Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель перипротезной инфекции сустава Candida albicans у мышей

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65263

⸱

2 февраля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

Перипротезная инфекция суставов (ППИ), вызванная опасными патогенами, часто встречается в клинической ортопедии. Существующие животные модели не могут точно смоделировать реальную ситуацию ППИ. Здесь мы создали модель мыши, ассоциированной с биопленкой Candida albicans , для исследования и разработки новых терапевтических средств для лечения ППИ.

Аннотация

Перипротезная инфекция суставов (ППИ) является одной из распространенных инфекций, вызываемых Candida albicans (C. albicans), которая все чаще беспокоит хирургов и ученых. Как правило, в месте инфекции образуются биопленки, которые могут защитить C. albicans от антибиотиков и иммунного клиренса. Хирургическое вмешательство, включающее удаление инфицированного имплантата, санацию, антимикробное лечение и реимплантацию, является золотым стандартом лечения ППИ. Таким образом, создание моделей ППИ на животных имеет большое значение для исследований и разработки новых лекарств или терапевтических средств для лечения ППИ. В этом исследовании гладкая проволока из никель-титанового сплава, широко используемая в ортопедических клиниках, была вставлена в бедренный сустав мыши C57BL/6 до того, как C. albicans были инокулированы в суставную полость вдоль проволоки. Через 14 дней на поверхности имплантатов под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) наблюдались зрелые и толстые биопленки. Значительно сниженная костная трабекула была обнаружена при окрашивании H&E инфицированных образцов суставов. Подводя итог, можно сказать, что была создана мышиная модель PJI, обладающая такими преимуществами, как простота эксплуатации, высокая успешность, высокая повторяемость и высокая клиническая корреляция. Ожидается, что это станет важной моделью для клинических исследований профилактики ППИ, связанной с биопленкой C. albicans.

Введение

Candida albicans (C. albicans) комменсально обитает во многихчастях тела человека1, который также является наиболее распространенным условно-патогенным патогеном, вызывающим опасные для жизни инвазивные грибковые инфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом 2,3. C. albicans может трансформироваться между дрожжами и мицелием в виде полиморфного гриба. Состояние мицелия характеризуется более высокой вирулентностью, более сильной адгезией и инвазией клеток и тканей 4,5. Кроме того, C. albicans может образовывать биопленки на поверхности биомедицинских материалов, таких как зубные протезы, катетеры и стенты 1,6,7. Плотная трехмерная структура биопленок ограничивает инфильтрацию противогрибковых препаратов, экспрессирует гены, устойчивые к лекарственным препаратам, и подавляет метаболизм грибковых клеток, чтобы противостоять клиренсу иммунной системы 6,7. Таким образом, инфекции, связанные с биопленками, в клиниках являются довольно сложной задачей8.

Золотистый стафилококк, коагулазонегативный стафилококк и энтеробактер являются основными патогенами, вызывающими ППИ9. Несмотря на то, что заболеваемость грибковыми ППИ относительно невелика (около 1%)10, стоимость лечения грибковой ППИвыше11, цикл лечения длиннее11, а вероятность успешности леченияниже10, чем бактериальная ППИ. В последние годы заболеваемость грибковыми ППИ растет из года вгод10. На долю Candida PJI приходится 77%-84% грибковых PJI10,12, а C. albicans является наиболее распространенным при Candida (54%). Поэтому грибковые ППИ нуждаются в изучении.

В настоящее время ППИ лечится с помощью ревизионной хирургии путем (1) удаления инфицированного имплантата, (2) санации, (3) антимикробного лечения и (4) реимплантации. После тщательной санации устанавливают антибиотик, содержащий костный цемент, и пациента систематически лечат антибиотиками в течение более 6 недель для эффективного контроля инфекцииперед установкой нового имплантата. Однако этот метод не может полностью устранить возбудителей в тканях, и рецидивирующие инфекции, леченные длительной антимикробной терапией, с высокой вероятностью развиваются у лекарственно-устойчивых штаммов 14,15,16.

Создание моделей ППИ на животных имеет важное значение для исследований и разработки новых лекарств или терапевтических средств для лечения ППИ. При развитии ППИ вокруг протеза образуются большие мертвые пространства, приводящие к образованию гематом, которые в дальнейшем блокируют кровоснабжение окружающих тканей и ухудшают действие антибиотиков11,15. Из-за сложности имитации окружающей среды протеза традиционные животные модели не могут точно смоделировать реальную ситуацию PJI17,18.

В данной работе была построена модель ППИ, ассоциированная с биопленкой C. albicans у мышей, с использованием широко используемой титано-никелевой проволоки для моделирования суставных имплантатов19,20. Эта модель PJI демонстрирует такие преимущества, как простота эксплуатации, высокий процент успешных операций, высокая повторяемость и высокая клиническая корреляция. Ожидается, что он станет важной моделью для изучения профилактики и лечения ППИ, связанной с биопленкой C. albicans.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные были приобретены в Сианьском университете Цзяотун. Все процедуры экспериментов на животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных Сианьского университета Цзяотун (номер одобрения: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Мышей держали в течение одной недели по 5 мышей в клетке. Им был предоставлен свободный доступ к еде и воде. Перед проведением исследования животных содержали при комнатной температуре (RT; 24 °C ± 1 °C) и цикле свет/темнота (12 ч/12 ч).

1. Подготовка буфера и оборудования

  1. Культура клеток C. albicans
    1. Инокулируют моноклональную колонию C. albicans (SC5314) из пластинчатой среды пептон-декстрозы (YPD) экстракта дрожжей с помощью инокулирующей петли в 5 мл жидкой среды YPD (YPD + 50 мкг/мл карбенициллина).
    2. Встряхните клетки C. albicans со скоростью 220 об/мин при 30 °C в течение ночи.
    3. Центрифугируют суспензию при 400 x g в течение 5 мин при RT. Ресуспендируйте клетки C. albicans в обычном физиологическом растворе и разбавьте концентрацию клеток до 1 x 106 клеток/мл, визуально регулируя мутность, чтобы она была такой же, как 0,5 по Макфарланду.
  2. Приготовление физиологического раствора
    1. Взвесьте 0,9 г натрия хлорида и растворите в 100 мл деионизированной воды для приготовления 0,9% физиологического раствора.
  3. Подготовка хирургических инструментов
    1. Перед использованием в автоклаве (121 °C, 30 мин) хирургические инструменты (ножницы, щипцы, гемостатические щипцы, иглодержатели, шовные иглы) и проволока из титано-никелевого сплава (диаметром около 0,5 мм).

2. Создание модели PJI мыши

  1. Случайным образом разделите 30 мышей C57BL/6 (самцы, 15-20 г) на 3 группы (10 мышей/группа), а именно: контрольную группу, группу пустого имплантата (имплантация титан-никелевой проволоки без инфекции C. albicans ) и группу PJI (имплантация титан-никелевой проволоки с инфекцией C. albicans ).
  2. Обезболивайте мышей ингаляцией 1-4% изофлурана перед удалением волос на левой задней конечности и дезинфекцией йодом. Потеря выпрямляющего рефлекса и отсутствие реакции на стимуляцию пальцев ног подтверждает глубину анестезии. Во время анестезии наносите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы и восполнить тепло во время операции и восстановления.
  3. Мышам контрольной группы не проводят никакого лечения. Обеспечьте им свободный доступ к воде и еде.
  4. Для мышей в группе пустых имплантатов и группе PJI сделайте продольный разрез 5 мм на колене каждой левой задней конечности лезвием #10 или стерильной бритвой, чтобы обнажить суставы.
  5. В бедренном интрамедуллярном канале сделать отверстие длиной 5 мм, введя стерильную иглу шприца (26 г).
  6. Вставьте гладкую проволоку из никель-титанового сплава (диаметром 0,5 мм, длиной 5 мм) в отверстие перед разрезанием ножницами (рисунок 1).
  7. Для мышей в группе пустых имплантатов добавьте 2 мкл среды YPD вдоль проволоки из никель-титанового сплава капля за каплей, прежде чем закрыть рану слой за слоем с помощью нейлонового шовного материала (диаметр 0,15 мм).
  8. Для мышей в группе PJI инокулируют 2 мкл клеток C. albicans (1 × 106 клеток/мл) в суставное пространство мышей вдоль проволоки из никель-титанового сплава капля за каплей, прежде чем закрыть рану слой за слоем с помощью нейлонового шва.
  9. Обеспечьте мышам свободный доступ к воде и пище в течение 14 дней. Мелоксикам вводят подкожно (4 мг/кг) каждые 24 ч в течение 3 дней.
  10. Через 14 дней обезболивайте мышей 3% изофлураном, прежде чем усыплять мышей вывихом шейки матки.

3. Оценка модели PJI

  1. Оценка инфекций в основных органах
    1. Соберите почки, печень и селезенку у мышей после эвтаназии.
    2. Добавьте 500 мкл стерильного физиологического раствора в каждый орган и измельчите ткани на гомогенизаторе при 4 °C.
    3. Добавьте 100 мкл гомогената, приготовленного на шаге 3.1.2, в пластину YPD, а затем равномерно распределите ее изогнутым стержнем.
    4. Поместите перевернутые пластины YPD в инкубатор с температурой 37 °C на 48 ч.
    5. Наблюдайте и подсчитывайте количество колоний визуально.
  2. Наблюдение за C. albicans и биопленками на имплантатах
    1. Аккуратно разрежьте ножницами кожу над суставом мышей перед сбором имплантата пинцетом.
    2. Держите имплантаты погруженными в 2,5% раствор глутарового альдегида для фиксации при 4 °C в течение 48 ч.
    3. Промойте имплантаты стерильным PBS три раза, прежде чем погрузить их в 1% раствор осмиевой кислоты на 3 ч.
    4. Промойте имплантаты стерильным PBS три раза, прежде чем погрузить их в 50%, 70%, 80%, 90% и 100% растворы этанола на 15 минут для обезвоживания.
    5. Трижды погрузите имплантаты в трет-бутанол на 30 минут, а затем высушите их сублимационной сушкой.
    6. Закрепите образцы имплантатов на предметном столике, напылите на имплантат золото (покрытие 10 нм) и наблюдайте за ним под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) в условиях высокого вакуума и напряжения 1,5 кВ.
  3. Патологоанатомический анализ тканей бедренной кости
    1. Соберите ткани бедренной кости ножницами после эвтаназии мышей.
    2. Погрузить ткани бедренной кости в 4% раствор параформальдегида для фиксации при 4 °С на 48 ч.
    3. Поместите ткани бедренной кости в 10% формалин на 1 неделю.
    4. Обезвоживают ткани бедренной кости, погружая их в 50%, 70%, 80%, 90% и 100% растворы этанола на 15 мин соответственно.
    5. Поместите обезвоженные ткани бедренной кости в парафин, прежде чем разделить ткани на образцы размером 4 мкм с помощью микротома.
    6. Окрашивание бедренных срезов гематоксилином и эозином в соответствии со стандартным протоколом перед патологоанатомическим анализом21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перенос образцов на планшетную среду и подсчет колоний после ночной инкубации обычно используется для оценки локальной патогенной нагрузки вблизи поражения22,23. В нашем исследовании микробная культура образцов печени, почек и селезенки была отрицательной, что указывает на то, что модель в этом исследовании приводила только к местной инфекции, а не к системной инфекции у мышей23.

СЭМ-изображения имплантатов пока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инфекция, вызванная загрязнением хирургических инструментов или операционной среды во время операции, является основной причиной большинства инфекций имплантатов 24,25,26,27. Таким образом, в данном исследовании была построена модель PJI, связанная с биопленкой мышей C. albicans. По сравнению с традиционной моделью PJI, в которой в качестве имплантата использовались стерильные частицы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Благодарности

Мы благодарны за финансовую поддержку Фонду естественных наук провинции Шэньси (номер гранта 2021SF-118) и Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 81973409, 82204631).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 ° C холодильникElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Аналитические весыShimadzuATX124
Автоклавы СтерилизаторSANYOMLS-3750
КарбенициллинAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon вертикальный оптический микроскоп NikonEclipse Ts2-FL
ГлюкозаMacklin 
Кольцо для инокуляцииThermo Scientific251586
изофлуранаRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
параформальдегидаBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
RWD R550 многоканальный аппарат для анестезии мелких животных RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Температурный инкубаторShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Генератор воды сверхчистой водыHeal ForceNW20VF
Ультразвуковой аппаратDo-ChromDS10260D
Экстракт дрожжейThermo Scientific  ОксоидныйLP0021B
D823520

Ссылки

  1. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  2. Fan, F., et al. Candida albicans biofilms: antifungal resistance, immune evasion, and emerging therapeutic strategies. International Journal of Antimicrobial Agents. 60 (5-6), 106673(2022).
  3. Tong, Y., Tang, J. Candida albicans infection and intestinal immunity. Microbiological Research. 198, 27-35 (2017).
  4. Kanaguchi, N., et al. Effects of salivary protein flow and indigenous microorganisms on initial colonization of Candida albicans in an in vivo model. Bmc Oral Health. 12, 36(2012).
  5. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  6. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  7. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  8. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. The International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  9. Miller, R., et al. Periprosthetic joint infection: A review of antibiotic treatment. JBJS Reviews. 8 (7), e1900224(2020).
  10. Brown, T. S., et al. Periprosthetic joint infection with fungal pathogens. The Journal of Arthroplasty. 33 (8), 2605-2612 (2018).
  11. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  12. Schoof, B., et al. Fungal periprosthetic joint infection of the hip: a systematic review. Orthopedic Reviews (Pavia). 7 (1), 5748(2015).
  13. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  14. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  15. Stocks, G., Janssen, H. F. Infection in patients after implantation of an orthopedic device. ASAIO Journal. 46 (6), S41-S46 (2000).
  16. Shahi, A., Tan, T. L., Chen, A. F., Maltenfort, M. G., Parvizi, J. In-hospital mortality in patients with periprosthetic joint infection. The Journal of Arthroplasty. 32 (3), 948-952 (2017).
  17. Carli, A. V., Ross, F. P., Bhimani, S. J., Nodzo, S. R., Bostrom, M. P. Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 98 (19), 1666-1676 (2016).
  18. Stavrakis, A. I., Niska, J. A., Loftin, A. H., Billi, F., Bernthal, N. M. Understanding infection: A primer on animal models of periprosthetic joint infection. The Scientific World Journal. 2013, 925906(2013).
  19. Qiao, B., Lv, T. Electrochemical investigation of interaction of candida albicans with titanium-nickel implant in human saliva. International Journal of Electrochemical Science. 17 (2), 22028(2022).
  20. Oh, Y. R., Ku, H. M., Kim, D., Shin, S. J., Jung, I. Y. Efficacy of a Nickel-titanium ultrasonic instrument for biofilm removal in a simulated complex root canal. Materials. 13 (21), 4914(2020).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining. Histopathology: Methods and Protocols. Christina E, D. ay , Springer, New York. 31-43 (2014).
  22. Sinclair, K. D., et al. Model development for determining the efficacy of a combination coating for the prevention of perioperative device related infections: A pilot study. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (7), 1143-1153 (2013).
  23. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels, on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  24. Zahar, A., Sarungi, M. Diagnosis and management of the infected total knee replacement: a practical surgical guide. Journal of Experimental Orthopaedics. 8 (1), 14(2021).
  25. Parvizi, J., Jacovides, C., Zmistowski, B., Jung, K. A. Definition of periprosthetic joint infection: Is there a consensus. Clinical Orthopaedics and Related Research. 469 (11), 3022-3030 (2011).
  26. Karczewski, D., et al. Candida periprosthetic joint infections - risk factors and outcome between albicans and non-albicans strains. International Orthopaedics. 46 (3), 449-456 (2022).
  27. Cobo, F., Rodriguez-Granger, J., Sampedro, A., Aliaga-Martinez, L., Navarro-Mari, J. M. Candida prosthetic joint infection. A review of treatment methods. Journal of Bone and Joint Infection. 2 (2), 114-121 (2017).
  28. Cobrado, L., Silva-Dias, A., Azevedo, M. M., Pina-Vaz, C., Rodrigues, A. G. In vivo antibiofilm effect of cerium, chitosan and hamamelitannin against usual agents of catheter-related bloodstream infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68 (1), 126-130 (2013).
  29. Vila, T., et al. Therapeutic implications of C. albicans-S. aureus mixed biofilm in a murine subcutaneous catheter model of polymicrobial infection. Virulence. 12 (1), 835-851 (2021).
  30. Nishitani, K., et al. Quantifying the natural history of biofilm formation in vivo during the establishment of chronic implant-associated Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice to identify critical pathogen and host factors. Journal of Orthopaedic Research. 33 (9), 1311-1319 (2015).
  31. Ormsby, R. T., et al. Evidence for osteocyte-media ted bone-matrix degradation associated with periprosthetic joint infection (PJI). European Cells & Materials. 42, 264-280 (2021).
  32. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).
  33. Harro, J. M., et al. Development of a novel and rapid antibody-based diagnostic for chronic staphylococcus aureus infections based on biofilm antigens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), e01414-e01419 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

перипротезная инфекция суставамышиная модель перипротезной инфекции суставаформирование биопленкиникель-титановый имплантатмодель инфекции на животныхинфекция суставного имплантатаантимикробная терапиясканирующая электронная микроскопияпотеря костных трабекул
Модель перипротезной инфекции сустава Candida albicans у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.