Легкий имплантат привода для хронической записи тетрода у молодых мышей

Мозг претерпевает масштабные изменения в критические периоды развития в детском и подростковом возрасте ^1,2,3. Многие неврологические и психические заболевания, включая аутизм и шизофрению, впервые проявляются поведенчески и биологически в этот период развития мозга у подростков и^{подростков 4,5,6}. Хотя многое известно о клеточных, синаптических и генетических изменениях, которые происходят на ранних этапах развития, сравнительно мало известно о том, как изменяются процессы на уровне цепей или сетей в течение этого временного окна. Важно отметить, что функция мозга на уровне цепи, которая в конечном итоге лежит в основе сложного поведения, памяти и познания, является непредсказуемым, эмерджентным свойством клеточной и синаптической функции 7,8,9,10. Таким образом, чтобы полностью понять функции мозга на сетевом уровне, необходимо непосредственно изучить нейронную активность на уровне интактной нейронной цепи. Кроме того, чтобы определить, как активность мозга изменяется на протяжении всего прогрессирования нервно-психических расстройств, крайне важно изучить сетевую активность в достоверной модели заболевания в течение определенного временного окна, когда проявляются поведенческие фенотипы заболевания, и отслеживать наблюдаемые изменения по мере их сохранения во взрослой жизни.

Одним из наиболее распространенных и мощных научных модельных организмов является мышь с большим количеством уникальных генетических штаммов, которые моделируют нарушения развития нервной системы с возрастным началом поведенческих и/или мнемонических фенотипов 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Несмотря на то, что сложно соотнести точные моменты развития между мозгом человека и мышей, морфологические и поведенческие сравнения показывают, что мыши p20-p21 представляют человеческий возраст 2-3 года, а мыши p25-p35 представляют человеческий возраст 11-14 лет, при этом мыши, вероятно, достигают эквивалента развития 20-летнего взрослого человека к p60^{3, 22}. Таким образом, чтобы лучше понять, как развивается ювенильный мозг, и определить, как нейронные сети мозга становятся дисфункциональными при таких заболеваниях, как аутизм или шизофрения, было бы идеально напрямую контролировать активность мозга in vivo у мышей в возрасте от 20 до 60 дней.

Тем не менее, фундаментальной проблемой в мониторинге активности мозга на ранних этапах развития у мышей является небольшой размер и относительная слабость молодых мышей. Хроническая имплантация электродов, которая необходима для лонгитюдных исследований развития мозга, обычно требует большого, громоздкого корпуса для защиты тонких электродных проводов и интерфейсных плат^23,24, а имплантаты должны быть прочно прикреплены к черепу мыши^, который тоньше и менее жесткий у молодых мышей из-за уменьшения окостенения. Таким образом, практически все исследования физиологии грызунов in vivo были проведены на взрослых людях из-за их относительного размера, прочности и толщины черепа. На сегодняшний день большинство исследований, изучающих физиологию мозга ювенильных грызунов in vivo, были проведены на крысах дикого типа, что обязательно ограничивает возможность экспериментального мониторинга функции мозга ювенильных особей в свободно ведущей модели расстройства человека 25,26,27,28,29,30.

В этой рукописи описывается новый корпус имплантата, процедура хирургической имплантации и стратегия послеоперационного восстановления для хронического изучения долгосрочной (до 4 и более недель) функции мозга in vivo молодых мышей в течение критического для развития временного окна (от p20 до p60 и далее). Процедура имплантации обеспечивает надежное, постоянное прикрепление электродов к черепам молодых мышей. Кроме того, конструкция микропривода легкая, так как этот микропривод весит ~ 4-6 г в полностью собранном виде, и из-за минимального уравновешивания, необходимого для компенсации веса имплантата, он не влияет на поведенческие характеристики молодых мышей во время типичных поведенческих парадигм.

Настоящее исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Юго-западного медицинского центра Техасского университета (протокол 2015-100867) и выполнено в соответствии с рекомендациями как учреждения, так и Национального института здравоохранения. Самцы и самки мышей C57/Bl6, использованные в настоящем исследовании, были имплантированы в p20 (вес 8,3-11,1 г на момент имплантации).

1. Проектирование и конструкция микропривода

1. Цифровое проектирование и печать микропривода (рис. 1)
   1. Загрузите шаблоны моделей микродисков (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
   2. Определите стереотаксические местоположения целевых областей мозга в соответствующем стереотаксическом атласе.
   3. Используя программное обеспечение для трехмерного автоматизированного проектирования (3D CAD), загрузите шаблон канюли микропривода (рис. 1B).
   4. При необходимости измените места выхода выходной канюли на модели канюли с микроприводом, чтобы нацелиться на нужные области мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая экструзия отверстия канюли должна быть не менее 2 мм в длину, чтобы гарантировать, что тетрод выйдет из отверстия канюли, направленного прямо на цель. Шаблон канюли с микроприводом предназначен для двустороннего воздействия на переднюю поясную кору (один тетрод на полушарие), область гиппокампа CA1 (четыре тетрода на полушарие) и область гиппокампа CA3 (два тетрода на полушарие), при этом один эталонный тетрод на полушарие расположен в белом веществе над областью гиппокампа CA1.
   5. При необходимости модифицируйте корпус микропривода (рис. 1A) для размещения крепления платы электронного интерфейса (EIB).
   6. Распечатайте корпус микронакопителя, канюлю, конус и крышку с высоким разрешением на 3D-принтере (в идеале с разрешением лучше 25 мкм) и подготовьте печатные материалы в соответствии с протоколами производителя. Используйте смолы для принтеров с высокой жесткостью.
2. Сборка нестандартных винтов и креплений (рис. 2A, B)
   1. Используя программное обеспечение 3D CAD, загрузите модели винтовых креплений (рис. 1E).
   2. Распечатайте винтовые насадки с высоким разрешением на 3D-принтере (в идеале с разрешением не менее 25 мкм) и подготовьте печатные материалы в соответствии с протоколами производителя. Используйте смолы для принтеров с высокой жесткостью.
   3. Прикрепите винтовые крепления к каждому винту с продвижением тетрода (рис. 1F) (винты, продвигающие тетрод, изготавливаются по индивидуальному заказу в механическом цехе перед изготовлением микропривода).
      1. Прикрепите к каждому винту по два винтовых крепления, одно над коньком, а другое под гребнем. Убедитесь, что нижняя часть каждого винтового крепления соприкасается с гребнем. Скрепите винтовые насадки гелем цианоакрилатом.
      2. После крепления убедитесь, что винтовые крепления не перемещаются по продольной оси винта, а свободно вращаются с минимальным сопротивлением.
3. Сборка корпуса микропривода (рис. 2C, D)
   1. Тонкими, острыми ножницами разрежьте большие полиимидные трубки (наружный диаметр: 0,2921 мм, внутренний диаметр: 0,1803 мм) на секции длиной ~6 см.
   2. Пропустите большие полиимидные секции через выходные отверстия на канюле микропривода так, чтобы каждая трубка выходила за нижнюю часть канюли на несколько миллиметров.
   3. Используя чистую иглу 30 г, прикрепите полиимид к канюле, нанеся небольшое количество жидкого цианоакрилата. Следите за тем, чтобы цианоакрилат не попал внутрь полиимидной трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капание жидкого цианоакрилата в канюлю через верхнюю часть корпуса привода может ускорить этот процесс, но позже потребует повторной очистки направляющих отверстий с помощью сверла с тонким наконечником.
   4. Пропустите большие полиимидные трубки из верхней части канюли микропривода через соответствующие большие полиимидные отверстия в корпусе микропривода.
   5. Медленно сдвиньте канюлю микропривода и корпус микропривода вместе, пока они не окажутся рядом и выступы крепления канюли/корпуса не сблокируются. Будьте осторожны, чтобы не перегнуть и не повредить полиимидные трубки в процессе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая полиимидная трубка должна плавно проходить от нижней части канюли через верхнюю часть корпуса микропривода. Небольшой изгиб является нормальным, но чрезмерный изгиб полиимидной трубки может деформировать тетрод и помешать его прохождению прямо в мозг.
   6. Соедините корпус микропривода и канюлю микропривода вместе с помощью цианоакрилата.
   7. Используя новое острое лезвие бритвы, отрежьте большие концы полиимидных трубок, которые выдавливаются из нижней части выходных отверстий канюли. Убедитесь, что разрез находится точно у основания канюли, чтобы трубки и дно канюли были на одном уровне друг с другом.
   8. Острыми ножницами разрежьте большую полиимидную трубку чуть выше края внутреннего обода корпуса привода под углом ~45°.
4. Загрузка собранных нестандартных винтов (рис. 2E)
   1. Вкрутите каждый собранный нестандартный винт во внешние отверстия корпуса микропривода. Убедитесь, что направляющая стойка винта проходит через большое отверстие в винтовых креплениях. Продвигайте каждый винт полностью, пока он не перестанет продвигаться дальше. Рекомендуется предварительно смазывать винты минеральным маслом или консистентной смазкой для осей.
   2. Используя очень острые ножницы, разрежьте небольшие полиимидные трубки (внешний диаметр: 0,1397 мм, внутренний диаметр: 0,1016) на секции длиной ~ 4 см.
   3. Пропустите небольшие полиимидные секции через большие полиимидные трубки, уже установленные в микроприводе. Убедитесь, что излишки небольших полиимидных трубок выступают сверху и снизу каждой большой полиимидной трубки.
   4. Прикрепите маленькие полиимидные трубки к винтовым насадкам с помощью цианоакрилата, стараясь не допускать попадания цианоакрилата ни в большие, ни в маленькие полиимидные трубки.
   5. Используя новое острое лезвие бритвы, отрежьте маленькие концы полиимидных трубок, которые выдавливаются из нижней части отверстий канюли. Убедитесь, что разрез находится точно у основания канюли и что разрез чистый, и ничто не блокирует отверстие полиимидной трубки.
   6. Острыми ножницами отрежьте верхнюю часть маленького полиимида на несколько миллиметров выше верхней части винтового крепления под углом ~45°. Убедитесь, что разрез чистый, ничто не блокирует отверстие полиимидной трубки.
5. Загрузка тетродов
   1. Подготовьте тетроды (~6 см в длину), используя ранее описанные способы³¹.
   2. Используя щипцы с керамическими или резиновыми наконечниками, осторожно пропустите тетрод через одну из маленьких полиимидных трубок, оставив ~ 2 см выступающим из верхней части маленькой полиимидной трубки.
   3. Прикрепите тетрод к верхней части небольшой полиимидной трубки с помощью жидкого цианоакрилата, стараясь не соединять маленькие и большие полиимидные трубки вместе в процессе.
   4. Втяните винт до тех пор, пока он не окажется в верхней части диска.
   5. Возьмитесь за тетродную проволоку, выступающую из нижней части привода, и осторожно перегибайте ее в том месте, где она выходит из канюли.
   6. Полностью вставьте винт обратно в диск.
   7. Используя очень острые ножницы, отрежьте тетродную проволоку чуть выше излома. Под микроскопом убедитесь, что срез чистый и что металл всех четырех тетродов обнажен.
   8. Втяните винт до тех пор, пока тетрод не закрепится внутри канюли.
   9. Повторите шаги 1.5.2-1.5.8 для всех винтов.
   10. Прикрепите EIB к опорной платформе EIB с помощью небольших ювелирных винтов.
   11. Подключите каждый электрод каждого тетрода к соответствующему порту на EIB.
6. Подготовка микронакопителя к операции
   1. Электрически пластинчатые тетроды для уменьшения электрического импеданса используют ранее описанные способы³¹.
   2. После нанесения покрытия убедитесь, что каждый тетрод размещен в канюле таким образом, чтобы кончик тетрода находился на одном уровне с дном каждого отверстия канюли.
   3. Сдвиньте конус микропривода вокруг готового микропривода. Прикрепите крышку микропривода к конусу микропривода, вставив полюс крепления конуса в порт крышки.
   4. Сориентируйте конус так, чтобы разъемы EIB свободно проходили через сквозные отверстия соединения EIB, когда крышка закрыта, и приклейте конус на место цианоакрилатом, расположенным вокруг основания конуса, следя за тем, чтобы цианоакрилат не попал ни в одно из выходных отверстий канюли. Снимите крышку.
   5. Тщательно заполните каждое отверстие канюли стерильным минеральным маслом, чтобы предотвратить попадание биологических жидкостей в полиимидные отверстия после хирургической имплантации.
   6. Тщательно смажьте основание канюли стерильным вазелином. Это послужит барьером для предотвращения попадания химических агентов (например, стоматологического цемента) в открытый мозг во время операции.
   7. Взвесьте полностью собранный микропривод, крышку и четыре костяных винта, чтобы получить равновесный противовес.
   8. При желании, перед операцией, выдавите тетроды на расстоянии, подходящем для достижения целевых областей мозга, как только диск окажется на одном уровне с черепом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хирургической имплантацией стерилизуйте имплантат с помощью газовой стерилизации в оксиде этилена (500-1200 мг / л, 2-4 часа).  Все костные винты и хирургические инструменты должны быть стерилизованы в автоклаве (121 ° C, 30 минут).

2. Хирургическая имплантация

1. Обезболивание мыши и установка ее в стереотаксический аппарат
   1. Поместите мышь в небольшую коробку с достаточным пространством для перемещения и обезболите мышь 3-4% изофлураном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие анестетики, но следует соблюдать осторожность из-за возраста, размера и веса молодого мыши.
   2. Как только мышь перестает реагировать (нет реакции на защемление хвоста, скорость вентиляции ~ 60 вдохов в минуту), выньте ее из коробки и быстро установите на стереотаксический аппарат.
   3. Быстро наденьте стереотаксическую маску на морду мыши и поддерживайте анестезию на уровне 1-3% изофлурана. Нанесите любое одобренное ветеринарами обезболивающее, такое как бупренорфин с замедленным высвобождением (0,05-0,5 мг / кг подкожно) или противовоспалительные средства, такие как карпрофен (5-10 мг / кг подкожно), до первоначального хирургического разреза.
   4. Полностью закрепите голову мыши в стереотаксическом аппарате с помощью амбушюр. Убедитесь, что череп ровный и неподвижный, не оказывая ненужного давления на ушные каналы мыши. Из-за ограниченного окостенения ювенильных костей черепа возможно необратимое повреждение во время фиксации головы.
2. Подготовка мыши к операции и обнажение черепа
   1. Защитите глаза мыши, нанеся небольшой объем синтетического слезного геля на каждый глаз и покрыв каждый глаз автоклавным пластырем фольги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтетические слезы сохранят глаза влажными, в то время как фольга предотвратит долгосрочное повреждение любого источника света. Предпочтительны более густые синтетические слезные растворы, поскольку они также могут служить барьером для непреднамеренного введения других потенциально токсичных хирургических растворов (этанола, стоматологического акрила и т. д.) в глаза.
   2. Используя стерильные ватные тампоны, нанесите крем для удаления волос на операционную область, чтобы удалить волосы с кожи головы. Будьте осторожны, чтобы крем не попал в глаза. После удаления волос наденьте стерильную драпировку на кожу головы, чтобы закрепить операционную область.
   3. Используя стерильные тампоны с ватными наконечниками, очистите кожу головы тремя последовательными промывками раствором повидон-йода (10%), а затем изопропиловым спиртом (100%).
   4. С помощью стерильного скальпеля или тонких ножниц удалите кожу головы.
   5. Используя стерильные ватные тампоны и стерильные растворы физиологического раствора (0,9% NaCl) и перекиси водорода, тщательно очистите череп.
   6. Определите брегму и, используя стереотаксический аппарат, тщательно отметьте перманентным маркером целевые места записи на черепе.
3. Открытие отверстия канюли и прикрепление костных якорей
   1. Удалите череп, накладывая места записи. # Из-за тонкости черепа в этом возрасте разрезают череп лезвием скальпеля; Это устраняет необходимость использования дрели, которая может повредить нижележащую твердую мозговую оболочку. Держите открытую твердую мозговую оболочку влажной с помощью стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl) или стерильного минерального масла. Не удаляйте и не прокалывайте твердую мозговую оболочку на этом этапе, так как у молодых мышей она достаточно тонкая, чтобы тетроды могли пройти через нее на будущих этапах.
   2. Тщательно просверлите пилотные отверстия для четырех костяных шурупов.
      1. Поместите костные винты в крайние боковые и ростральные или каудальные части черепа, где кость самая толстая, а костные винты находятся достаточно далеко от имплантата микропривода. Для костных винтов используйте стерильные ювелирные винты (например, резьба UNM 120, головка 1.5 мм).
      2. Плотно намотайте один костный винт тонким проводом с высокой проводимостью, который будет служить заземлением и будет прикреплен к EIB на шаге 2.4.6.
   3. С помощью лезвия скальпеля или осторожно с помощью сверла забейте череп рядом с местами отверстий для костяных винтов. Скоринг важен для обеспечения достаточно шероховатой поверхности для связывания жидкого цианоакрилата на этапе 2.3.5.
   4. Используя стерильную отвертку и стерильный винтовой зажим, вставьте каждый стерильный костный винт на место, стараясь не проткнуть нижележащую твердую мозговую оболочку.
   5. Используя стерильную иглу весом 30 г, поместите жидкий цианоакрилат вокруг каждого костного винта. Это эффективно утолщает череп, к которому прикреплены костные винты. Следите за тем, чтобы цианоакрилат не попадал в открытую твердую мозговую оболочку над местами записи.
4. Опускание и крепление микропривода (рис. 2G)
   1. Установите готовый микропривод на стереотаксический аппарат, который будет осторожно опущен на череп мыши. Убедитесь, что канюля микропривода будет находиться в соответствующих координатах при опускании.
   2. Опускайте микропривод медленно, двигаясь только в дорсальном/вентральном направлении. Опустите микропривод с тетродами, уже выдвинутыми из отверстий канюли (шаг 1.6.6), чтобы визуализировать их вход в мозг; Любое медиальное/латеральное или ростральное/каудальное движение, когда тетроды касаются мыши, может согнуть тетроды и привести к тому, что они пропустят свой конечный пункт назначения.
   3. После того, как микропривод полностью опущен, убедитесь, что основание канюли соприкасается с черепом/твердой мозговой оболочкой. Слой вазелина и/или минерального масла будет служить барьером для покрытия открытой твердой мозговой оболочки. При необходимости добавьте стерильный вазелин или стерильный костный воск, чтобы покрыть излишки обнаженной твердой мозговой оболочки.
   4. Удерживая микропривод на месте с помощью стереотаксического аппарата, покройте череп зубным цементом, чтобы прикрепить основание микропривода к имплантированным костным винтам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоматологический цемент должен полностью покрывать все костные винты и должен закрывать выступ анкерного зубного цемента на канюле микропривода.
   5. Пока зубной цемент схватывается, тщательно придайте ему форму, чтобы предотвратить острые углы или края, которые могут повредить мышь или повредить микродиск. Убедитесь, что стоматологического цемента достаточно для удержания микропривода, но исключите излишний стоматологический цемент, который добавит ненужный вес.
   6. Осторожно проденьте заземляющий провод через микропривод и прикрепите его к соответствующему слоту на EIB.
   7. Как только зубной цемент полностью застынет, осторожно отсоедините микропривод от стереотаксического аппарата. Установите крышку на микропривод.
   8. Стерильным ватным тампоном и стерильным физиологическим раствором очистите мышь.
   9. Стерильным ватным тампоном нанесите тонкий слой мази с антибиотиком на любую открытую кожу головы рядом с местом имплантации.
   10. Снимите фольгу с глаз мыши.
   11. Извлеките мышь из стереотаксического аппарата, позаботившись о том, чтобы выдержать дополнительный вес микропривода, когда мышь транспортируется в чистую клетку.

3. Послеоперационное восстановление

1. Немедленное выздоровление
   1. Перед операцией подготовьте систему противовеса, подключив трубу из ПВХ диаметром 0,75, как показано на рисунке 2G. Один рычаг системы проходит через отверстия, просверленные в крышке клетки, второй рычаг опирается на верхнюю часть крышки клетки, а третий рычаг выходит над клеткой и за ее пределы. Крайняя верхняя рука закрыта.
   2. Аккуратно прикрепите микропривод к системе противовесов (рис. 2G-I) и используйте противовес, идентичный весу микропривода и костных винтов. Проведите прочную нить или леску от разъема, прикрепленного к EIB, через три рычага системы противовеса к грузу противовеса, который висит над самым верхним рычагом.
   3. Убедитесь, что противовес надежно подключен к EIB микропривода и что имеется достаточная линия, чтобы дать мыши полный доступ ко всей клетке.
   4. Добавьте богатый питательными веществами гель в клетку вместе с увлажненным нормальным кормом для грызунов, чтобы обеспечить регидратацию и восстановление.
   5. Следите за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от хирургической анестезии.
2. Долгосрочное восстановление
   1. В любое время, когда микропривод не подключен к записывающему оборудованию, убедитесь, что микропривод поддерживается системой противовеса. Со временем уменьшайте противовес, но никогда не снимайте его полностью, чтобы избежать непредвиденной нагрузки на мышь или крутящего момента на костяные винты.
   2. Чтобы предотвратить повреждение имплантата и системы противовеса, разместите мышь без возможности прямого взаимодействия с другими мышами на время эксперимента.
   3. Обеспечьте богатый питательными веществами гель в течение как минимум 3 дней после операции, после чего будет достаточно одной твердой пищи.
      1. Из-за требований к накладным расходам системы противовесов не подавайте еду и воду в воздушную проволочную сетку; Положите еду на пол клетки и подайте воду через стенку клетки. Чтобы предотвратить порчу, полностью заменяйте продукты ежедневно.
   4. Ежедневно следите за тем, чтобы мышь имела свободный доступ ко всей клетке, а противовес надежно и прочно прикреплен к микродиску.

Описанный выше протокол был использован для одновременной регистрации сигналов локального потенциала поля и отдельных единиц из нескольких областей мозга у мышей, при этом ежедневные записи проводились у одних и тех же мышей от p20 до p60. Здесь представлены репрезентативные электрофизиологические записи двух мышей и гистология после эксперимента, демонстрирующая окончательные места записи.

Хирургическая имплантация микропривода мышам p20
Микропривод (рис. 1) был сконструирован (рис. 2) и хирургически имплантирован в мышь p20, как описано выше. Сразу после операции мышь была прикреплена к системе противовеса (рис. 2G-I) и ей позволили восстановиться. Как только мышь стала полностью мобильной, микропривод был подключен к системе электрофизиологической записи in vivo. Кабели, соединяющие микропривод с записывающей аппаратурой, были подвешены над мышью. Электрофизиологические записи (32 кГц) были получены по всем каналам в течение 1 часа, в то время как мышь вела себя естественно в своей домашней клетке. После записи мышь была отключена от системы записи, снова подключена к системе противовеса и возвращена в виварий со свободным доступом к воде и корму.

Ежедневная запись нейронной активности
Электрофизиологические записи были получены ежедневно в течение нескольких недель, чтобы обеспечить хронический мониторинг одной и той же области мозга в критических окнах развития p20-p60. Необработанные потенциалы локального поля образца (LFP) из хронических записей показаны на рисунке 3A,C. Изолированные единичные блоки были одновременно получены из нескольких тетродов (рис. 3B). Блоки с похожими формами сигналов были идентифицированы в течение нескольких дней (рис. 3B, посередине и справа), но из-за потенциального дрейфа записывающего электрода было невозможно окончательно утверждать, что один и тот же блок был идентифицирован в течение нескольких дней. У отдельной мыши, имплантированной в p20 и регистрируемой ежедневно в течение нескольких недель, нейронная активность была исследована на тетроде, нацеленном на дорсальную область CA1. Пульсация большой амплитуды и хорошо изолированные единичные единицы были идентифицированы в каждый день регистрации (рис. 4). Эти данные указывают на то, что стабильные, высококачественные электрофизиологические записи in vivo могут быть получены от одной и той же мыши на ранних этапах развития.

Гистологическое подтверждение мест регистрации и влияния хронической имплантации на развитие
После последнего дня записи мышь была тщательно анестезирована с помощью изофлурановой анестезии с последующей смертельной инъекцией пентобарбитала натрия, и ток был пропущен через наконечники электродов для создания небольших повреждений в местах записи. Гистологическое разрезание мозга мыши после эксперимента позволило визуализировать конечные места записи (рис. 5A, B). В отдельной когорте три самца и три самки мышей были хирургически имплантированы на p20, как описано выше. Равное количество однопометников оставалось неимплантированным и содержалось в одинаковых условиях содержания. Мыши были принесены в жертву на p62 (через 6 недель после операции для имплантированной когорты). Черепа были тщательно очищены, и были проведены внешние измерения расстояния от брегмы до лямбды (рис. 5C, вверху слева) и внешней максимальной ширины черепа на лямбде (рис. 5C, вверху справа). Разрез был сделан вдоль средней линии черепа, и половина черепа была удалена, чтобы иссечь мозг для измерения массы (рис. 5C, внизу справа). Высота полости черепа при брегме измерялась по неповрежденной половине черепа (рис. 5C, внизу слева). Ни один показатель существенно не различался между имплантированными и неимплантированными когортами (тест Уилкоксона), что указывает на то, что долгосрочная имплантация, начиная с p20, не оказывает серьезного влияния на естественное развитие черепа или объем мозга.

Рисунок 1: Компоненты микропривода. Трехмерная визуализация (A) корпуса микропривода, (B) канюли, (C) конуса, (D) крышки, (E) винтовых креплений и (F) винта, продвигающего тетрод. Указаны критические особенности каждого компонента. Детали измерений могут быть извлечены из файлов моделей, доступных по адресу https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Конструкция микропривода . (A) Вид сбоку и (B) вид сверху винта, продвигающего тетрод, с соединенными верхним и нижним винтовыми креплениями. (C) Вид сбоку и (D) вид сверху на микропривод с прикрепленным корпусом и канюлей и большой полиимидной трубкой, проходящей через каждое отверстие канюли и обрезанной до дна канюли. (E) Вид сбоку на микропривод с винтами и небольшими полиимидными трубками на месте. Верхушки небольших полиимидных трубок обрезаются непосредственно перед загрузкой тетрода. (F) Завершенный микропривод, прикрепленный к стереотаксическому аппарату. Защитный конус, который обычно окружает микродиск, был удален в целях визуализации. Обратите внимание, что некоторые винтовые крепления были напечатаны черной смолой для этого микронакопителя. g) система поддержки противовесов. (З) Вид сбоку и (I) сверху клетки для мыши с прикрепленной системой поддержки противовеса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные электрофизиологические записи. Мышь p20 была имплантирована с микроприводом, как описано выше. Начиная с p21 и каждый день после этого в течение 2 недель, мышь прикрепляли к записывающему аппарату, и нейронная активность регистрировалась в течение не менее 1 часа. (A) Необработанные записи потенциала локального поля (LFP) с двустороннего (L = слева; R = справа) передняя поясная кора (ACC), область гиппокампа CA3 (CA3) и область гиппокампа CA1 (CA1). Данные собирались каждый день; Для наглядности отображаются только данные за нечетные дни. Все следы были взяты в периоды неподвижности в домашней клетке. Масштабная линейка: 1 мВ, 2 с. (B) Репрезентативные одиночные блоки, выделенные из области гиппокампа CA3 (слева) и CA1 (справа) для записей на панели A. Все необработанные сигналы на каждом электроде показаны черным цветом; Среднее значение выделено красным цветом. Масштабная линейка: 50 мкВ, 0,2 мс. (C) Репрезентативные необработанные следы LFP для каждого 10-го дня до последнего дня записи при p60 для второй мыши, имплантированной в p20. Данные собирались каждый день; Для наглядности отображаются только данные за каждый 10-й день. Все следы были взяты в периоды неподвижности в домашней клетке. Масштабная линейка: 1 мВ, 2 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Стабильность хронических записей. Мышь p20 была имплантирована с микроприводом, как описано выше. Начиная с p21 и далее в течение 4 недель, мышь прикрепляли к записывающему аппарату, и нейронная активность регистрировалась в течение не менее 1 часа. Показаны данные тетродов, нацеленных на дорсальный гиппокамп CA1. (A) Необработанный (вверху) и отфильтрованный пульсациями (внизу) LFP для идентифицированных событий пульсации на p21, p30 и p40. Для идентификации событий пульсаций необработанный LFP был отфильтрован полосой в диапазоне от 125 Гц до 300 Гц, а события пульсации были идентифицированы как переходное увеличение мощности полосы пульсаций более чем на 3 стандартных отклонения выше среднего. Начало и конец каждой пульсации были определены как точка, когда мощность полосы пульсаций вернулась к среднему значению. Идентифицированная рябь показана красным цветом. Линейка масштабирования: 100 мс, сверху вниз: 1 000 мкВ, 140 мкВ, 1 800 мкВ, 180 мкВ, 9 000 мкВ, 1 200 мкВ, 10 000 мкВ, 1 000 мкВ. (B) Репрезентативная единица каждый день из целевого тетрода CA1 для записей на панели A. Все необработанные сигналы на каждом электроде показаны черным цветом; Среднее значение выделено красным цветом. Масштабная линейка 0,2 мс, сверху вниз: 50 мкВ, 100 мкВ, 100 мкВ. (C) Автокоррелограмма всех шипов для отдельных блоков на панели B. Эти данные демонстрируют стабильное размещение электродов в пирамидном слое гиппокампа в течение нескольких недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативная гистология и влияние на развитие черепа. Мышь p20 была имплантирована с микроприводом, как описано выше. После последнего дня записи на p60 в местах записи образовались электролитические поражения, и мозг был перфузирован 4% параформальдегидом. Для идентификации мест регистрации были изготовлены срезы размером 50 мкм. (A) Поражения CA1 и CA3 гиппокампа. Наконечник стрелки обозначает место записи CA3; двойной наконечник стрелки обозначает место записи CA1. Масштабная линейка: 0,5 мм. (B) Поражения в двусторонней АСС. Наконечники стрелок обозначают места записи ACC. Масштабная линейка: 0,5 мм. (C) Размеры черепа и измерения массы мозга мышей p62, имплантированных с помощью микропривода на p20 (серый), и неимплантированных однопометников (белый). p-значение критерия ранговой суммы Уилкоксона сообщается для каждого измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам раскрывать нечего.