Методическая статья

Цельный препарат на основе метанола для исследования ганглиозных клеток сетчатки

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65222

⸱

7 апреля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

В этой статье

Краткое содержание

Метанол можно использовать в качестве вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения, что полезно для исследования ганглиозных клеток сетчатки.

Аннотация

Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs), которые являются проекционными нейронами сетчатки, распространяют внешнюю визуальную информацию в мозг. Патологические изменения в RGC имеют тесную связь с многочисленными дегенеративными заболеваниями сетчатки. Цельное иммуноокрашивание сетчатки часто используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки развития и патологических состояний сетчатки. При некоторых обстоятельствах некоторые ценные образцы сетчатки, например, от трансгенных мышей, может потребоваться хранить в течение длительного периода времени, не влияя на морфологию или количество RGC. Для получения достоверных и воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо использовать эффективную консервирующую среду. Здесь мы описываем действие метанола как вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения. Короче говоря, в процессе изоляции холодный метанол (-20 ° C) пипеткой наносится на поверхность сетчатки, чтобы помочь зафиксировать ткани и облегчить их проницаемость, а затем сетчатку можно хранить в холодном метаноле (-20 ° C) перед иммуноокрашиванием. Этот протокол описывает рабочий процесс выделения сетчатки и протокол хранения образцов тканей, что полезно и практично для исследования RGC.

Введение

Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) являются единственными проекционными нейронами в сетчатке, и они интегрируют и передают внешнюю визуальную информацию в мозг1. Многие нейродегенеративные заболевания, такие как глаукома и травматическая нейропатия зрительного нерва, характеризуются необратимым повреждением и потерей RGCs 2,3. Анализ морфологических и количественных изменений RGC является важным шагом в определении того, как развиваются и прогрессируют нейродегенеративные заболевания 4,5.

Непрямой иммунофлюоресцентный анализ является широко распространенным методом мониторинга распределения белков и подсчета клеток. В лабораторных условиях иммуноокрашивание сетчатки обычно используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки физиологических и патологических состояний сетчатки6. Наиболее распространенные маркеры, используемые для количественной оценки RGC во всей сетчатке, включают Brn3a, РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) и так далее 7,8. Характеристика количества и распределения RGC требует высококачественного цельного иммуноокрашивания сетчатки. Как правило, в протоколах иммуноокрашивания сетчатка погружается в химические фиксаторы перед инкубацией в антителах. Идеальные фиксаторы не должны изменять форму клеток, доступность или сродство эпитопов к антителам или линейные размеры ткани 9,10.

Из-за сложной структуры сетчатки такие проблемы, как хрупкость и складчатость сетчатки, а также некоторые общие трудности, включая усадку клеток и неясные ядра, могут возникать при изготовлении цельного патча сетчатки, что отрицательно сказывается на экспериментальных исследованиях. Кроме того, не все сетчатки подвергаются немедленному иммуноокрашиванию, особенно когда речь идет о сетчатке трансгенных мышей с дорогими ценами, которые имеют драгоценное происхождение, что требует сохранения дополнительных образцов сетчатки для дальнейшего использования.

Соответствующий фиксирующий раствор может быстро фиксировать ткань, избегать тканевого аутолиза, сохранять нормальную морфологию и структуру клеток ткани и сохранять антигенность белков и других веществ10. В настоящее время фиксация на основе формальдегида широко используется в различных тканях, включая разделенные сетчатки, гемисектированные наглазники и целые глазные яблоки10. Усадка тканей и морфологическое изменение клеток являются двумя критическими проблемами, возникающими после погружения в формальдегид11. Кроме того, все чаще появляются модифицированные составы фиксации, чтобы максимизировать сохранение первоначальных свойств сетчатки и клеток-мишеней 9,10. Различные методы фиксации сетчатки могут по-разному влиять на структуру сетчатки, иммуногенность белка, возбуждение флуоресценции и цикл гашения затуханиязатухания 12,13. Сетчатки, зафиксированные раствором Дэвидсона, более морфологически интактны по сравнению с сетчатками, фиксированными формалином, но раствор Дэвидсона менее совместим с некоторыми антителами, такими как ионизированная микроглиальным маркером кальций молекула адаптера 112. Учитывая хрупкую природу сетчатки, исследователи, естественно, задаются вопросом, изменится ли целостность сетчатки, а также свойства и морфология клеток-мишеней после длительного хранения. Однако о возможном влиянии фиксирующего раствора на морфологию клеток сетчатки и RGC после хранения в течение нескольких месяцев сообщалось редко. Оптимизация фиксации сетчатки имеет решающее значение для оценки и сохранения RGC.

Мы приводим подробное описание надежного и технически простого метода, который мы используем для окрашивания сетчатки мыши целиком. Наш метод подчеркивает надлежащую подготовку и хранение сетчатки для исследования RGC, принимая во внимание необходимость длительного хранения ткани сетчатки, а также специфические аспекты образования или деградации флуорофоров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все действия выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Все использованные мыши C57BL / 6J были получены из Центра лабораторных животных Уханьского университета, и все связанные с этим эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Уханьского университета. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания мышей.

1. Энуклеация и фиксация глаз

  1. Усыпьте мышей удушьем углекислым газом и осторожно энуклеируйте глазное яблоко с помощью беззубого пинцета.
  2. Промойте глазное яблоко один раз в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
  3. Проколите глазное яблоко иглой шприца в роговице под микроскопом (окуляр WF: 10x/22; объектив непрерывного увеличения: 0,67x-4,5x), чтобы ускорить фиксацию в глазном яблоке и повысить эффективность фиксации.
  4. Перенос на 24-луночную пластину, содержащую 4% параформальдегида (ПФА).
  5. Зафиксируйте глазное яблоко в 4% PFA в течение 45 минут, а затем переведите его в 1x PBS, чтобы немедленно удалить излишки PFA (промыть три раза, 5 минут / раз).

2. Изоляция и уплощение сетчатки

  1. Перенесите глазное яблоко на предметное стекло и поместите его под препарирующий микроскоп (окуляр WF: 10x/22; объектив с непрерывным увеличением: 0,67x-4,5x).
  2. Держите щипцы в одной руке и используйте их, чтобы зажать край роговицы, чтобы предотвратить движение глазного яблока. Другой рукой держите рассекающие ножницы и разрежьте роговицу на глубину примерно 1 мм через корнеосклеральный лимб. Удалите хрусталик и стекловидное тело.
  3. Держите диск зрительного нерва в центре и с помощью рассекающих ножниц разрезайте сетчатку радиально вдоль четырех квадрантов, достигая примерно 2/3 радиуса сетчатки.
  4. Зажмите один из краев склеры с помощью зубчатых щипцов. Другой рукой придерживайте край склеры беззубыми щипцами и двигайтесь от того места, где склера фиксируется зубчатыми щипцами, к основанию склеры. Аккуратно очистите сетчатку.
  5. Удалите PBS с помощью пипетки (200 мкл), чтобы промыть и смочить сетчатку, а затем удалите излишки PBS небольшим кусочком впитывающей бумаги. При необходимости аккуратно разгладьте сетчатку с помощью небольшой щетинной щетки.
  6. Медленно пипеткой наносите холодный метанол (предварительно охлажденный в морозильной камере с температурой -20 ° C) по каплям на внутреннюю поверхность сетчатки (объем метанола не фиксируется, пока сетчатка может быть полностью покрыта метанолом). Сетчатка белеет и развивается повышенная живучесть.
  7. Аккуратно сплющите сетчатку и удалите загрязнения, такие как остаточные пигментные мембраны и стекловидное тело, с помощью небольших щетинистых щеток. Инвертируйте сетчатку с помощью небольших щетинных щеток и повторите вышеупомянутый процесс.
  8. Перенесите обработанную метанолом сетчатку в лунку с 24-луночной пластиной и держите ее пропитанной метанолом.
  9. Храните его при температуре -20 ° C в течение 1-2 ч для немедленного иммуноокрашивания или оставьте сетчатку в метаноле и храните при -20 ° C для длительного хранения.
  10. Удалите метанол из 24-луночной пластины и промойте сетчатку 1x PBS.

3. Иммунофлюоресцентное окрашивание РКК

  1. Осторожно перенесите сетчатку на 24-луночную гемагглютинирующую пластину с помощью пластиковой пипетки Пастера и заблокируйте 5% PBS-TX-BSA (5 г порошка бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 100 мл 1x раствора PBST; PBST образуют путем добавления 10 мл Triton X-100 к 2000 мл 1 x PBS) при комнатной температуре в течение 4 часов или на ночь при 4 ° C. Держите ганглий стороной вверх.
  2. Удалите PBS-TX-BSA и инкубируйте сетчатку при 4 ° C в течение 48-96 часов, добавляя 100 мкл выбранного первичного антитела (антитело морской свинки против RBPMS) с использованием разведения 1:400.
  3. Удалите первичное антитело и промойте сетчатку три раза (по 20 минут каждый) 1x PBS, встряхивая при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте сетчатку с легким встряхиванием в течение ночи при 4 ° C со 100 мкл соответствующего вторичного антитела (см. Таблицу материалов), цианина Cy3 affiniPure осла против морской свинки IgG (H + L), используя разведение 1:400.
  5. Промойте сетчатку 1x PBS три раза (по 20 минут каждый).
  6. Положите сетчатку плашмя на предметное стекло слоем ганглиозных клеток вверх, капните соответствующее количество антифлуоресцентного гасящего агента вокруг сетчатки с помощью пипетки и накройте предметное стекло покровным стеклом (будьте осторожны, чтобы не было пузырьков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить соответствующее количество антифлуоресцентного гасителя, убедитесь, что он покрывает всю сетчатку. После этого накройте предметное стекло, не позволяя сетчатке плавать и легко двигаться.
  7. Запечатайте предметное стекло со всех сторон герметизирующим средством, чтобы предотвратить его перемещение. Храните образцы при температуре -20 ° C и защищайте их от света.
  8. Изображение сетчатки с помощью флуоресцентного/конфокального микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После рассечения сетчатка должна быть похожа на плоский четырехлистный клевер. В этом исследовании, используя протокол, описанный выше, сетчатка побелела после добавления метанола (рис. 1). Между тем, сетчатка изменилась с мягкой на податливую и плоскую. Затем RGC были помечены анти-RBPMS8. Четыре поля изображения были взяты в сетчатке (n = 3) с помощью конфокального микроскопа (окуляр: 10x; объектив: 40x). Репрезентативные виды визуализированных RGC сетчатки до перер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Фиксация является важным шагом для сохранения сетчатки, что может повлиять на любые последующие исследования RGC, основанные на морфологии. Успешная фиксация быстро фиксирует структуру и состояние сетчатки в момент воздействия на нее фиксирующей среды, что имеет решающее значение для дальнейшего анализа. Хотя формальдегид считается одним из наиболее распространенных фиксирующих агентов для фиксации и сохранения тканей и клеток, формальдегид сам по себе не всегда хорошо работает в качестве оптимального химического фиксато...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам не известно о каких-либо связях, членстве, финансировании или финансовых холдингах, которые могли бы повлиять на объективность этого исследования.

Благодарности

Эта работа финансировалась Проектом открытия ключевых лабораторий провинции Хубэй (грант No 2021KFY055), Фондом естественных наук провинции Хубэй (грант No 2020CFB240) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (грант No 2042020kf0065).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночный кластер клеточных культурCostarEyeball Fixation
24-луночный гемагглютинаторный планшетLabedit CompanyИнкубационные антитела
Адгезионный микроскоп слайдыCitotestИли аналогичный
антифлуоресцентный гасящий монтантServicebioG1401Замедление флуоресцентного гашения
BSA (бычий сывороточный альбумин)ServicebioGC305010Блокирующий реагент
Конфокальный микроскопOLYMPUSApply объектив 40x
Изогнутые ножницыJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Инструменты для препарирования
Препарирующий микроскопRWD Life science Co., LTD 77001SИнструменты для препарирования
ЩипцыJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Инструменты для препарирования
МетанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20210624GC≥ 99.5%
Лак для ногтейSecheViteГерметизирующее средство
Иглы Шанхай Киндли Энтерпрайзс Девелопмент Груп Ко., Лтд.Ускорить фиксацию
Раствор параформальдегидаServicebioG1101Фиксация глазного яблока
PBS (фосфат буферизованный физиологический раствор pH 7,4)ServicebioG0002Промыть глазное яблоко 
Первичное антитело: анти-РНК-связывающий белок морской свинки с множественным сплайсингом (RBPMS)PhosphoSolutionsCat. #1832-RBPMSДля иммунофлуоресценции. Используется в 1:400
Вторичное антитело: Cy3 affiniPure ослик против морской свинки IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148Для иммунофлюоресценции. Использовано в 1:400
Прямые ножницыJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Инструменты для препарирования

Ссылки

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
  3. Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).
  4. Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
  5. Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
  6. Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).
  7. Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  8. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  9. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  10. Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
  11. Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
  12. Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
  13. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  14. Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
  15. Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59(2012).
  16. Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).
  17. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
  18. Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
  19. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
  20. Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
  21. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  22. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи