JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Biology

Усовершенствованные модели липофусцина и количественная оценка способности фагоцитоза наружного сегмента в высокополяризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65242
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, ,
1Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor2Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

В этом протоколе описывается модель накопления липофусцина в высокодифференцированных и поляризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека (RPE) и улучшенный анализ фагоцитоза наружного сегмента (OS) для определения общей способности RPE потреблять/деградировать OS. Эти методы преодолевают ограничения предыдущих моделей липофусцина и классических анализов фагоцитоза наружного сегмента с погоней за пульсом.

Abstract

Ежедневный фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов пигментным эпителием сетчатки (RPE) способствует накоплению внутриклеточного пигмента старения, называемого липофусцином. Токсичность липофусцина хорошо известна при болезни Штаргардта, наиболее распространенной наследственной дегенерации сетчатки, но более противоречива при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причине необратимой слепоты в развитых странах. Определение токсичности липофусцина у людей было затруднено, а животные модели Штаргардта имеют ограниченную токсичность. Таким образом, модели in vitro , имитирующие человеческий RPE in vivo , необходимы для лучшего понимания генерации, клиренса и токсичности липофусцина. Большинство моделей липофусцина клеточных культур до настоящего времени были в клеточных линиях или включали кормление RPE одним компонентом сложной смеси липофусцина, а не фрагментами/кончиками всего внешнего сегмента фоторецептора, что создает более полную и физиологическую модель липофусцина. Здесь описан способ индуцирования накопления липофусциноподобного материала (называемого неперевариваемым автофлуоресцентным материалом, или UAM) в высокодифференцированном первичном пренатальном RPE человека (hfRPE) и индуцированном плюрипотентном стволовом клеточном (iPSC), полученном RPE. УАМ накапливался в культурах при многократном кормлении обработанных ультрафиолетовым светом фрагментов ОС, поглощенных РПЭ посредством фагоцитоза. Также обсуждаются ключевые способы, которыми UAM аппроксимируется и отличается от липофусцина in vivo . Сопровождая эту модель липофусциноподобного накопления, представлены методы визуализации, позволяющие отличить широкий спектр аутофлуоресценции гранул UAM от одновременного окрашивания антителами. Наконец, для оценки влияния UAM на способность к фагоцитозу RPE был введен новый метод количественной оценки поглощения и разрушения фрагментов/кончиков внешнего сегмента. Этот метод, получивший название «общая потребительская емкость», преодолевает потенциальные неправильные интерпретации способности к фагоцитозу RPE, присущие классическим анализам внешнего сегмента «погони за пульсом». Представленные здесь модели и методы могут быть использованы для изучения путей генерации и клиренса липофусцина, а также предполагаемой токсичности.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) обеспечивает критически важную поддержку вышележащих фоторецепторов, включая ежедневное поглощение и деградацию кончиков или фрагментов внешнего сегмента фоторецептора (в этом протоколе аббревиатура OS означает кончики или фрагменты OS, а не целые внешние сегменты). Это ежедневное поглощение постмитотического RPE в конечном итоге перегружает фаголизосомальную способность и приводит к накоплению неперевариваемого автофлуоресцентного внутриклеточного материала, называемого липофусцином. Интересно, что несколько исследований также продемонстрировали, что липофусцин RPE может накапливаться без фагоцитозаОС 1,2. Липофусцин имеет много компонентов, в том числе сшитые аддукты, полученные из ретиноидов зрительного цикла, и может занимать почти 20% объема клеток RPE для людей старше 80 лет3.

Вопрос о том, токсичен ли липофусцин, горячо обсуждается. Болезнь Штаргардта представляет собой аутосомно-рецессивную дегенерацию фоторецепторов и RPE, при которой мутация в ABCA4 вызывает неправильную обработку ретиноидов зрительного цикла, содержащихся во внешних сегментах фоторецепторов. Неправильная обработка ретиноидов приводит к аберрантному сшиванию и образованию видов бис-ретиноидов, включая бис-ретиноид N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламин (A2E). Исследования продемонстрировали несколько механизмов токсичности A2E 4,5. Липофусцин вносит свой вклад в сигналы аутофлуоресценции глазного дна во время клинической визуализации, и как у пациентов Штаргардта, так и у животных моделей наблюдается повышенная аутофлуоресценция глазного дна до дегенерации сетчатки, что свидетельствует о корреляции между уровнями липофусцина и токсичностью 6,7. Однако с возрастом липофусцин накапливается у всех людей, не вызывая дегенерации РПЭ. Кроме того, при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), когда дегенерация RPE встречается только у пожилых пациентов, пациенты с ранними и промежуточными формами заболевания имеют меньше сигналов аутофлуоресценции глазного дна, чем люди того же возраста без заболевания8. Эти клинические данные были проверены и на гистологическом уровне 9,10.

Животные модели накопления липофусцина RPE также оставили некоторую двусмысленность в отношении токсичности липофусцина. Мышь с нокаутом ABCA4 не проявляет дегенерацию сетчатки на пигментированном фоне, тогда как на фоне альбиносов или при воздействии синего света11,12. Кроме того, токсичность липофусцина, полученного с помощью нокаута ABCA4, вероятно, отличается от более медленно накапливающегося липофусцина, который происходит при естественном старении, как видно из ВМД13.

Модели накопления липофусцина in vitro представляют собой альтернативу изучению влияния накопления липофусцина на здоровье РПЭ. Такие модели позволяют манипулировать компонентами липофусцина, от кормления отдельными ретиноидными компонентами до кормления ОС, и позволяют проводить исследования на людях, а не на животных. За последние пару десятилетий было разработано несколько методов моделирования липофусцина RPE в культуре. Наряду с другими группами, группа доктора Болтона ежедневно кормила бычью ОС в течение трех месяцев при прохождении от 4 до 7 первичных клеток RPE человека от доноров в возрасте от 4 до 85 лет14. Альтернативно, ингибирование аутофагии также приводило к накоплению липофусцина в пассажах 3–7 первичных культур РПЭчеловека 15. Однако сублетальное ингибирование лизосома в высокодифференцированных, проходящих 1, первичных пренатальных культурах RPE человека (hfRPE) не могло индуцировать липофусцин даже при повторном добавлении ОВ на ежедневной основе16.

В качестве более редукционистского подхода другие скармливали культурам отдельные компоненты липофусцина, особенно бис-ретиноид A2E 4,17. Такие исследования ценны тем, что они определяют потенциальные прямые механизмы токсичности для отдельных компонентов липофусцина, затрагивающие, например, лизосомальный холестерин и керамидный гомеостаз18. В то же время ведутся споры о токсичности A2E19, и подача его непосредственно в клетки обходит типичный путь накопления липофусцина, который включает фагоцитоз фоторецептора OS. В попытке доставить все компоненты липофусцина в культуры RPE, Болтон и Маршалл очистили липофусцин из глаз человека и скармливали его в проход с 4 по 7 первичные культуры RPE человека, полученные как от плодных, так и от пожилых доноров20. Несмотря на то, что этот метод является инновационным, он представляет собой ограниченный источник липофусцина для повторных экспериментов.

В то время как повторное кормление ОВ культурами RPE продуцирует липофусцин во многих системах, это не происходит в высокодифференцированных первичных культурах RPE16. Фотоокисляющая ОС индуцирует реакции сшивания, такие как образование бис-ретиноидов, которые естественным образом происходят при образовании липофусцина in vivo. Это может ускорить образование липофусциноподобных гранул в культуральных системах РПЭ, даже в высокодифференцированных и устойчивых к накоплению липофусцина16. Здесь представлен метод индуцирования накопления липофусциноподобных гранул в высокодифференцированном hfRPE и человеческом iPSC-RPE, модифицированный по сравнению с опубликованным протоколом21 Вильмарка. Преимущество этого метода заключается в том, что он индуцирует липофусциноподобные гранулы с использованием того же источника (фоторецепторного ОС) и пути (фаголизосомальное поглощение ОС), что и для липофусциногенеза in vivo. Кроме того, это делается на культурах РПЭ человека, которые высоко дифференцированы и подтверждены в многочисленных исследованиях для воспроизведения РПЭ человека in vivo22,23,24. Эти липофусциноподобные гранулы называются неперевариваемым автофлуоресцентным материалом (UAM) и предоставляют данные и обсуждение в этом протоколе, сравнивая UAM с липофусцином in vivo. Наряду с методами построения и оценки культур, нагруженных UAM, в высокодифференцированных РПЭ человека, также представлен обновленный метод оценки фагоцитоза СИЗО РПЭ. Было введено несколько отличных методов поиска импульсов для количественной оценки фагоцитоза ОВ, включая вестерн-блоттинг, иммуноцитохимию и FACS25,26,27. Однако на ранних этапах погони за импульсами ОС условия, которые приводят к плохому усвоению ОС, могут быть объединены с условиями, способствующими быстрой деградации интернализованной ОС. Представленный здесь метод измеряет общее количество введенных ОС, которое полностью потребляется/ухудшается RPE («Общая потребляемая емкость»), помогая устранить эту двусмысленность. Ожидается, что информация о токсичности липофусцина с использованием этих протоколов, включая влияние на частоту фагоцитоза ОВ с использованием метода «Общая потребительская емкость», будет использована, чтобы пролить свет на токсичность липофусцина in vivo.

Protocol

Настоящий протокол, касающийся приобретения и использования тканей человека, был рассмотрен и одобрен Институциональным наблюдательным советом Мичиганского университета (HUM00105486).

1. Подготовка фотоокисленных наружных сегментных наконечников и фрагментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптированные к темноте сетчатки крупного рогатого скота были куплены и отправлены на льду (см. Таблицу материалов). Из этих сетчаток ОВ очищали в соответствии с ранее опубликованным протоколом23.

  1. Сшивание наружного сегмента с помощью УФ-лампы
    1. Полностью погрузите предметные стекла с политетрафторэтиленовым покрытием (см. Таблицу материалов) в 70% этанол на 10 мин в шкаф биобезопасности для стерилизации предметных стекол. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в стерильной чашке для культивирования клеток диаметром 100 мм.
    2. Поместите каждое предметное стекло в одну новую чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм и добавьте 200 мкл содержащей сыворотку среды для культивирования клеток (независимо от того, какая среда обычно используется для подручных культур RPE) в каждый прямоугольник, затем поместите портативный ультрафиолетовый свет с длиной волны 254 нм (см. Таблицу материалов) на 100-миллиметровую чашку для культивирования клеток (без крышки) с колбой, обращенной непосредственно к предметному стеклу. и экспонировать в течение 20 мин. Ранее были опубликованы носители, специально использованные для этого исследования, и конкретные номера продуктов для компонентов носителей22,23. В этом протоколе этот носитель называется «носителем RPE».
      ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-обработка носителя блокирует поверхность стекла и предотвращает прилипание ОС на следующих этапах.
    3. Разморозить замороженные аликвоты ОС при 37 °C (в руке или на водяной бане). Объем необходимой ОС зависит от приложения. Как правило, на предметном стекле можно обрабатывать до 500 мкл 2 x 108 OS/мл на прямоугольник.
    4. После размораживания вращайте ОС при 2400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Немедленно аспирируйте надосадочную жидкость в шкаф биобезопасности с помощью пипетки, а не вакуума, чтобы предотвратить случайную потерю гранулы.
    5. Аккуратно ресуспендируйте гранулы стерильным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за ресуспендированным объемом и ожидаемой концентрацией. например, ресуспендирование гранулы из пробирки объемом 1 мл 1 x 10 8 OS/мл с 500 мкл PBS дает 2 x 108 OS/мл. Максимальный объем и концентрация на прямоугольник на предметном стекле с покрытием из политетрафторэтилена составляет 500 мкл 2 x 108 OS/мл.
    6. Аспирируйте носитель из предметных стекол и поместите до 500 мкл раствора PBS 2 x 108 OS/мл на каждый прямоугольник предметного стекла. Поместите портативный ультрафиолетовый свет на чашку для культивирования клеток (без крышки) так, чтобы лампа была обращена непосредственно к ОС. Подвергайте раствор ОС воздействию света 254 нм в течение 40 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 40 минут накройте УФ-лампу и блюдо полотенцем или впитывающей прокладкой, закройте створку шкафа биобезопасности и выключите воздуходувку. Это предотвратит любое значительное испарение. Если УФ-лампа, используемая в этом протоколе, недоступна исследователю, есть две альтернативы, чтобы обеспечить достижение соответствующего количества поперечных связей. Первый заключается в том, чтобы следовать количественному воздействию ультрафиолета, описанному на шаге 1.2, либо с помощью устройства, описанного на шаге 1.2, либо с помощью другого устройства, которое может обеспечить такое же количественное лучистое облучение, как указанное устройство в 1.2. Другой альтернативой является воздействие ОС на ультрафиолетовое излучение в течение времени, которое вызывает степень сшивания на пятне Кумасси, как показано на рисунке 1C.
    7. Соберите обработанный раствор OS PBS в стерильные микроцентрифужные пробирки, повторно промыв прямоугольник предметного стекла с покрытием 200-500 мкл PBS (2-3x) и собирая каждую промывку в микроцентрифужную пробирку. После этого посмотрите на предметное стекло под микроскопом для культивирования тканей, чтобы убедиться, что почти все ОС были удалены с предметного стекла.
    8. Отжимайте раствор OS PBS при 2400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, аспирируйте PBS в шкаф биобезопасности с помощью пипеттора и ресуспендируйте в стандартной среде объемом 500 мкл, которая будет использоваться для культур RPE (например, «среда RPE», определенная в разделе 1.1.2). Объем ресуспензии можно регулировать в зависимости от желаемой концентрации фотоокисленной ОС (OxOS).
    9. Поместите 10 мкл суспензии в новую микроцентрифужную пробирку, разбавьте в 50-100 раз большим количеством сред для культивирования клеток и подсчитайте ОВ с помощью гемоцитометра.
    10. В зависимости от количества ОС разбавьте суспензию OxOS до конечной концентрации на запасе. Для подкормки высокозрелых культур СИЗД в 24-луночных трансвеллах (площадь поверхности 0,33см2; см. Таблицу материалов) рекомендуется конечная концентрация среды 2 x 107 OS/мл.
      1. Для этого распределите OxOS на аликвоты по 25 мкл в концентрации 5,6 x 107 OS/мл, взвешенные в стандартных питательных средах RPE. После размораживания аликвоты 25 мкл смешайте всю аликвоту с 45 мкл стандартных питательных сред RPE, обеспечивая конечный объем среды 70 мкл и концентрацию OS, равную 2 x 107 OS/мл для каждого кормления OxOS Transwell.
    11. Перед аликвотированием OxOS добавьте мостиковые лиганды фагоцитоза (белок S и MFG-E8, см. Таблицу материалов), которые облегчают поглощение ОВ и накопление липофусцина. Рабочие концентрации мостиковых лигандов в 24-луночном Transwell составляют 4 мкг/мл для очищенного белка S человека и 1,5 мкг/мл для человеческого рекомбинантного MFG-E8. Таким образом, для аликвот OxOS 25 мкл при 5,6 x 107 OS/мл исходная концентрация белка S составляет 11,2 мкг/мл, а для MFG-E8 – 4,2 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации мостиковых лигандов были оптимизированы для культур hfRPE на 24-луночных Transwell с приблизительным количеством клеток 320 000 клеток на лунку 0,33 см2 . Концентрации лигандов, возможно, должны быть скорректированы для других типов RPE и плотности клеток, поскольку лиганды, присутствующие сверх доступности рецептора фагоцитоза, могут парадоксальным образом блокировать поглощение ОВ28.
    12. Заморозьте аликвоты в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многократное замораживание-оттаивание наносит большой ущерб целостности ОС.
  2. Сшивание наружного сегмента с помощью УФ-сшивающего устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте шагу 1.1, за исключением приведенных ниже шагов, которые заменяют шаги 1.1.2 и 1.1.6, соответственно:
    1. (заменяет этап 1.1.2) Поместите каждое предметное стекло в одну новую чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм и добавьте 200 мкл сыворотки, содержащей среду для культивирования клеток (например, «среду RPE» или любой другой заменитель) в каждый прямоугольник, затем поместите предметные стекла в устройство ультрафиолетового сшивающего агента (см. Таблицу материалов), обработав ультрафиолетовым излучением 254 нм при лучевой экспозиции 3-6 Дж/см2 , чтобы заблокировать поверхность стекла и предотвратить прилипание ОС на следующих этапах.
    2. (заменяет этап 1.1.6) Аспирируйте среду из предметных стекол и поместите до 500 мкл 2 x 108 ОВ/мл в стерильный PBS на каждый прямоугольник предметного стекла. Поместите предметные стекла в устройство ультрафиолетового сшивающего агента, установите при необходимости лучевую экспозицию лечения (3-9 Дж /см2) и обрабатывайте на длине волны 254 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое радиационное облучение может быть тщательно определено путем титрования лучистого облучения в диапазоне от 3 до 9 Дж/см2 до тех пор, пока не будет достигнута степень автофлуоресценции и сшивание белков (как показано на рисунках 1B и 1C).
      ВНИМАНИЕ: Работа с ОС вне шкафа биобезопасности может привести к загрязнению. После воздействия ОС на устройство УФ-сшивающего агента соберите ОВ стерильными наконечниками пипеток, перенесите в стерильные микроцентрифужные пробирки и выполните все дальнейшие действия в вытяжке биобезопасности.
  3. Характеристика окисленных ОС
    1. Количественная оценка спектра излучения автофлуоресценции с помощью визуализации
      1. Поместите 20-50 мкл исходного раствора из необработанного OS и OxOS в две отдельные микроцентрифужные пробирки. Центрифугу при 2400 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, ресуспендировать гранулы в буферном (например, PBS) 4% параформальдегиде и фиксировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
      2. После фиксации отжим, как указано выше, промывайте PBS x 2 (отжим между стирками), затем ресуспендируйте менее чем в 30 мкл PBS.
      3. Поместите несколько микролитров ресуспендирования на предметное стекло микроскопа, добавьте монтажные материалы (см. Таблицу материалов) и, наконец, покровное стекло.
      4. Изображение OxOS на конфокальном микроскопе (см. Таблицу материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Автофлуоресценция OxOS может возбуждаться широким диапазоном длин волн лазера, но обычно используется лазерная линия 405 нм или 488 нм. Излучение также широко, но типичная установка фильтра возбуждения/излучения GFP / FITC достаточна для просмотра автофлуоресценции.
      5. Для измерения спектра излучения OxOS используют λ-сканирование на конфокальном микроскопе. Типичные настройки λ-сканирования включают возбуждение с длиной волны 405 нм или 488 нм и обнаружение излучения в диапазоне от 10 нм со смещением красного цвета от линии лазерного возбуждения до приблизительно 800 нм с шагом λ 10 нм. Каждая микроскопическая система имеет свои собственные указания о том, как использовать λ-моду, и читатель должен обратиться к руководству для их конкретного конфокала.
    2. В качестве альтернативы можно количественно оценить автофлуоресценцию с помощью проточной цитометрии.
      1. Отжимают 2 x 10 7 необработанных ОВ и отдельно 2 x 107 OxOS в микроцентрифужных пробирках и ресуспендируют в 1 мл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация не требуется, если проточная цитометрия проводится непосредственно после размораживания.
      2. Загрузите необработанные образцы OS и OxOS на проточный цитометр (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте прямой разброс (FSC) и боковой разброс (SSC) до допустимого спреда на диаграмме рассеяния FSC-SSC. Используйте PBS в качестве средства контроля, чтобы исключить любые загрязняющие мелкие частицы. Обратите внимание, что ОС значительно меньше, чем ячейки.
      3. Используйте стандартный канал FITC проточного цитометра для количественного определения автофлуоресценции. Подсчитайте не менее 10 000 событий. Используйте значение площади импульса гистограммы FITC для представления интенсивности флуоресценции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования все данные анализируются с использованием программного обеспечения для анализа проточного цитометра (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Оцените степень сшивки в OxOS
      1. Отжимите 2 x 10 7 необработанных ОВ и отдельно 2 x 107 OxOS в микроцентрифужных пробирках. Удалите надосадочную жидкость и непосредственно лизируйте гранулы, добавив 1,2x буфера для образцов Laemmli (достаточно, чтобы покрыть; см. Таблицу материалов). Вихрить, держать при комнатной температуре в течение 30 мин, вращать при комнатной температуре равной или превышающей 12000 x g в течение 10 мин и собирать надосадочную жидкость.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка степени сшивания белков в OxOS дает представление об адекватности УФ-обработки. Проводится сравнение между необработанным ОВ и OxOS, и адекватное сшивание происходит, когда мономерная полоса родопсина, которая доминирует в окрашивании Кумасси (рис. 1C, стрелка), просто ощутима, с появлением агрегатов более высокого порядка и белкового мазка в верхней части геля.
        ВНИМАНИЕ: При использовании буфера для образцов для лизиса ОС не нагревайте раствор для лизиса, так как это может вызвать агрегацию родопсина. Также избегайте охлаждения лизированной ОС до тех пор, пока она не будет готова к хранению, так как это приведет к осаждению SDS. Неиспользованные лизаты можно хранить при температуре -20 °C. При восстановлении убедитесь, что лизаты полностью разморожены при комнатной температуре перед использованием.
      2. Количественно определите концентрацию белка с помощью анализа белка, который устойчив к высоким концентрациям SDS и восстановителей29. См. Таблицу материалов для предложений по соответствующим реагентам для анализа белка и следуйте протоколу производителя для этих реагентов.
      3. Запустите необработанные образцы OS и OxOS с помощью электрофорезаSDS-PAGE 30 на градиентном геле 4%-15% с использованием стандартного трис-глицинового буфера SDS. Гель запускают при 80 В до тех пор, пока образцы не попадут в стек, затем при 120 В в течение 50-60 мин при комнатной температуре.
      4. Окрашиваем гель синим цветом Coomassie по стандартным протоколам31. Окрашивание Кумасси продемонстрирует адекватность сшивания, вызванного УФ-обработкой.

2. Построение липофусциноподобных гранул (УАМ) в культурах РПЭ

  1. Кормления OxOS: количество, частота и фагоцитоз, мостиковые лиганды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кормление происходит на человеческих культурах iPSC-RPE или hfRPE в проходе 1, выращенных в соответствии с протоколом, изложенным лабораторией Bharti (для iPSC-RPE)32 или нашим ранее изложенным протоколом для hfRPE, адаптированным из лаборатории Шелдона Миллера22,23. Все расчеты, приведенные ниже, основаны на подаче OxOS или OS на один 24-луночный Transwell (диаметр 6,5 мм, площадь роста 0,33см2).
    1. Разморозьте 25 мкл 5,6 x 107 OxOS/мл при 37 ° C и добавьте 45 мкл среды для культивирования клеток в аликвоту OxOS, в результате чего конечный объем составит 70 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты OxOS, приготовленные на шаге 1, будут содержать мостиковые лиганды фагоцитоза MFG-E8 и белок S. Однако, если эти лиганды не были добавлены к аликвотам до замораживания, они могут быть добавлены на этом этапе, гарантируя, что конечная концентрация лигандов в средах, которыми будут питаться клетки, составляет 4 мкг/мл для белка S и 1,5 мкг/мл для MFG-E8. Как указано на шаге 1.1.11, концентрации мостиковых лигандов, возможно, потребуется изменить для других типов RPE или плотности клеток.
    2. Удалите апикальную среду из Transwell и добавьте 70 мкл 2 x 107 OxOS/мл с мостиковыми лигандами фагоцитоза в апикальную камеру. Через 24 часа снимите и замените на новое кормление OxOS. Кормление происходит ежедневно в будние дни, пропуская выходные, до тех пор, пока не будет завершено 20 кормлений (~1 месяц). Меняйте базолатеральные среды для культивирования клеток (400-550 мкл) 2-3 раза в неделю.
    3. По завершении 20 кормлений возобновить нормальную смену среды для скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для смывания липкого OxOS с апикальной поверхности RPE требуется несколько дополнительных смен среды, поэтому эксперименты с культурами, нагруженными UAM, должны проводиться не менее чем через 1-2 недели после завершения кормления OxOS.
      ВНИМАНИЕ: Важно иметь надлежащий контроль за накоплением UAM через кормление OxOS. Поскольку ежедневные изменения среды могут повлиять на биологию RPE, рекомендуются следующие контрольные лунки: Контроль 1: Заменяйте среду ежедневно в будние дни для того же количества кормлений, что и группа, получавшая OxOS. Контроль 2: Ежедневно в будние дни в будние дни скармливайте необработанные СИЗО в той же концентрации и объеме, что и кормления OxOS, при том же количестве кормлений.
  2. Мониторинг здоровья культур, нагруженных липофусциноподобными гранулами, с помощью анализов трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и гибели клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время и после кормления OxOS здоровье культур РПЭ можно измерить, оценив целостность плотного соединения РПЭ и гибель клеток. Ранее было показано, что оценка целостности плотного соединения путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) является чувствительным маркером общего здоровья клеток33. Также могут быть использованы более традиционные неинвазивные маркеры гибели клеток, такие как высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
    1. Выполнение TEER
      ПРИМЕЧАНИЕ: TEER тестируется с помощью измерителя трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и электрода TEER, как правило, в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
      1. Чтобы стерилизовать электрод TEER, используйте рабочий стеклоочиститель, пропитанный 70% этанолом, для очистки электрода, а затем погрузите кончики электродного зонда в 70% этанол на 10 минут.
      2. Дайте электроду полностью высохнуть, затем погрузите электрод в стерильную среду.
      3. Извлеките зонд из стерильной среды и вставьте два зонда электрода TEER в апикальную и базолатеральную камеры культивируемого Transwell; Более длинный наконечник зонда помещается в базолатеральную камеру.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Легко соскоблить дно апикальной камеры электродом TEER без практики, и такое соскабливание резко изменит показания TEER, поскольку монослой RPE сливается. Таким образом, новичкам рекомендуется попрактиковаться на неважных Transwell перед тестированием на экспериментальных культурах RPE. Кроме того, после того, как каждая пластина культур RPE протестирована, экспериментатор должен проверить наличие соскабливания монослоя RPE под стандартным микроскопом для тканевых культур.
      4. После того, как апикальный и базолатеральный зонды установлены в Transwell, нажмите кнопку считывания или нажмите на ножной переключатель глюкометра, чтобы записать TEER. Между пластинами или группами ячеек промойте электродный зонд стерильным носителем. Если инфекция вызывает серьезную озабоченность, повторно стерилизуйте между тарелками.
      5. Рассчитайте TEER, сняв показания сопротивления со счетчика, вычтя значение пустого Transwell со средой, но без ячеек (обычно 100-110 Ω для 24-луночного Transwell с площадью поверхности 0,33 см2 ), а затем умножив на площадь поверхности Transwell.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Значения TEER должны быть нормализованы к площади поверхности клетки. Типичные значения для здоровых культур hfRPE колеблются в пределах 350-1100 Ом2 . Значения TEER увеличиваются при снижении температуры. Таким образом, при удалении культур из инкубатора с температурой 37 °C в колпак комнатной температуры значения TEER будут иметь тенденцию к увеличению по всей тарелке. Чтобы защититься от этой изменчивости, либо работайте быстро (если есть опыт), либо подождите 10-15 минут, пока температура пластины не уравновесится с температурой в помещении.
    2. Проведите анализ высвобождения ЛДГ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высвобождение ЛДГ в надосадочную жидкость клеточной культуры происходит во время гибели клеток и измеряется с помощью стандартного набора (см. Таблицу материалов).
      1. Соберите надосадочную жидкость сверху клеток после 24-часовой инкубации и разбавьте до 1:100, используя стандартные среды.
      2. Индуцируют общее возможное высвобождение ЛДГ, что важно для нормализации всех значений из шага 2.2.2.1, путем добавления 2 мкл 10% тритона X-100 к 100 мкл апикальной среды из контрольных клеток в 24-луночном трансвелле. После инкубации надосадочной смеси тритон/клетка в течение 15 минут при 37 °C смешайте среду над лизированными клетками и соберите для измерения общего возможного высвобождения ЛДГ.
      3. После того, как надосадочные жидкости собраны, проведите анализ в соответствии со стандартными инструкциями производителя, измерив люминесценцию после 30-минутной инкубации с использованием буферного раствора набора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все значения ЛДГ нормализуются к общему возможному количеству высвобождения ЛДГ.
  3. Характеристика спектра и состава липофусциноподобных гранул
    1. Получение количественного определения и спектров автофлуоресценции
      1. Зафиксируйте культуры, нагруженные UAM, 4% PFA при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем промывка PBS 5x.
      2. Держите небольшое количество PBS в апикальной камере, а затем переверните Transwell вверх дном. С помощью рассекающего микроскопа и бритвенного лезвия отрежьте полупористую мембрану от Transwell, приложив режущее усилие на стыке мембраны и Transwell.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, насколько близко к кромке Transwell сделан разрез, так как мембрана Transwell имеет тенденцию деформироваться и сморщиваться, когда разрезы непоследовательны.
      3. После того, как мембрана Transwell разрезана, немедленно поместите ее на предметное стекло микроскопа с помощью щипцов, стараясь не касаться частей мембраны Transwell клетками. Удалите излишки PBS с помощью протирки, избегая при этом прикосновения к ячейкам. Добавьте монтажный носитель и покровное стекло. Убедитесь, что вы отслеживаете, какая сторона Transwell находится «правой стороной вверх» при закрытии Transwell.
      4. Получите интенсивность и спектры автофлуоресценции, используя те же настройки и процедуры, что и на этапах 1.3.1.4 и 1.3.1.5.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации UAM важным искажением является то, что OxOS являются автофлуоресцентными и часто прилипают к апикальной поверхности RPE в течение нескольких дней, а иногда даже недель после завершения кормления OxOS. В результате при количественной оценке UAM необходимо использовать метод, гарантирующий, что измеренная автофлуоресценция исходит от UAM, а не от OxOS. Самый простой метод заключается в совместном окрашивании культур липофусцина антителами к родопсину. Например, антитело против родопсина 4D2 можно использовать в разведении 1:1000 и со стандартным протоколомиммуноцитохимии 34 с фиксацией PFA. Вторичным антителом к родопсину должно быть антитело, конъюгированное с красителем (например, с максимумами возбуждения около 647 нм), поскольку аутофлуоресценция UAM и OxOS имеет тенденцию быть самой слабой на этой длине волны. Затем конфокальные изображения могут быть последовательно получены в двух каналах, возбуждая автофлуоресценцию UAM и OxOS с помощью лазера с длиной волны 405 нм и излучения в диапазоне от 415 нм до 550 нм, в то время как остаточный родопсин, указывающий на непереваренный OxOS, может быть возбужден стандартными параметрами визуализации дальнего красного красителя в отдельном канале. После приобретения родопсиновый канал можно использовать в качестве субтрактивной маски в такой программе, как ImageJ, для удаления автофлуоресценции, исходящей от липкого оставшегося OxOS, оставляя только автофлуоресценцию UAM для количественной оценки.
        ВНИМАНИЕ: Даже ОС, которые не подвергаются фотоокислению, проявляют некоторую автофлуоресценцию, и даже при тщательной промывке некоторые ОС и OxOS прилипают к поверхности СИЗО. Таким образом, без создания субтрактивной маски с использованием иммуноокрашивания родопсином, как предложено в приведенном выше примечании, точное количественное определение уровней автофлуоресценции UAM в культурах, получавших OxOs или стандартную ОС, невозможно.
    2. Одновременное обнаружение липофусциноподобных гранул и других иммунофлюоресцентных маркеров
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как подробно описано в шаге 2.3.1, широкий спектр автофлуоресценции липофусцина ограничивает выбор для флуоресцентного окрашивания. Для облегчения совместного окрашивания можно рассмотреть следующие методы.
      1. Используйте дальний красный флюорофор. Автофлуоресценция от липофусцина слабая в ближнем инфракрасном диапазоне. Таким образом, использование дальнего красного красителя для флуоресцентного обнаружения интересующего антигена в сочетании с тщательной регулировкой настроек канала на конфокальном микроскопе обычно позволяет отличить автофлуоресценцию от флуоресценции совместного окрашивания.
      2. Воспользуйтесь длинным флуоресцентным излучающим хвостом липофусцина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку липофусцин имеет очень широкий спектр флуоресцентного излучения, он часто может возбуждаться на низкой длине волны нм (например, лазер 405 нм) и иметь излучение, все еще обнаруживаемое в оранжево-красной части спектра (например, 585-635 нм). Эта уникальная комбинация длин волн возбуждения и излучения часто может быть адаптирована к другому флуорофору для окрашивания.
        1. Обнаружение интересующего антигена с помощью флуорофора с пиком возбуждения около 488 нм с обнаружением излучения на длине волны 500-530 нм. Настройте отдельный канал для детектирования автофлуоресценции с возбуждением 405 нм и излучением 585-635 нм. Этот второй канал обнаружит только UAM, в то время как первый канал обнаружит интересующий антиген плюс липофусцин.
        2. Используя бесплатную программу, такую как ImageJ, используйте этот второй канал, предназначенный только для UAM, в качестве субтрактивной маски для удаления сигнала UAM из первого канала (который содержит как сигнал антигена, так и сигнал UAM).
      3. Используйте спектральное размикширование. Большинство современных конфокальных микроскопов содержат опцию спектрального размешивания. Это позволяет получить спектр образца только с помощью UAM и другого образца только с интересующим флуорофором. Экспериментальный образец, который содержит как UAM, так и флуорофор для совместного окрашивания, затем может быть получен и подвергнут методам линейного смешивания, чтобы вычислить, какой процент сигнала исходит от автофлуоресценции по сравнению с совместным окрашиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Исчерпывающие руководства по спектральному разсмешиванию доступны с большинством современных конфокальных микроскопов.
      4. Используйте флуоресцентную визуализацию времени жизни. Хотя спектр излучения между УАМ и интересующим флуорофором может быть схожим, вполне вероятно, что время жизни их флуоресценции значительно различается. В целом, UAM демонстрирует более короткое время жизни флуоресценции, чем большинство специфических флуорофоров. Имея доступ к конфокальному микроскопу, который позволяет получать изображения в течение всего срока службы, можно задействовать флуоресцентные сигналы для обнаружения тех, которые дольше, чем типичный срок службы липофусцина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, стробирование времени жизни флуоресценции для сигналов более 2 нс значительно снижает загрязнение UAM, хотя и не полностью устраняет сигнал.
      5. Использование автофлуоресцентного супрессора. Традиционно суданский черный использовался для гашения аутофлуоресценции перед специфическим иммунофлуоресцентным окрашиванием35. Несколько коммерчески доступных продуктов для подавления автофлуоресценции сообщают об улучшении результатов Sudan Black, и эти продукты подробно описаны в таблице материалов. Гашение автофлуоресценции, конечно, уничтожит способность обнаруживать липофусцин.
    3. Определяем состав липофусциноподобных гранул
      1. Оцените нейтральные липиды
        1. Зафиксируйте СИЗОД и контрольные скважины (питаемые необработанными ОС) в 4% ПФА при комнатной температуре в течение 15 минут и промойте PBS 5x.
        2. Окрашивание для нейтральных липидов с использованием 10 мкг / мл Nile Red или 3,33 мкг / мл Bodipy 493/503 в 3% растворе BSA PBS при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей промывкой PBS в течение 5 мин 3x.
        3. Вырежьте и смонтируйте Transwell как на шаге 2.3.1.2 и 2.3.1.3 и образ. Как правило, для получения изображений используйте следующие полосы возбуждения и излучения: Nile Red – ex 543 нм, em 620-700 нм и Bodipy 493/503 – ex 488 нм, em 500-550 нм.
      2. Оценка этерифицированного и неэтерифицированного холестерина
        1. Следуйте шагу 2.3.3.1.1
        2. Филиппин – это флуоресцентный краситель, который распознает неэтерифицированный холестерин, но не этерифицированный холестерин36. Таким образом, чтобы оценить количество общего холестерина (неэтерифицированного и этерифицированного) в UAM, сначала предварительно обработайте образец холестериновой эстеразой, чтобы преобразовать этерифицированный холестерин в неэтерифицированный холестерин. Обработать клетки 20 ЕД/мл холестериэстеразой в 0,1 М фосфатном калийном буфере (рН 7,2) (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 3,5 ч с последующей промывкой PBS в течение 5 мин 3 раза.
        3. Окрашивайте 50 мкг/мл филипина (см. Таблицу материалов) в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа и стирайте PBS в течение 5 мин 3x. Держите образцы закрытыми, вдали от света, так как филиппинские фотоотбеливатели легко отбеливаются.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо количественно определить только неэтерифицированный холестерин, эстеразу холестерина на этапе 2.3.3.2.2 можно пропустить. Если количество этерифицированного холестерина должно быть количественно определено, оно может быть выведено по разнице между общим холестерином и неэтерифицированным холестерином в образце.
        4. Вырежьте и смонтируйте Transwell как в шагах 2.3.1.2 и 2.3.1.3, так и на изображении.
          ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации филипина он очень быстро обесцвечивается. Необходимо свести к минимуму интенсивность и продолжительность возбуждения и ожидать, что некоторое фотообесцвечивание может произойти даже при просмотре образца через глаза. Поэтому при визуализации следует: (1) искать подходящую область для изображения с использованием флуоресцентного канала, отличного от филиппинского канала, (2) отображать филиппин на широкопольном, а не конфокальном микроскопе (чтобы ограничить интенсивность светового воздействия) и (3) избегать повторного изображения области. В общем, используйте следующие полосы возбуждения и излучения для визуализации филиппин – ex 380 нм, em 480 нм.

3. Оценка влияния липофусциноподобных гранул на фагоцитоз РПЭ: общая потребительская емкость

ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование измерения фагоцитоза ОВ с помощью протокола только импульса ОС, приведенное ниже, подробно описано в разделе репрезентативных результатов. Метод, который называется «Общая потребительская емкость», позволяет избежать двусмысленности в отношении эффективности фагоцитоза, которая может возникнуть при традиционных анализах фагоцитоза с погоней за импульсом ОС. Анализы проводятся на 24-луночных планшетах Transwell с использованием 50 мкл среды, содержащей 4 x 106 OS/мл.

  1. Рассчитайте количество лунок, необходимых для эксперимента, а затем разморозьте соответствующее количество обычной ОВ, открутите при 2400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и ресуспендируйте в стандартных средах для культивирования клеток RPE до 4 x 106 OS/мл. Добавьте мостиковые лиганды, чтобы облегчить частоту фагоцитоза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация мостиковых лигандов в средах, в которые будут питаться клетки, составляет 4 мкг/мл для белка S и 1,5 мкг/мл для MFG-E8. Как указано на шаге 1.1.11, концентрации мостиковых лигандов, возможно, потребуется изменить для других типов RPE или плотности клеток.
  2. Удалите апикальные среды и добавьте 50 мкл 4 x 106 ОВ/мл, в идеале с соответствующими концентрациями мостиковых лигандов.
  3. В разное время после добавления ОВ (например,. – 0 ч, 1 ч, 4 ч и 24 ч) добавляют 16,67 мкл 4-кратного буфера для образца Laemmli с ингибиторами протеазы для лизиса обеих клеток и вышележащей ОВ-содержащей надосадочной жидкости. Используйте пипетку P-200, чтобы поцарапать поверхность Transwell, стараясь не проколоть мембрану Transwell и не отсоединить мембрану от Transwell, и соберите вместе комбинированный надосадочную жидкость и лизат клетки. Перемешайте, открутите и оставьте при комнатной температуре на 30 минут для тщательной денатурации.
    ВНИМАНИЕ: Несмотря на использование буфера для образцов для лизиса ОС, не нагревайте раствор для лизиса впоследствии, так как это может вызвать агрегацию родопсина. Также избегайте охлаждения лизированной ОС до тех пор, пока она не будет готова к хранению, так как это приведет к осаждению белка. Заморозьте неиспользованные лизаты при -20 °C, убедившись, что лизаты полностью разморожены перед использованием.
  4. Запустите лизаты на SDS PAGE, используя те же настройки, что и на шаге 1.3.3, загружая равные объемы лизатов на скважину. GAPDH, β-актин или другой домашний белок следует использовать для нормализации количества клеток, так как частота фагоцитоза зависит от количества клеток.
  5. Исследуйте вестерн-блоттинг антителами против N- или C-конца родопсина. Используйте стандартные западные условия блоттинга, а разведения антител указаны в таблице материалов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под основной полосой родопсина будет несколько фрагментов родопсина. Эти фрагменты представляют собой частично переваренный родопсин, процесс, который начинается до слияния фагосомы с лизосомой32,33. Увеличение количества фрагментов родопсина в РПЭ, нагруженном UAM, по сравнению с контрольным RPE может указывать на дефект способности фаголизосомы ниже по течению на уровне слияния фагосом и лизосомы, лизосомального подкисления и/или функции деградирующего фермента 16,34,35.

Representative Results

Discussion

В то время как липофусцин RPE изучался в течение десятилетий, его токсичность обсуждается 2,9,16,42. Учитывая неоднозначность в отношении токсичности липофусцина на животных моделях11, модели in vitro, использующие человеческий РПЭ, являются ценными. Был описан ряд моделей накопления липофусцина in vitro, но ни одна из них не использовала как кормление ОС, так и высокозрелые и дифференцированные культуры RPE человека. Эта комбинация представляет собой идеальную модель, поскольку кормление ОС повторяет метод накопления липофусцина in vivo, а высокозрелые культуры RPE человека лучше всего воспроизводят поведение RPE in vivo. Интересно, что при использовании высокодифференцированных культур hfRPE было обнаружено, что рутинное воздействие ОВ было недостаточным для индуцирования липофусциноподобного материала даже после повторных кормлений16. Таким образом, этот протокол ускоряет процесс накопления липофусцина путем фотоокисляющей ОС (OxOS) контролируемым образом. Подача OxOS в культуры iPSC-RPE и hfRPE человека приводила к активному накоплению липофусциноподобных гранул, которые называются неперевариваемым автофлуоресцентным материалом (UAM). Накопление UAM позволяет моделировать липофусцин в культуральных системах, имитирующих RPE здорового человека in vivo 22,23,29,43,44. Как в предыдущей публикации, так и в этом исследовании обширная характеристика UAM по сравнению с нативным липофусцином у здоровых пожилых людей демонстрирует как сходства, так и различия. UAM имитирует ультраструктуру липофусцина in vivo, включая тенденцию гранул липофусцина сливаться с гранулами меланина с образованием меланолипофускина16. Как UAM, так и липофусцин содержат существенные нейтральные липиды, не содержат родопсина и не обогащают холестерин (рис. 2A, B из нашей предыдущей публикации16, рис. 2A, B выше и неопубликованные данные). Мы также сравнили размер и спектр гранул нативного липофусцина с гранулами UAM (рис. 3 из нашей предыдущей публикации16). Гранулы UAM изначально немного крупнее и смещены в синий цвет по сравнению с нативным липофусцином, но в течение значительных периодов времени в культуре UAM компактируется до меньшего размера и красного смещения в их спектре излучения, становясь гораздо более похожими на размер и профиль спектров нативного липофуссина.

Модель OxOS UAM была использована для целого ряда применений, включая влияние индукторов аутофагии на профилактику и удаление гранул липофусцина50 и влияние липофусцина на полярность RPE и метаболизм16. Кроме того, было показано, что эти гранулы сохраняются в культивируемом РПЭ более года, что позволяет изучать эволюцию спектров, морфологии и поведения липофусцина в течение длительных периодов времени16. Другие приложения для модели включают изучение накопления липофусцина при активациикомплемента 51, лизосомальной стабильности и воспалительных реакций52 и митохондриальной компрометации53.

В этом протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, культуры РПЭ должны быть высокодифференцированными и зрелыми. Кормление OxOS следует начинать только после того, как RPE находился на Transwells в течение не менее 8 недель и приобрел все качества, характерные для высокозрелых RPE (5 ‘P, разработанные Finnemann et al. – полигональные по морфологии, постмитотические, пигментированные, поляризованные и фагоцитарные54). Во-вторых, ОС очень хрупкие, и с ними следует обращаться осторожно во время пипетирования. Чрезмерное пипетирование или замораживание-оттаивание разрушат ОС. Наконец, отношение ОВ к общему воздействию УФ-потока имеет решающее значение для генерации OxOS, которые остаются нетронутыми, но все еще могут вызывать UAM; Это соотношение было уточнено в настоящем протоколе. Слишком много ультрафиолетового света для данного количества ОС вызывает чрезмерное сшивание и разрушает критические химические структуры в ОС. Слишком мало ультрафиолетового света для данного количества ОС не сможет индуцировать UAM в культуре.

Изменения в протоколе в значительной степени связаны с изменением продолжительности кормления или концентрации OxOS. Эмпирически 20 кормлений в течение примерно 4 недель приводят к значительному накоплению UAM. Кормления, выходящие за рамки этого, могут постепенно увеличивать накопление UAM, в то время как меньшее количество кормлений, вероятно, вызовет только спорадическое накопление UAM. Количество кормлений можно регулировать в зависимости от цели, потребностей и ресурсов экспериментатора и экспериментатора. В менее дифференцированных культурах RPE (более высокое число пассажа, клеточные линии или культуры, демонстрирующие эпителиально-мезенхимальные переходные свойства) для надежной индукции UAM требуется меньшее количество кормлений и более низкие концентрации OxOS.

Протокол имеет несколько ограничений. Использование портативной УФ-лампы для фотоокисления ОС предотвращает точную количественную оценку общего радиационного облучения, доставляемого на ОС. Тем не менее, фотоокисление ОС с использованием ручной лампы было коррелировано в этом исследовании с гораздо более дорогим (но количественным) устройством УФ-сшивающего агента на рисунке 1 , чтобы помочь определить параметры радиационного воздействия. Экспериментаторам рекомендуется изменять продолжительность воздействия ультрафиолета до тех пор, пока рисунок сшивания / смазывания родопсина не будет имитировать тот, который виден в столбце УФ-лампы вестерн-блоттинга на рисунке 1C.

Второе ограничение метода заключается в том, что в нем, вероятно, отсутствуют многие особенности накопления липофусцина in vivo. Действительно, во всем этом протоколе липофусциноподобные гранулы называются неперевариваемым автофлуоресцентным материалом (UAM), чтобы прояснить это различие. Фотоокисляющая ОС повторяет некоторые естественные химические сшивки, которые происходят во внешних сегментах фоторецепторов при болезненных состояниях, но сшивание значительно ускоряется и, вероятно, более неспецифично в модели UAM. Кроме того, несмотря на почти месяц кормления OxOS, модель UAM по-прежнему представляет собой «острое» воздействие ОВ, индуцирующих липофусцин, по сравнению с десятилетиями, необходимыми для накопления липофусцина в организме человека. При более длительном накоплении липофусцина в культуре фенотипические эффекты могут быть меньше. Тем не менее, поскольку гранулы УАМ сохраняются более года в представленной здесь системе культивирования, есть возможность изучить их долгосрочное влияние на здоровье СИЗО16.

Ограничением метода «Общая потребительская емкость», представленного здесь для оценки способности к фагоцитозу RPE, является то, что он не позволяет различить, могут ли дефекты фагоцитоза быть связаны со связыванием ОС, поглощением или деградацией. Действительно, когда целью анализа фагоцитоза является механистическое понимание дисфункции конкретных этапов процесса фагоцитоза, более подходящими являются традиционные анализы с погоней за импульсом ОС. Измерение «общей потребительской емкости» следует использовать, когда цель состоит в том, чтобы просто однозначно измерить компетентность ОС фагоцитоза культуры РПЭ в контролируемых и экспериментальных условиях.

В заключение представлен протокол накопления липофусциноподобных гранул в высокодифференцированных культурах РПЭ человека. Этот метод объединяет физиологический процесс накопления липофусцина – повторное кормление фотоокисленной ОС – с моделями культивирования РПЭ, которые, как было показано в повторных исследованиях, сильно повторяют РПЭ человека in vivo. Полученные культуры, нагруженные липофусциноподобными гранулами, могут быть использованы для множества применений, начиная от оценки эффектов липофусцина на биологию RPE и заканчивая тестами малых молекул, генов и сигнальных путей, важных для модуляции накопления липофусцина.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:<br/> https://wllawsoncompany.com/<br/> (402) 499-3161<br/> stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software&nbsp;BDFlowJo
Handheld UV light&nbsp;Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -&nbsp; 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors&nbsp;Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease–correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch’s membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Tags

LipofuscinRetinal Pigment EpitheliumRPE CulturesPhagocytosisOuter SegmentsLipofuscin ToxicityIn Vitro ModelsAge-related Macular DegenerationStargardt’s DiseasePhagocytosis AssayAccumulationAging PigmentRPE PhysiologyToxic EffectsDifferentiated Cultures
Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image