Тест с физической нагрузкой для оценки функциональной эффективности сердечно-сосудистой системы свиньи

Summary

В настоящем протоколе описана модель теста с физической нагрузкой на крупных животных для оценки функциональной способности сердечно-сосудистой системы для оценки эффективности новых методов лечения в доклинических условиях. Это сравнимо с клиническим тестом с физической нагрузкой.

Abstract

Несмотря на прогресс в лечении, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Терапевтический ангиогенез на основе генной терапии является перспективным подходом к лечению пациентов со значительными симптомами, несмотря на оптимальную фармакологическую терапию и инвазивные процедуры. Тем не менее, многие многообещающие методы сердечно-сосудистой генной терапии не оправдали ожиданий в клинических испытаниях. Одним из объяснений является несоответствие между доклиническими и клиническими конечными точками, используемыми для измерения эффективности. В моделях на животных акцент обычно делался на легко поддающихся количественной оценке конечных точках, таких как количество и площадь капиллярных сосудов, рассчитанных по гистологическим срезам. Помимо смертности и заболеваемости, конечные точки в клинических испытаниях субъективны, такие как толерантность к физической нагрузке и качество жизни. Тем не менее, доклинические и клинические конечные точки, вероятно, измеряют различные аспекты применяемой терапии. Тем не менее, оба типа конечных точек необходимы для разработки успешных терапевтических подходов. В клиниках главной целью всегда является облегчение симптомов пациентов и улучшение их прогноза и качества жизни. Чтобы получить более точные прогностические данные доклинических исследований, конечные точки должны быть лучше согласованы с измерениями в клинических исследованиях. Здесь мы представляем протокол клинически значимого теста с физической нагрузкой на беговой дорожке у свиней. Это исследование направлено на: (1) обеспечение надежного теста с физической нагрузкой на свиньях, который можно использовать для оценки безопасности и функциональной эффективности генной терапии и других новых методов лечения, и (2) лучшее соответствие конечным точкам между доклиническими и клиническими исследованиями.

Introduction

Хронические сердечно-сосудистые заболевания являются основными причинами смертности и заболеваемости во всем мире ^1,2. Несмотря на то, что современные методы лечения эффективны для большинства пациентов, многие по-прежнему не могут извлечь выгоду из современных методов лечения, например, из-за диффузного хронического заболевания или сопутствующих заболеваний. Кроме того, у некоторых пациентов сердечные симптомы не облегчаются доступными методами лечения, и их сердечно-сосудистые заболевания прогрессируют, несмотря на оптимальную медикаментозную терапию³. Таким образом, существует очевидная необходимость в разработке новых вариантов лечения тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний.

За последние несколько лет были открыты новые молекулярные пути и способы манипулирования этими мишенями, что сделало генную терапию, клеточную терапию и другие новые методы лечения реалистичным вариантом лечения тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний⁴. Однако после многообещающих доклинических результатов многие сердечно-сосудистые приложения не оправдали ожиданий в клинических испытаниях. Несмотря на низкую эффективность в клинических испытаниях, несколько исследований установили хорошие профили безопасности новых методов лечения 5,6,7,8,9. Таким образом, внедрение новых методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний для пациентов потребует улучшенных подходов и лучших доклинических моделей, условий исследования и конечных точек в доклинических исследованиях, которые могут предсказать клиническую эффективность.

На животных моделях акцент обычно делался на легко поддающихся количественной оценке конечных точках, таких как количество и площадь капиллярных сосудов, рассчитанные по гистологическим срезам или параметрам визуализации левого желудочка в состоянии покоя и в условиях фармакологического стресса. В клинических испытаниях многие конечные точки были более субъективными, например, толерантность к физической нагрузке или облегчение симптомов⁴. Таким образом, вполне вероятно, что конечные точки в доклинических исследованиях и клинических испытаниях измеряют различные аспекты применяемой терапии. Например, увеличение количества кровеносных сосудов не всегда коррелирует с улучшением перфузии, сердечной функции или толерантности к физической нагрузке. Тем не менее, для разработки успешных терапевтических подходов необходимы оба типа конечных точек¹⁰. Тем не менее, главная цель всегда состоит в том, чтобы облегчить симптомы и улучшить прогноз и качество жизни пациента. Для достижения этой цели конечные измерения должны быть лучше согласованы между доклиническими и клиническими исследованиями⁴.

Кардиореспираторная пригодность отражает способность кровеносной и дыхательной систем обеспечивать кислород во время длительной физической активности и, таким образом, количественно определяет функциональную способность человека. Функциональная способность является ключевым прогностическим маркером, поскольку она является сильным независимым предиктором риска сердечно-сосудистой смертности и смертности от всех причин¹¹. Улучшение кардиореспираторной подготовленности связано со снижением риска смертности¹². Тесты с физической нагрузкой подходят для оценки аэробной работоспособности и реакции на лечение сердечно-сосудистых заболеваний. В зависимости от наличия, тесты проводятся на велоэргометре или беговой дорожке. Обычно используется постепенное увеличение рабочей нагрузки в минуту, а резких повышений избегают; Это приводит к линейной физиологической реакции. Наиболее важные переменные в тестах с физической нагрузкой включают общее время тренировки, достигнутые метаболические эквиваленты (MET), частоту сердечных сокращений и изменения на линии электрокардиограммы (ЭКГ) между комплексом QRS (зубцы Q, R и S) и зубцом T (сегмент ST). Клинические стресс-тесты имеют низкую стоимость и легко доступны¹³. По этим причинам стресс-тесты, такие как тест на 6-минутную ходьбу, широко используются в клиниках и также должны использоваться в доклинической оценке новых методов лечения.

Насколько нам известно, не существует хорошо описанных моделей крупных животных для оценки функциональной эффективности генной терапии или других новых методов лечения. Таким образом, клинически значимый тест с физической нагрузкой обеспечивает отличную перспективу для оценки эффективности этих новых методов лечения в доклинических условиях.

Protocol

Все эксперименты одобрены Советом по экспериментам на животных Университета Восточной Финляндии. В этом протоколе описывается клинически значимый тест с физической нагрузкой на беговой дорожке для свиней для оценки безопасности и эффективности новых методов лечения сердечных заболеваний. Для настоящего исследования использовались самки домашних свиней весом 25-80 кг. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Настройка беговой дорожки

1. Обустройте беговую дорожку так, чтобы животные могли двигаться только в одну сторону. Используйте ворота и люки, чтобы животные не могли вернуться назад. Поэтажный план беговой дорожки показан на рисунке 1, а пример беговой дорожки — на рисунке 2.
2. Убедитесь, что на беговой дорожке (см. Таблицу материалов) достаточно места для изменения наклона.
3. Убедитесь, что беговая дорожка имеет регулируемую ширину, чтобы животное не поворачивалось во время бега.
4. Используйте прозрачный пластик, чтобы сделать переднюю стенку беговой дорожки. Это не дает животному убежать от беговой дорожки, но при этом позволяет животному видеть сквозь стену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы животные могли видеть через переднюю стену, так как наш опыт показывает, что свиньи более мотивированы бежать, если они видят своих собратьев-свиней по другую сторону стены.
5. Разместите монитор ЭКГ и дефибриллятор (см. Таблицу материалов) рядом с беговой дорожкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фатальные аритмии могут возникнуть во время стресс-теста, особенно если у свиньи ишемия миокарда^14,15,16.
6. Убедитесь, что беговая дорожка включает в себя точку водоснабжения, где животные могут пить и охлаждаться после пробежки.

2. Период акклиматизации свиней перед испытанием

1. Размещайте животных в течение 2 недель перед началом экспериментов.
2. В течение 1-й недели акклиматизации убедитесь, что животные привыкли к своим дрессировщикам и новым условиям содержания, исключая беговую дорожку.
3. В течение 2-й недели акклиматизационного периода следите за тем, чтобы животные привыкли к беговой дорожке.
4. Начинайте приучивать так, чтобы животные освоились с беговой дорожкой. Во-первых, держите все ворота открытыми, чтобы животные могли свободно ходить по дорожке и исследовать окружающую среду.
5. Когда животные лучше освоились с трассой, включите беговую дорожку и дайте животному бегать в течение коротких периодов времени, например, 7 минут. Продолжительность бега должна увеличиваться ежедневно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте вознаграждать животных в период акклиматизации. Например, свиньи были вознаграждены несоленым попкорном в настоящем исследовании.

3. Тест с физической нагрузкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Свиньи должны голодать не менее чем за 2 часа до теста с физической нагрузкой или давать только крошечную порцию пищи перед пробежкой.

1. Включите беговую дорожку и установите наклон на 5%-10%.
2. Как только животное окажется на беговой дорожке, запускайте беговую дорожку со стартовой скоростью 2 км/ч.
3. Увеличивайте скорость на 0,5 км/ч каждые 60 с, пока не достигнете 5 км/ч. Продолжительность спектакля 15 мин.
4. В случае, если животное не может бежать все время на максимальной скорости, выполните следующие действия.
   1. Если свинья бежит не так быстро, как выбранная скорость, осторожно подтолкните ее со спины, так как это может дать животному ощущение, что ему нужно бежать быстрее, не замедляясь.
   2. Попробуйте осторожно толкнуть животное максимум три раза; После этого снижайте скорость на 0,5 км/ч за раз, пока свинья не справится со скоростью. Не снижайте скорость ниже 2 км/ч.
   3. Если животное отказывается бежать даже на медленной скорости, выключите беговую дорожку и остановите испытание.

4. Мониторинг ЭКГ во время нагрузочного теста

1. Поместите электроды ЭКГ (см. Таблицу материалов) в анатомические места, которые имеют минимальное движение во время бега, такие как лопатки или грудная клетка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электроды ЭКГ, предназначенные для тестов с физической нагрузкой, чтобы добиться лучшей адгезии к коже. Не забудьте сбрить волосы в области, где будут размещены электроды ЭКГ.
2. Записывайте изменения частоты сердечных сокращений во время бега.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наш опыт показывает, что анализ сегментов ST часто усложняется из-за движения и других артефактов. Мониторинг ритма также может быть выполнен с помощью имплантируемого петлевого регистратора или кардиостимулятора.

5. Сбор данных

1. Записывайте дистанцию бега, общее время и скорость каждый раз, когда скорость меняется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Современные беговые дорожки могут собирать много других данных, поэтому важно ознакомиться с руководством по беговой дорожке, чтобы использовать весь потенциал оборудования.
2. Обратите внимание на возможные изменения в поведении животных, такие как хромота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости обратитесь к ветеринару и убедитесь, что животное получает необходимую анальгезию. Отстраняйте животное от будущих упражнений до полного выздоровления.

6. Послепроцедурный уход

1. Убедитесь, что у животного есть доступ к точке водоснабжения.
2. Вознаграждайте животное, например, лакомствами или игрушками.
3. Наблюдайте за животным в течение 30 минут после пробежки на предмет возможных побочных эффектов.

Results

Нужно иметь опыт работы с крупными животными, чтобы добиться успеха с этим протоколом. Исследователи должны быть в состоянии оценить, перестает ли животное бегать из-за усталости или отсутствия мотивации. Запись скорости и расстояния может помочь оценить это, так как обычно животные без мотивации полностью перестают бегать, тогда как усталые животные продолжают бежать после замедления скорости (рис. 3). При необходимости протокол можно повторить на следующий день, если результаты покажутся н...

Discussion

Этот тест с физической нагрузкой на крупных животных имитирует тест, используемый в клиниках, сокращая разрыв в конечных точках между доклиническими исследованиями и клиническими испытаниями. Он может быть применен для оценки эффективности новых методов лечения тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, таких как облитерирующий атеросклероз, сердечная недостаточность и ишемическая болезнь сердца. Временные точки, применяемые в этом протоколе, могут варьироваться в зависимости от тестируемого лечения. Этот протокол был стан...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Дефибриллятор	Zoll серии M	TO9K116790	Все портативные дефибрилляторы будут работать
Накладки на дефибриллятор	Philips	M3713A	Все прокладки работают, если прокладки совместимы с электродами ЭКГ дефибриллятора
	Некоторые поставщики		предпочитают электроды ЭКГ, предназначенные для нагрузочных тестов
Петлевый регистратор	Abbott Oy	DM3500	Опционально для мониторинга ритма
Монитор пациента	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	Все портативные мониторы ЭКГ будут работать
Pigs	Emolandia Oy
Беговая дорожка	NordicTrack		Все беговые дорожки с регулируемым наклоном и скоростью подходят для теста с физической нагрузкой. Беговая дорожка должна быть максимально длинной и широкой.
Ультразвуковая система	Philips EPIQ 7 Ультразвук
Различные строительные материалы	Несколько поставщиков		Для строительства заборов, пандусов и ворот согласно Рисунку 1 и Рисунку 2
Различные лакомства для животных