Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

Биология жировой ткани привлекает все большее внимание из-за растущей распространенности ожирения и диабета 2 типа во всем мире¹. Адипоциты хранят избыточную энергию в виде липидных капель, которые высвобождаются при голодании. Кроме того, жировая ткань поддерживает системный энергетический гомеостаз, выступая в качестве эндокринного органа и сообщаясь с другими тканями ^2,3. Интересно, что как избыток жировой ткани (ожирение), так и потеря жира (липодистрофия) связаны с резистентностью к инсулину и диабетом¹. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и бежевые¹. Белые адипоциты в основном хранят избыточную энергию в виде липидов, тогда как коричневые и бежевые адипоциты рассеивают энергию в виде тепла через митохондриальный разъединяющий белок-1 (Ucp1)^1,4. Примечательно, что бежевые адипоциты (также называемые «индуцируемыми» коричневыми адипоцитами) появляются в белой жировой ткани в ответ на холодную или симпатическую стимуляцию и демонстрируют паттерны экспрессии генов, которые перекрываются, но отличаются от таковых у «классических» коричневых адипоцитов⁵. В последнее время коричневые и бежевые адипоциты стали потенциальными мишенями для лечения ожирения и диабета, направленного на «усиление рассеивания энергии», а не на «подавление потребления энергии»⁴. Кроме того, сообщается, что аллель риска варианта ожирения FTO rs1421085 у людей, который демонстрирует самую сильную связь с более высоким индексом массы тела (ИМТ) среди распространенных вариантов^6,7 и демонстрирует различные взаимодействия генов и окружающей среды^8,9, отрицательно регулирует дифференцировку и функцию бежевых адипоцитов¹⁰. Рецептор γ, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), известен как главный транскрипционный регулятор адипогенеза и необходим и достаточен для дифференцировки адипоцитов¹¹. Регуляторы транскрипции, такие как гомологичный домен PRD1-BF1-RIZ1, содержащий 16 (PRDM16), ранний фактор В-клеток 2 (EBF2) и ядерный фактор I-A (NFIA), имеют решающее значение для дифференцировки и функции адипоцитов коричневого и бежевого цвета 12,13,14,15,16,17,18. С другой стороны, программирование генов белых адипоцитов требует регуляторов транскрипции, таких как трансдуциноподобный энхансерный белок 3 (TLE3) и белок цинкового пальца 423 (ZFP423)19,20,21.

Модельные системы in vitro позволяют проводить молекулярные исследования, направленные на улучшение понимания механизма (механизмов), лежащего в основе функций и дисфункций адипоцитов. Хотя существуют общедоступные и иммортализированные клеточные линии преадипоцитов, такие как 3T3-L1 и 3T3-F442A^22,23,24, культура первичных преадипоцитов и дифференцировка в адипоциты были бы более подходящей моделью для изучения адипогенеза in vivo. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из жировой ткани мышей является известным методом получения первичных преадипоцитов^25,26. Однако коллагеназное расщепление жировой ткани, которое обычно выполняется с помощью бактериального шейкера с трубчатой стойкой, может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению^27,28. Здесь мы описываем альтернативный протокол, в котором используется мягкий диссоциатор тканей с магнитно-активированной клеточной сортировкой (MACS) для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF.

Все эксперименты на животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Токийского университета и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами Токийского университета.

1. Приготовление ферментного раствора и среды

1. Поместите обе стороны паховой белой жировой ткани (правая и левая сторона, примерно 150 мг) от 7-8-недельной мыши и 2,5 мл раствора фермента в пробирку С диссоциатора.
2. Восстановите фермент D с помощью 3 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) / F12 без эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) или антибиотиков, фермент R с 2,7 мл DMEM / F12 без FBS или антибиотиков и фермент A с 1 мл буфера A.
3. Приготовьте 2,5 мл раствора фермента, добавив 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R, 12,5 мкл фермента A и 2,35 мл DMEM/F12 без FBS или антибиотиков в пробирку C. Установите пробирку C с раствором фермента на лед.

2. Изоляция жировой ткани

1. Усыпить 7-8-недельных самцов мышей C57BL/6J (примерно 20 г) при вывихе шейки матки.
2. На чистой скамье, чтобы изолировать паховую белую жировую ткань, разрежьте кожу тупыми/острыми ножницами на животе и по направлению к нижним конечностям. Изолируйте жировую ткань с внутренней стороны бедер с помощью острых/острых ножниц. Одна сторона паховой жировой ткани содержит ~ 75 мг.
3. Поместите изолированную жировую ткань в пробирку C с раствором фермента на льду и держите трубку в пределах чистой скамьи для поддержания стерильности.

3. Измельчение и переваривание жировой ткани

1. На чистом столе добавьте 2,5 мл раствора фермента в пробирку С.
2. Жировую ткань измельчить на мелкие кусочки, разрезав острыми/острыми ножницами 50 раз. Разрежьте жировую ткань на ~2 мм² части.
3. Плотно закройте колпачок трубки С, переверните трубку вверх дном и прикрепите ее к рукаву диссоциатора тканей колпачком. Затем переваривайте образец в течение ~40 минут при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался диссоциатор gentleMACS Octo с нагревателями (Miltenyi Biotec 130-096-427) и предустановленная программа «37C_mr_ATDK_1».

4. Фильтрация клеточной суспензии

1. Предварительно подогрейте DMEM/F12, содержащий 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, до 37 °C.
2. Отсоедините трубку C от тканевого диссоциатора и остановите пищеварение, добавив 5 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и осторожно пипетируя четыре раза.
3. Центрифуга при 700 x g в течение 10 мин при 20 °C.
4. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
5. Ресуспендируйте гранулу, добавив 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и осторожно пипетируйте пять раз.
6. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр диаметром 70 мкм, помещенный в новую пробирку объемом 50 мл.
7. Центрифугу при 250 x g в течение 5 мин и ресуспендировать гранулу в 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).

5. Обшивка ячеек

1. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
2. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, добавив 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и десять раз пипетируя.
3. Поместите клеточную суспензию на 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном, и поместите посуду в инкубатор клеточных культур (37 °C, 5% CO 2) на_1-2 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда с коллагеновым покрытием не является абсолютной необходимостью. Однако, основываясь на опыте, чашки, покрытые коллагеном, действительно помогают прилипать к преадипоцитам и, таким образом, увеличивают выживаемость клеток.
4. Аспирируйте среду и дважды промойте клетки 3 мл PBS за стирку.
5. Добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и верните посуду в инкубатор клеточных культур (37 ° C, 5% CO₂).

6. Пассаж преадипоцитов

1. На следующий день аспирируйте среду (клетки будут адгезивными, и, таким образом, среда может быть аспирирована), дважды промойте клетки 3 мл PBS на промывку и добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
2. Когда клетки достигают 80% слияния (обычно через 4 дня после выделения SVF), разделите клетки на четыре 10-сантиметровые чашки, покрытые коллагеном.
   1. В частности, аспирируют среду, промывают клетки PBS (комнатная температура [RT]), добавляют 1 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина и инкубируют в течение 5 мин в инкубаторе клеточных культур.
   2. Добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, чтобы погасить активность трипсина. После пипетки центрифугу при 440 х г в течение 5 мин.
   3. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки, добавив 40 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и поместите клетки в четыре чашки с коллагеновым покрытием по 10 см.
3. Пройдите клетки снова, когда они достигнут 80% слияния.

7. Подготовка ретровируса, экспрессирующего большой Т-антиген SV40, для иммортализации преадипоцитов (опционально)

1. Не менее чем за 3 дня до иммортализации планшет Platinum-E (Plat-E) упаковывает^{клетки 29} плотностью 3,0 х 10,5 клеток/мл в 2 мл DMEM с 10% FBS без антибиотиков. Используйте гемацитометр для подсчета клеток.
2. На следующий день трансфицируйте 4 мкг pBABE-neo largeTcDNA (добавьте ген плазмиды #1780) с использованием Lipofectamine 2000, согласно инструкциям производителя.
3. Через 24 ч аспирировать среду и добавить 2 мл ДМЭМ с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
4. На следующий день заготавливайте ретровирусную надосадочную жидкость. Ретровирус можно использовать для иммортализации сразу или хранить при -80 °C.

8. Иммортализация преадипоцитов большим Т-антигеном SV40 (опционально)

1. Прохождение и расширение преадипоцитов дважды после выделения SVF.
2. Планшетируют клетки в 6-луночные планшеты с плотностью 0,5-1,0 х 10⁴ клеток/мл в 2 мл DMEM/F12 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином. Используйте гемацитометр для подсчета клеток.
3. На следующий день приготовьте 250 мкл свежего или размороженного ретровируса, экспрессирующего большой Т-антиген SV40, на лунку 6-луночных планшетов. Центрифугу при 440 x g в течение 5 мин и поместите надосадочную жидкость в новую пробирку.
4. Добавьте 750 мкл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и 1 мкл полибрена на 250 мкл ретровирусной надосадочной жидкости, чтобы сделать рабочий вирус.
5. Аспирируйте среду и добавьте 1000 мкл рабочего ретровируса в каждую лунку, содержащую преадипоциты.
6. Добавьте 1 мл DMEM/F12 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином через 4 часа.
7. На следующий день разделите инфицированные преадипоциты в 10-сантиметровую чашку и отберите инфицированные клетки с помощью DMEM/F12, содержащего 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 500 мкг/мл неомицина. Чтобы следить за подбором антибиотиков, приготовьте блюдо из неинфицированных клеток с неомицином.
8. Продолжайте вводить инфицированные клетки неомицином до тех пор, пока все неинфицированные клетки в чашке монитора не умрут.

9. Дифференцировка адипоцитов

1. Тарелка ячеек. Для 12-луночных планшетов планшетируют клетки с плотностью 4,0 x 10⁴ клеток/мл в 1 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
2. Когда преадипоциты становятся сливающимися (через 48-72 ч после нанесения покрытия), аспирируют среду и заменяют ее дифференцировочной средой (см. Таблицу 1 для состава).
3. На 2-й день дифференцировки (т.е. через 48 ч после индукции дифференцировки) замените среду поддерживающей средой (состав см. в таблице 1 ). После этого меняйте среду для обслуживания каждые 2 дня. Терминальная дифференциация достигается на 7-й день дифференциации.
4. Масляное красное окрашивание
   1. Для окрашивания в масляный красный цвет аспирируйте среду и промойте клетки 1 мл PBS на лунку. Зафиксируйте клетки, добавив 1 мл 4% формальдегида на лунку, и инкубируйте клетки в течение 15 минут при RT.
   2. Во время инкубации разбавляют 0,5%-ный масляный красный раствор (в изопропиловом спирте) до 0,3% с помощью_ddH2Oи фильтруют рабочий раствор с помощью фильтровальной бумаги.
   3. После 15 мин инкубации удалить формальдегид, промыть клетки 60% изопропиловым спиртом, добавить 1 мл отфильтрованного масла красного или рабочего раствора и инкубировать в течение 1 ч при ЛТ.
   4. После инкубации промойте клетки проточной водой. Затем наблюдайте за липидными адипоцитами под перевернутым микроскопом (увеличение: 20-кратный объектив и 10-кратный окуляр).
5. Анализ экспрессии мРНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 2 для списка праймеров, использованных в этом исследовании.
   1. Аспирируйте среду и добавьте в лунку 1 мл/лунку тризола.
   2. Инкубируют в течение 15 мин при ЛТ, отделяют клетки пипеткой и собирают образцы в пробирки объемом 1,5 мл. Образцы можно хранить при -80 °C до экстракции РНК.
   3. Разморозьте замороженный образец до RT, добавьте в образец 200 мкл хлороформа и энергично встряхните в течение 15 с.
   4. Инкубируют образец при RT в течение 3 мин, а затем отжимают при 20 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
   5. Осторожно удалите водную фазу (верхнюю, бесцветную) и переложите в новые пробирки. Никогда не переносите белковую фазу (среднюю, белую) или фенольную/хлороформную фазу (нижнюю, розовую).
   6. Медленно добавьте равный объем 70% EtOH и аккуратно перемешайте. Не вихревые.
   7. Загрузите образец (до 700 мкл) в спиновую колонку РНК, расположенную в пробирке для сбора. Обязательно включите любой осадок, который мог образоваться.
   8. Отжим при 9 000 x g в течение 30 с при 4 ° C, а затем выбросьте проточку.
   9. Добавьте 700 мкл буфера RW1, отжимайте при 9 000 x g в течение 30 с при 4 ° C, а затем откажитесь от проточного потока.
   10. Перенесите колонку в новую сборную пробирку и добавьте 500 мкл буферного RPE.
   11. Отжим при 9 000 x g в течение 30 с при 4 °C, а затем выбросьте проточку.
   12. Добавьте 500 мкл буферного RPE, отжимайте при 9000 x g в течение 2 мин при 4 °C, а затем откажитесь от проточного потока.
   13. Перенесите колонку в новую сборную трубку и отжимайте (колонки без буфера) при 9 000 x g в течение 1-2 мин при 4 °C.
   14. Перенесите колонку в новую сборную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 30 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно на мембрану колонки.
   15. Инкубируйте образец при ЛТ в течение 1-2 мин. Затем вращайте при 9,000 x g в течение 1 минуты при 4 ° C, чтобы разбавить РНК.
   16. Проверьте концентрацию РНК с помощью флуороспектрометра.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь рекомендуется выровнять концентрацию.
   17. Выполните обратную транскрипцию с использованием ~ 200 нг шаблона РНК. Используйте коммерческий набор для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР-ОТ) и следуйте протоколу производителя. После реакции разбавьте кДНК в 20 раз до 200 мкл.
   18. Добавьте 2,0 мкл кДНК, 3,0 мкл Power Sybr Green Master Mix, 0,018 мкл 100 мкМ прямого праймера кПЦР, 0,018 мкл обратного праймера 100 мкМ кПЦР и 0,96 мкл ddH2O в каждую лунку 384-луночного планшета.
   19. Запустите кПЦР (стадия выдержки: 50 ° C в течение 2 мин и 95 ° C в течение 2 мин; Стадия ПЦР: 40 циклов при 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин; стадия кривой плавления: 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 мин и 95 °C в течение 15 с). Используйте метод стандартной кривой для количественной оценки.

Этот протокол дает полностью дифференцированные, насыщенные липидами адипоциты через 7 дней после индуцирования дифференцировки адипоцитов. Степень дифференцировки адипоцитов можно оценить с помощью окрашивания триглицеридов и липидов масляным красным цветом (рис. 1А) или анализа экспрессии мРНК с использованием кПЦР-ЛТ генов адипоцитов, таких как главный регулятор адипогенеза Pparg и его мишень Fabp4 (рис. 1B). Чтобы индуцировать дифференцировку бежевых адипоцитов in vitro, можно использовать класс тиазолидиндионов агонистов PPARγ, таких как росиглитазон. Действительно, в экспериментах с росиглитазоном мы наблюдаем дозозависимое влияние концентраций до 1 мкМ на уровни экспрессии генов, специфичных для бурых жиров, таких как Ucp1 и Ppargc1a. С другой стороны, влияние росиглитазона на Fabp4 насыщено при концентрации 0,1 мкМ (рис. 1С).

Дифференцированные адипоциты, полученные по этому протоколу, могут быть использованы для различных функциональных и механистических анализов, таких как анализ скорости потребления кислорода (OCR)16,30 (рис. 2А) и иммунопреципитация хроматина 31 (ХИП; Рисунок 2В). Иммортализированные преадипоциты могут храниться в системе хранения клеток жидкого азота без потери жизнеспособности и могут быть разморожены в любое время для использования в экспериментах.

Рисунок 1: Дифференцировка преадипоцитов в липидные адипоциты. (A) SVF из паховой белой жировой ткани (iWAT) мышей дикого типа окрашивали масляным красным o на 0-й или 7-й день дифференцировки адипоцитов. (B) уровни экспрессии мРНК Pparg и Fabp4 на 0-й и 7-й день дифференцировки адипоцитов (среднее ± стандартная ошибка среднего значения [S.E.M.]; N = 3). (C) экспрессия мРНК общего маркера адипоцитов Fabp4 и специфических для бурого жира генов Ucp1 и Ppargc1a в адипоцитах, полученных из SVF, обработанных росиглитазоном 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкМ, вместе с средой для дифференцировки и поддержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Примеры функционального и механистического анализа с дифференцированными адипоцитами. (A) OCR-анализ адипоцитов, полученных из iWAT SVF (N = 10). (B) ChIP-qPCR для H3K27Ac в адипоцитах, полученных из Nfia flox/flox iWAT SVF, на 0-й и 7-й день дифференцировки. Сайты Ins-0,4 КБ и Fabp4-13 КБ отображаются как фоновые сайты (среднее значение ± S.E.M.; N = 2). В обоих экспериментах росиглитазон добавляли 1,0 мкМ вместе с дифференцировочной и поддерживающей средой, чтобы индуцировать дифференцировку бежевых адипоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав дифференциации и поддерживающей среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Список праймеров, использованных в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Ни один из авторов не имеет конкурирующего финансового интереса, связанного с этой работой.