Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямой синтез ЭМ-видимых наночастиц золота в клетках для анализа локализации белка с хорошо сохранившейся ультраструктурой

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65246

⸱

28 апреля 2023 г.

1National Institute of Biological Sciences, Beijing, 2Tsinghua Institute of Multidisciplinary Biomedical Research, Tsinghua University

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает технологию маркировки клонируемой электронной микроскопией для обнаружения белков, меченных металлотионеином, в клетках с использованием нового метода синтеза наночастиц золота, основанного на механизме подавления аутонуклеации.

Аннотация

Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).

На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.

Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.

Введение

В постгеномную эпоху разработка зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одномолекулярного репортера для световой микроскопии произвела революцию в области современных исследований в области наук о жизни 1,2. На протяжении десятилетий электронная микроскопия (ЭМ) была мощным инструментом для интуитивного наблюдения за клеточной ультраструктурой с наноразмерным разрешением3; Однако точная идентификация и локализация белковых молекул остаются сложной задачей.

Наиболее часто используемым методом ЭМ-мечения является метод маркировки иммуноэлектронной микроскопии (IEM), который основан на реакции антиген-антитело. Однако, несмотря на то, что в области маркировки ИЭМ было разработано множество методов, включая предварительную и поствстраиваемую ИЭМ (на срезах смолы или гидратированных криосекциях), она по-прежнему страдает от низкой эффективности маркировки (<10%)4,5, что связано с подготовкой образцов и качеством антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, разработка генетически закодированных меток имеет большой потенциал применения.

В последние годы были тщательно изучены два основных типа электромагнитных меток. Одним из типов является метод окрашивания DAB, в котором используются такие метки, как APEX2, для окисления 3,3'-диаминобензидина (DAB) до осмофильных полимеров для ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11,12. Он позволяет маркировать белки с высоким содержанием в субклеточных областях, но не подходит для подсчета отдельных молекул. Другой тип использует металлсвязывающие белки, такие как ферритин 13 и металлотионеин (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, для образования электронно-плотных металлических отложений в situ для ЭМ-визуализации. Только последний обладает реальным потенциалом для визуализации и подсчета одномолекул. Молекулярный размер ферритина слишком велик (~ 450 кДа), чтобы его можно было использовать в качестве перспективной метки, в то время как маленький размер (~ 5 кДа) МТ и его способность связывать различные ионы через свои 20 цистеинов привлекли большое внимание. Несколько лабораторий пытались маркировать очищенные белки слияния МТ или клетки, экспрессирующие МТ, путем инкубации непосредственно с Au +. Эти попытки первоначально доказали, что метки МТ могут связывать ионы золота с образованием высококонтрастных сигналов, но ни одна из них не достигла эффективной идентификации отдельных белков в клетках, и они не являются широко применимыми 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

Метод синтеза AuNP на основе ANSM, который включает синтез AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином (например, MT, варианты MT MTn и MTα, AFP) в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации, является первым надежным и применимым подходом к маркировке белков и обнаружению отдельных молекул в клетках24,25,26. Он позволяет осуществлять специфический синтез AuNP на изолированных белках слияния меток и достиг беспрецедентной эффективности маркировки в нефиксированных или химически фиксированных прокариотических (E. coli) и эукариотических (S. pombe) клетках. Однако реализация того же протокола в более продвинутых системах, таких как клетки млекопитающих или даже ткани, сопряжена с дополнительными проблемами, такими как более сложный внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз и более хрупкая клеточная структура.

В этом исследовании представлена клонируемая технология ЭМ-мечения, которая сочетает в себе новый метод синтеза AuNP на основе ANSM для маркировки генетически кодируемых цистеин-богатых меток (MT) с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, что позволяет однозначно идентифицировать меченые белки по одной молекуле в мембране ER, просвете ER и митохондриальном матриксе в клетках HeLa. Современный метод сочетает в себе такие характеристики, как высокая эффективность мечения, высокое отношение сигнал/шум, одномолекулярная маркировка и сильная универсальность, и этот метод имеет широкие перспективы применения в исследованиях в области наук о жизни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все расходные материалы, использованные в этом эксперименте, перечислены в таблице материалов. Пошаговый рабочий процесс текущего протокола показан на рисунке 1.

1. Культура клеток на сапфировых дисках

  1. Перенесите сапфировые диски размером 3 мм x 0,16 мм в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл этанола, и обработайте ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение 10 минут.
  2. Обжигайте каждый сапфировый диск в пламени спиртовой лампы до тех пор, пока на поверхности не исчезнут видимые отложения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью описанного выше метода сапфировые диски можно перерабатывать много раз.
  3. Пометьте одну сторону каждого сапфирового диска номером с помощью стойкий к растворителям ручки (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая маркерная ручка должна быть заранее протестирована, чтобы определить, устойчива ли она к растворителям ацетона и метанола, чтобы предотвратить потерю следов.
  4. Поместите сапфировые диски с маркировкой на дно чашки диаметром 35 мм этикетированной стороной вверх.
  5. Стерилизуйте чашку для культивирования клеток сапфировыми дисками под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.
  6. Переверните сапфировые диски пинцетом (маркированной стороной вниз) и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом еще 30 минут. Теперь культуральная чашка, содержащая сапфировые диски, готова к культивированию клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сапфировые диски также можно стерилизовать автоклавированием.
  7. Засейте клетки на сапфировых дисках, подготовленных выше, и вырастите до 80-90% слияния в клеточном инкубаторе при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO2 (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильные клеточные линии HeLa, экспрессирующие метки MTn, были сгенерированы, как описано в Jiang et al.26.

2. Замораживание под высоким давлением (HPF)

ВНИМАНИЕ: В этом эксперименте используется жидкий азот. При работе с жидким азотом используйте надлежащие техники безопасности и средства индивидуальной защиты для предотвращения обморожения и удушья.

  1. Подготовьте морозильную машину под высоким давлением не менее чем за 2 часа до эксперимента в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Перенесите алюминиевые носители HPF типа A (углубление: 0,025 / 0,275 мм) в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл этанола, и обработайте ультразвуком в ультразвуковом очистителе в течение 10 минут.
  3. Высушите носители в чашке Петри, покрытой качественной фильтровальной бумагой (средней скорости).
  4. Предварительно очищенные носители замочите в 1-гексадецене.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BSA не рекомендуется в качестве криопротектора в текущем эксперименте, так как он будет мешать последующему синтезу наночастиц золота.
  5. Тонким пинцетом возьмите сапфировый диск с клетками из чашки для культивирования; Прикоснитесь к маркированной поверхности качественной фильтровальной бумагой (средней скорости), чтобы удалить излишки среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теплопроводность воды очень низкая, и слишком много остаточной воды повлияет на эффект замораживания. Сохраняйте минимальное количество воды, чтобы предотвратить высыхание клеток.
  6. Установите сапфировый диск в держатель образца HPF и быстро закройте диск алюминиевым носителем глубиной 0,025 мм, содержащим 1-гексадецен (рис. 1C).
  7. Аспирируйте излишки раствора качественной фильтровальной бумагой (средней скорости).
  8. Загрузите держатель образца для замораживания под высоким давлением (рис. 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс загрузки образца должен быть как можно более быстрым (в течение 1 минуты), чтобы свести к минимуму физиологические изменения из-за изменений температуры, влажности, pH и содержания кислорода.
  9. Выгрузите сапфировый диск-носитель под жидким азотом в пенопластовый криобокс и храните узел в криовиале в жидком азоте перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен. Образцы в криовиалах могут храниться в жидком азоте в течение многих лет.

3. Фиксация замораживания (FSF) и регидратация (рис. 1E)

  1. Заполните автоматическую машину замораживания (AFS) жидким азотом и охладите камеру до −90 °C.
    ВНИМАНИЕ: В этом эксперименте используется жидкий азот. При работе с жидким азотом используйте надлежащие техники безопасности и средства индивидуальной защиты для предотвращения обморожения и удушья.
  2. Приготовьте 2 мл 0,01% дубильной кислоты (мас./об.) в ацетоне (раствор FSF 1) в круглом полипропиленовом контейнере диаметром 20 мм (рис. 1E) в вытяжном шкафу и заморозьте его в жидком азоте.
  3. Загрузите образцы (сапфировые диски-держатели в сборе) в контейнер с замороженным раствором FSF 1 под LN2 с помощью пинцета с предварительным охлаждением.
  4. Перенесите контейнер в предварительно охлажденную камеру AFS для обработки FSF при температуре -90 °C.
  5. Хранить образцы при температуре -90 °C в течение 1 часа; Затем отделите сапфировые диски от носителей с помощью предварительно охлажденного пинцета и убедитесь, что отмеченные стороны сапфировых дисков обращены вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пинцет должен быть достаточно предварительно охлажден, чтобы предотвратить изменения температуры. Сапфировые диски должны легко отделяться.
  6. Хранить при температуре −90 °C еще 8-10 ч; затем нагреть до -60 °C в течение 3 часов.
  7. Замените раствор ФСФ 1 в емкости с предварительно охлажденным ацетоном и выдержите в течение 1 ч. Повторите эту стирку ацетоном 2 раза.
  8. Прогреть до −30 °C в течение 3 ч. В течение этого периода готовят и предварительно охлаждают 2 мл 0,01% уранилацетата в ацетоне (раствор FSF 2, разбавленный от 10% уранилацетата в метаноле) в центрифужной пробирке объемом 2 мл.
    ВНИМАНИЕ: Уранилацетат, используемый в текущем эксперименте, радиоактивен и высокотоксичен; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизировать как опасные химические отходы.
  9. Замените ацетон раствором FSF 2 и инкубируйте при -30 ° C в течение 3 ч.
  10. Замените раствор FSF 2 в контейнере предварительно охлажденным ацетоном и инкубируйте в течение 30 мин при -30 °C. Повторите эту стирку ацетоном 2 раза.
  11. Нагревается от −30 °C до 4 °C в течение 2 ч.
  12. Замените ацетон 2 мл 0,2 М буфера HEPES, содержащего 1 мМ CaCl2и 1 мМ MgCl2при рН 5,5.
  13. Смените буфер один раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на одну ночь или продолжаться не менее 6 часов до тех пор, пока образцы снова не будут заморожены на шаге 5.

4. Синтез AuNP на основе ANSM для клеток млекопитающих (рис. 1F)

  1. Промывайте буфером PBS-A 3 раза в течение 5 минут каждый раз.
  2. Перенесите сапфировые диски в культуральную чашку диаметром 35 мм, содержащую 1 мл буфера PBS-A при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите отмеченные стороны сапфировых дисков лицевой стороной вниз и избегайте перекрытия сапфировых дисков и стирания ячеек.
  3. Приготовьте восстановительный раствор, добавив 4,28 мкл 2-меркаптоэтанола в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл буфера PBS-A, и хорошо перемешав в вытяжном шкафу.
    ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен и имеет резкий запах; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности.
  4. Замените буфер PBS-A в чашке для культивирования 1 мл восстановительного раствора и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Подготовьте прекурсор золота перед использованием.
    1. Добавьте 80 мкл 10 мМ HAuCl4 in ddH 2 O в центрифужную пробирку объемом2мл, содержащую 1 мл восстановительного раствора, и немедленно встряхните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может помутнеть.
    2. Добавьте 80 мкл 500 мМ D-пеницилламина в ddH2O в вышеуказанный раствор и немедленно встряхните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение может снова стать ясным.
  6. Замените раствор в чашке для культивирования 1 мл раствора предшественника золота, приготовленного на этапе 4,5, и инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одного миллилитра предшественника золота достаточно для реакции примерно с 1 × 106 клеток (сливающихся на 35-миллиметровой тарелке). Большие объемы прекурсора необходимы, когда AuNP становятся значительно меньше.
  7. Взвесьте 0,0038 г NaBH 4 в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 1 мл ледяного ddH2O и перемешайте, чтобы получить свежие 100 мМ NaBH4 непосредственно перед использованием.
  8. Добавьте 20-100 мкл 100 мМ NaBH 4 в раствор с шага4.6 , немедленно встряхните, чтобы хорошо перемешать, и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 100 мМ NaBH4 для немедленного использования. После добавления NaBH4 цвет раствора постепенно станет красным, а затем станет более глубоким. Если никаких изменений цвета не наблюдается, это в значительной степени указывает на то, что эксперимент провалился.
  9. Замените раствор 2 мл буфера PBS-A, чтобы остановить реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановка реакции в течение 30 минут имеет решающее значение, так как длительная реакция постепенно разрушает AuNP.

5. Замораживание под высоким давлением и фиксация с заменой замораживания (рис. 1C-F)

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы снова представляют собой HPF и FSF, и процедура почти такая же, как и ранее описанная в разделах 2 и 3, с некоторыми изменениями.

  1. Готовят 1% тетраоксид осмия и 0,1% уранилацетат в ацетоне (раствор ФСФ 3, разбавленный 4% тетраоксидом осмия в ацетоне и 10% уранилацетата в метаноле).
    ВНИМАНИЕ: Тетраоксид осмия и уранилацетат являются высокотоксичными химическими веществами; С ними следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизировать как опасные химические отходы.
  2. Загрузите образцы (сапфировые дискодержатели в сборе) в контейнер с замороженным раствором FSF 3 под LN2 с помощью пинцета с предварительным охлаждением.
  3. Перенесите контейнер в предварительно охлажденную камеру AFS для обработки FSF при -90 °C и запустите программу FSF следующим образом: выдерживайте при -90 °C в течение 8-10 часов; затем нагревают до -60 °C в течение 3 часов; хранить при температуре −60 °C в течение 3 ч; затем нагревают до -30 °C в течение 3 часов; хранить при температуре −30 °C в течение 3 ч; затем нагреть до 4 °C в течение 2 часов.
  4. Когда температура достигнет 4 °C, перенесите образцы в вытяжной шкаф и поддерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут.
  5. Промывайте ацетоном 3 раза в течение 15 минут каждый раз.
  6. Выдержать в ацетоне при комнатной температуре не менее 2 ч.

6. Инфильтрация, встраивание и полимеризация смолы

  1. Перед использованием приготовьте смесь эпоксидной смолы в соответствии с инструкциями производителя.
    ВНИМАНИЕ: Эпоксидная смола, используемая в текущем эксперименте, токсична перед полимеризацией; С ним следует обращаться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности. Неполимеризованную смолу следует утилизировать как опасные химические отходы или полимеризовать перед утилизацией.
  2. Перенесите сапфировые диски в капсулы для встраивания с плоским дном и пропитайте смолой не менее 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите маркированные стороны сапфировых дисков лицевой стороной вниз.
  3. Полимеризуйте образец при 60 °C в печи в течение не менее 18 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь после полимеризации. Полимеризованные блоки образцов могут храниться в сухом контейнере годами.

7. Ультратонкое секционирование

  1. Аккуратно обрежьте полимеризованные блоки образцов бритвой, чтобы обнажить сапфировые диски.
  2. Окуните наконечники блоков с сапфировыми дисками в жидкий азот на несколько секунд и разморозьте при комнатной температуре. Повторите действие замораживания-оттаивания несколько раз, чтобы отсоединить диски от блоков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного замораживания, так как это может привести к растрескиванию блоков образца. Аккуратно отсоедините сапфировые диски лезвием, избегая чрезмерного усилия, которое может повредить образцы.
  3. Обрежьте поверхность блока до трапециевидной формы для ультратонкого сечения (рис. 1G).
  4. Получение ультратонких срезов 70-100 нм с ультрамикротомом (рис. 1H).
  5. Подбирайте секции на шестиугольных медных сетках размером 200 меш.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь после секционирования. Срезы на поясах могут храниться в сухой таре годами. При желании срезы на сетках можно окрасить 2% уранилацетоном для получения лучшего мембранного контраста. Следует избегать окрашивания свинцом, так как оно маскирует сигналы частиц нанозолота.

8. ПЭМ-визуализация (рис. 1I)

  1. Исследуйте ультратонкие срезы на медных сетках с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Как правило, диапазон увеличения от 11 кХ до 30 кХ подходит для визуализации AuNP в ячейках, и соответствующее значение расфокусировки необходимо для обеспечения видимости AuNP 2-3 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Метод синтеза AuNP на основе ANSM является чрезвычайно полезным инструментом для маркировки и обнаружения белков, меченных МТ, с помощью TEM26. Чтобы подтвердить его устойчивость в клетках млекопитающих, были сгенерированы три стабильные клеточные линии, экспрессирующие EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn или Mito-acGFP-MTn в клетках Hela. KDEL представляет собой каноническую последовательность удержания/извлечения С-концевого эндоплазматического ретикулума (ER), которая поддерживает слитый белок EGFP-MT...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В исследовании представлена надежная клонируемая технология электромагнитной маркировки для визуализации одномолекулярных белковых молекул в клеточной среде с ультраструктурным разрешением. AuNP, непосредственно синтезированные на генетически кодируемых метках, богатых цистеином, обеспечивают однозначную и точную локализацию белков-мишеней. Метод замораживания под высоким давлением и замораживания-замещения превосходно сохраняет ультраструктуру биологических образцов. Взятые вместе, технология маркировки клонируемой элек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Описанный здесь протокол был взят из статьи, опубликованной Jiang et al. (2020). Эта работа была поддержана грантами MOST (973 программы No 2011CB812502 и 2014CB849902) и финансовой поддержкой муниципального правительства Пекина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,025 мм/0,275 мм Алюминиевый носительBeijing Wulundes Biotech Ltd., или Инженерное бюро M. Wohlwend
0,2 M HEPES буферРастворите HEPES (0,2 М) в 980 мл ddH2O, затем добавьте 10 мл 100 мл MgCl2 и 10 мл 100 мл CaCl2 (конечная концентрация 1 мМ), соответственно, отрегулируйте pH до 5,5
1,5 мл MaxyClear snaplock микропробиркаAxygen ScientificMCT150C
2 мл полипропиленовая винтовая крышка микропробиркиBiologix81-0204
200 меш гексагональная медная сеткаTedpella incG200HEX
2-меркаптоэтанолAmresco0482-250ML
35 мм чашки для клеточных культурCorning
Полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 млCorning430928
АцетонBeiijng Tong Guang Fine Chemicals Company31025
Автоматизированная машина для замещения замерзанияLeicaAFS2
Индивидуальные держатели образцов 3,05 мм x 0,66 мм для HPFBeijing Wulundes Biotech Ltd.
D-пеницилламинTCIP0147
Дульбекко s модифицированный Eagle mediumGBICOC11965500BT
Фетальная бычья сывороткаGBICO10099-141C
Плоское дно встраиваемая капсулаTedpella inc
Пенный криобокс
Formvar 15/95 смолаЭлектронная микроскопия Sciences15800
HAuCl4Sigma4022-1G
HEPESsigma H3375-500G
ВПЧ машинаWohlwend HPF compact01
Methonal Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company12397
NaBH4Sigma480886-25G
OsO4Электронная микроскопия Sciences19110
PBS-A буферРастворение2PO4 (1,125 мМ), Na2HPO4 (3,867 мМ), NaCl (100 mM) в 1 л ddH2O, отрегулируйте до pH 7,4
Качественная фильтровальная бумага (средняя скорость)Beyotime BiotechnologyFFT08
Сапфировые дискиBeijing Wulundes Biotech Ltd., или Инженерное бюро M. Wohlwend
Устойчивая к растворителям ручкаЭлектронная микроскопия Sciences62053-B
SPI-Pon 812 смолаSPI Inc02659-AB
Пропускание электронов микроскопияFEITecnai G2 спирт
Trypsin-EDTAGBICOC25200-056
ПинцетDumont
UltramictotomeLeicaFC7
Uranyl ацетатЭлектронная микроскопия Sciences22400
430165

Ссылки

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  2. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
  3. Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
  4. Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
  5. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
  6. Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
  7. Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
  8. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
  9. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041(2011).
  10. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
  13. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
  14. Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
  15. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
  16. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
  17. Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
  18. Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
  19. Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
  20. Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
  21. Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
  22. Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
  23. Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087(2014).
  24. Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
  25. Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
  26. Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
  27. Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Прямой синтез ЭМ-видимых наночастиц золота в клетках для анализа локализации белка с хорошо сохранившейся ультраструктурой
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.