемент управления (или базовый план) был первой группой в файле Excel.
  5. Используйте сценарий «PCA_PlotGenerator.py» для выполнения анализа главных компонент (PCA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот неконтролируемый метод уменьшения размерности используется для получения более краткого представления27,28,29 данных (рис. 3A, B). Сценарий PCA включает в себя следующие шаги. Данные сначала предварительно обрабатываются путем центрирования и масштабирования, после чего алгоритм PCA вычисляет ковариационную матрицу для определения корреляций между переменными и вычисляет собственные векторы и собственные значения ковариационной матрицы для идентификации основных компонентов. Первые два или три основных компонента выбираются для представления данных на 2D или 3D графиках соответственно. Каждая точка на графиках соответствует животному и представляет собой отдельную абстрактную переменную. Точки с цветовой кодировкой используются для различения конкретных групп. Таким образом, скопления точек отражают схожие паттерны ходьбы, общие для соответствующих людей.
    1. Откройте «PCA_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
    2. Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
    3. Убедитесь, что 2D- и 3D-графики PCA отображаются в консоли печати (верхняя правая панель). Каждый цвет представляет отдельную группу, и легенда появляется рядом с графиком. Чтобы сохранить сюжет, нажмите « Сохранить изображение » в консоли сюжета.
  6. Используйте «Heatmap_PlotGenerator.py» для создания тепловой карты. Убедитесь, что генератор тепловой карты создает таблицу, показывающую статистические различия между базовой группой (или контрольной группой) и другими группами для каждого параметра27 двигателя (рис. 4). В каждом столбце изображена одна группа, и каждая строка относится к определенному параметру двигателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или ANOVA Крускала-Уоллиса, за которым следовал тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). Выбросы были исключены из анализа. P-значения представлены цветовым кодом, с красными и синими оттенками, указывающими на увеличение или уменьшение относительно контроля (или базового уровня) соответственно. Цветовой оттенок представляет статистическую значимость, при этом более темные цвета показывают более высокую значимость, а более светлые цвета показывают меньшую значимость. соответствует P < 0,001; ** соответствует P < 0,01; и * соответствует P < 0,05. Белый цвет указывает на отсутствие изменений.
    1. Откройте «Heatmap_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
    2. Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
    3. Во втором автоматическом окне выберите тип данных: необработанные данные или данные об остатках. Если параметр не выбран, по умолчанию используются данные об остатках.
    4. Тепловая карта появится в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить сюжет, нажмите « Сохранить изображение » в консоли сюжета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно, чтобы элемент управления (или базовый план) был первой группой в файле Excel.
  7. Используйте «Boxplots_PlotGenerator.py» для создания блочных диаграмм. Этот инструмент позволит создавать прямоугольные диаграммы, представляющие распределение значений для всех параметров двигателя для каждой группы (рис. 5, рис. 6 и рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая рамка содержит медиану в качестве средней линии, а нижний и верхний края прямоугольников представляют собой квартили 25% и 75% соответственно. Усы представляют собой диапазон полного набора данных, исключая выбросы. Выбросы определяются как любое значение, которое в 1,5 раза превышает межквартильный диапазон ниже или выше квартилей 25% и 75% соответственно.
    1. Откройте «Boxplots_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
    2. Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
    3. Во втором автоматическом окне выберите тип данных: необработанные данные или данные об остатках. Если параметр не выбран, по умолчанию используются данные об остатках.
    4. Прямоугольные диаграммы появятся в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить графики, нажмите кнопку «Сохранить изображение » или « Сохранить все изображения » в консоли графика.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартная система BMS описывает общий двигательный дефицит после SCI14. Из-за его субъективного характера другие количественные анализы обычно проводятся вместе с BMS для получения более подробной и точной оценки локомоции. Тем не менее, эти тесты не показывают конкретной информации о циклах шагов, паттернах шагов и координации передних и задних конечностей, что чрезвычайно важно для понимания того, как схема позвоночника поддерживает функцию и адаптируется к неполной ТСМ. В этом разделе показан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь потенциал метода MouseWalker демонстрируется анализом локомоторного поведения после ТСМ. Он дает новое представление о конкретных изменениях в шагах, посадочной площади и паттернах походки, которые в противном случае были бы пропущены другими стандартными тестами. В дополнение к предоставлению обновленной версии пакета MW, инструменты анализа данных также описаны с использованием поставляемых скриптов Python (см. шаг 5).

Поскольку MW генерирует большой набор данных и набор кинематических...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Лауру Такер и Наташу Лонкаревич за их комментарии к рукописи и поддержку, оказанную Центром грызунов Института молекулярной медицины Жуана Лобо Антунеша. Авторы выражают благодарность Prémios Santa Casa Neurociências - Премия Мело и Кастро за исследования травм спинного мозга (MC-36/2020) Лос-Анджелесу и К.С.М. Эта работа была поддержана Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 и UIDP/04462/2020) и LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) с C.S.M. L.S. была поддержана контрактом с индивидуальным главным исследователем CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. был поддержан докторской стипендией FCT (2020.08168.BD). A.M.M. был поддержан докторской стипендией FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. был поддержан постдокторской стипендией FCT (SFRH / BPD / 118051/2016). D.N.S. был поддержан докторской стипендией FCT (SFRH / BD / 138636/2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<стронг>45º Зеркало 
2 алюминиевый профиль (2 x 2 см), высота 16 см, по 1 с каждой стороныMisumi
2 алюминиевый профиль (2 x 2 см), 23 см, @ 45° , по 1 с каждой стороныMisumi
1 алюминиевый профиль (2 x 2 см), длина 83 смMisumi
87 x 23 см зеркалоОбщий поставщик стекла 
наполнитель из черного картона Поставщик канцелярских товаровобщего назначения Мы использовали 2, один с 69 x 6 см, а другой с 69 x 3 см, чтобы ограничить отражение на зеркале
<сильный>Подсветка фона
109 x 23 см оргстекло (толщина 0,9525 см)Поставщикобщей фурнитуры
2 боковые алюминиевые продавцы (4 x 4 см), длина 20 см, по 1 с каждой стороныMisumi
многоцветная светодиодная лентаОбщий поставщик
белая непрозрачная бумага для покрытия плексигласаОбщий поставщик
fTIR Опорное основание и столбы
2 алюминиевая экструзия (4 x 4 см), высота 100 смMisumi
60 x 30 см метрическая макетная платаEdmund Optics #54-641
Винты M6 12 ммEdmund Optics 
Шестигранные гайки и вахеры M6Edmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8,5 см плексиглас (толщина 1,2 см)Общий поставщик109 x 8,5 см плексиглас (толщина 1,2 см)
Длина 109 см Основание U-образный алюминий с высотой 1,6 см и глубиной 1,9 см толстыми складками (для удержания оргстекла)Поставщикобщей фурнитуры
2 боковые алюминиевые экструзии (4 x 4 см) длина 20 см, по 1 с каждой стороныMisumi
наполнитель из черного картона канцелярских товаровмы использовали по 2 наполнителя с каждой стороны, чтобы закрыть границы оргстекла, избегая ярких краев
M6 12 мм винтамиEdmund Optics 
High speed camera (на штативе)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CЭто рекомендация. Требование – запись не менее 100 кадров в секунду
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor ООО «Прецизионные системы и контрольно-измерительные приборы».#0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Этот объектив рекомендуется, однако можно использовать другой объектив. Убедитесь, что он содержит большую апертуру (т.е. меньшие значения F-ступени), чтобы захватывать сигналы fTIR<
strong>Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 проекта Spyder
Walkway wall 
2 больших прямоугольных акрила размером 100 x 15 смЛюбой бриколажный круглосуточный магазин
2 трапециевидных акриловых латераль длиной 6-10 x высотой 15 смЛюбой бриколаж круглосуточный магазин
GitHub Materials
Имя папкиURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsСкрипт для создания Boxplots
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsДополнительные документы
Тепловая картаhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsСкрипт для создания тепловой карты
Matlat scripthttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker matlab script
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript для выполнения анализа главных компонент Графики
необработанных данныхhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsСкрипт для создания графиков необработанных данных
Анализ остаточныхhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysisкод для вычисления остатков из необработанных данных
метизов канцелярских товаров скобяных изделий Общий поставщик Участники

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MouseWalker SystemSpinal Cord InjuryLocomotor DysfunctionGait QuantificationMouse ModelMotor CoordinationKinematic AnalysisBehavioral AssaysOpen Source ToolsFootprint Patterns

Related Articles