Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004^году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет количественное присутствие этих белков; более того, его преимущество заключается в специфическом обнаружении NET-подобных структур. В НВЛ упомянутые белки локализуются с внеклеточной ДНК, что может быть обнаружено по перекрытию сигналов флуоресценции каждого окрашенного белка и внеклеточной ДНК. В отличие от перекрывающихся сигналов, обусловленных внеклеточной локализацией ДНК и белков в НВЛ, интактные нейтрофилы не демонстрируют колокализации. Здесь компоненты НВЛ обычно хранятся отдельно в гранулах, ядрах и цитозоле³.

С момента их первого открытия было показано, что НВЛ играют центральную роль во многих заболеваниях, особенно в тех, которые связаны с воспалением. НВЛ проявляют антимикробные функции во время инфекции путем захвата и уничтожения внеклеточных патогенов в крови и тканях ^4,5. Тем не менее, НВЛ также связаны с аутоиммунными заболеваниями и гипервоспалительными реакциями, такими как системная красная волчанка, ревматический артрит и аллергическая астма ^6,7,8. НВЛ способствуют вазоокклюзии и воспалению при атеросклерозе, адгезии тромбоцитов и, как предполагается, играют роль в развитии метастатического рака 9,10,11. Тем не менее, считается, что они обладают противовоспалительными свойствами, снижая уровень провоспалительных цитокинов¹². В то время как НЭО вызывают все больший интерес в более широкой области исследований, надежный метод обнаружения НЭО имеет фундаментальное значение для будущих исследований.

Несмотря на то, что визуализация НВЛ в различных тканях с помощью иммунофлуоресцентной визуализации сложна и требует адаптации, помимо электронной микроскопии, в настоящее время она является одним из наиболее известных методов визуализации взаимодействий между НВЛ и клетками и преимущественно используется в фиксированных формалином тканях, залитых парафином (FFPE)^13,14. Тем не менее, сравнение NET-изображений затруднено, так как разные лаборатории используют свои собственные индивидуальные протоколы. Эти протоколы отличаются использованием антител, методом извлечения антигена или пермеабилизации и часто оптимизированы для определенного типа тканей 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

После того, как Brinkmann et al. опубликовали первое методическое исследование с использованием иммунофлуоресцентной визуализации НВЛ в тканях FFPE, мы захотели оптимизировать этот протокол для более широкого спектра тканей и^видов15. Кроме того, чтобы создать широко применимый протокол иммунофлюоресценции, мы протестировали различные модифицированные протоколы исследований, в которых использовались методы иммунофлуоресценции в тканях FFPE для обнаружения НВЛ 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Кроме того, мы попробовали новое антитело H3cit для более специфического внеклеточного окрашивания²⁸. Мы предполагаем, что, систематически адаптируя существующие протоколы окрашивания к различным видам и тканям, визуализация in vitro может быть улучшена, что приведет к лучшему представлению взаимодействия между нейтрофилами и НВЛ как локально, так и системно.

В это исследование были включены ткани мышей, полученные в ходе экспериментов, одобренных Гамбургским государственным управлением по исследованиям на животных, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Гамбург, Германия (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). В качестве тканей использовались мышиные легкие и толстая кишка из септической модели и обожженная кожа. Мы использовали 8-недельных самцов и самок мышей. Во всех экспериментах соблюдалась Европейская директива 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях. Обезличенные образцы человека включали ткани неонатального энтероколита, обожженной кожи, атрезию желчевыводящих путей, спондилодисцит и миокард. По данным Комитета по этике медицинских исследований Гамбурга, образцы не требовали информированного согласия, но исследование было одобрено комитетом (WF-026/21).

1. Фиксация образца

1. Используйте следующий протокол, основанный на Абу Абеде и Бринкманне, для фиксации образца, обезвоживания, встраивания парафина, секционирования и монтажа ^3,15.
   1. Приготовьте 4% раствор формальдегида, растворив 40 г параформальдегида (PFA) в 800 мл трис-буферного физиологического раствора, pH 7,4 (TBS).
   2. Перемешайте смесь при температуре 60 °C под вытяжным шкафом до тех пор, пока PFA не растворится. Доведите раствор до комнатной температуры (RT) и отрегулируйте объем с помощью TBS до 1 000 мл.
   3. Отрегулируйте pH до 7,4. Хранить при температуре 4 °C в течение 2-3 недель или при температуре −20 °C в течение 1 года.
2. Для фиксации образца поместите свежую ткань в буфер TBS и разделите на кусочки размером менее 20 мм x 30 мм x 3 мм. Срезы тканей погружают в 4% раствор параформальдегида на 12-24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В оригинальном протоколе использовался 2% раствор PFA и время фиксации 8-20 ч. При этом методе некоторые срезы тканей не были полностью зафиксированы через 20 ч, поэтому концентрацию ПФА увеличивали до 4% ПФА.
3. Перенесите образцы в маркированные кассеты для обработки тканей. Для маркировки используйте маркеры или карандаши, устойчивые к растворителям.
4. Начните обезвоживание образца, погрузив затем кассеты в 70% этанол на 1 ч. Затем погрузите в 80% этанол, 90% этанол, 96% этанол и дважды в 100% этанол, каждый этап длится 1 час.
5. Дважды погрузить в 100% ксилол (диметилбензол), а затем дважды в парафин с температурой 60 °C на 1 ч каждый раз.
6. Используйте формы для встраивания для монтажа и дайте парафину затвердеть, прежде чем снимать форму.
7. Используйте микротом для вырезания срезов ткани толщиной 3 мкм.
8. С помощью пинцета положите срезы на водяную баню с температурой 37 °C и дайте им всплыть на поверхности, чтобы растянуть срезы ткани.
9. Поместите секции на клейкие предметные стекла (Таблица материалов) и дайте им высохнуть в течение ночи в термокамере с температурой 40 °C.

2. Регидратация образца

1. Для депарафинизации сложите предметные стекла в стойку для салазок и дважды погрузите на 5 минут каждый в замещающую среду лимонена ксилола (таблица материалов) и один раз на 5 минут в смесь лимонена и этанола 1:1.
   ВНИМАНИЕ: Лимонен легко воспламеняется при температуре 50 °C и может вызвать аллергические реакции. Используйте под вытяжным шкафом с защитными очками и перчатками. Беречь от открытого огня.
2. Регидратируйте образцы в нисходящей серии этанола, дважды погрузив ползунок в 100% этанол и один раз в 96% этанола, 90% этанола, 80% этанола и 70% этанола на 5 минут каждый.
3. Погрузите решетку на 5 минут в деионизированную воду (деионизированную воду), чтобы удалить оставшийся этанол.

3. Блокирование аутофлуоресценции и извлечение антигена

1. Приготовьте целевой раствор для извлечения цитрата pH 6 (TRS) (таблица материалов) в соответствии с техническим описанием. Этот TRS концентрируется в 10 раз. Поэтому разбавляйте 1:10 деионизированной водой. Разогрейте в пластиковой банке для окрашивания до 96 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TRS разрывает метиленовые мостики, образующиеся во время фиксации образца, чтобы обнажить эпитопы антигена. Это позволяет первичным антителам связываться со своим антигеном-мишенью. Хранить концентрированный TRS при температуре 2-8 °C в течение 8 месяцев. Всегда готовьте свежие TRS.
2. Выньте слайды из стойки и поместите их во влажную камеру. Нанесите пипеткой одну-две капли автофлуоресцентного восстановителя (таблица материалов) на каждый образец. Инкубировать 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аутофлюоресцентный редуцирующий агент блокирует присущую тканям автофлуоресценцию, вызванную эндогенными флуорофорами и фиксаторами. Храните автофлуоресцентно-восстановительный агент в RT до 1 года.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте только с небольшими участками тканей, чтобы избежать высыхания образцов или превышения времени инкубации.
3. Сложите предметные стекла обратно в стойку для слайдов и промойте в течение 1 минуты в 60% этаноле, используя движения вверх и вниз, пока не будет смыт весь неиспользованный реагент, снижающий автофлуоресценцию.
4. Погрузите решетку на 5 минут в деионизированную воду.
5. Для получения антигена перенесите предметные стекла в банку для окрашивания с предварительно нагретым TRS. Выдерживать 10 мин при температуре 96 °C на водяной бане.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Водяную баню с температурой 96 °C можно заменить микроволновой печью или пароваркой, если TRS предварительно нагрета до 96 °C и обеспечено 10-минутное время инкубации при 96 °C.
6. Выньте банку для окрашивания и дайте ей медленно остыть до RT в течение примерно 60-90 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь на срок до 4 часов, оставив слайды в TRS.
7. Снимите TRS, но оставьте предметные стекла в банке. Дважды промойте физраствором с трис-буфером 0,05% Tween (TBST, pH 7,4) в течение 3 минут каждый, чтобы смыть остатки TRS.
8. Для пермеабилизации приготовьте 0,2% Тритон в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, и залейте его в банку для окрашивания для пермеабилизации образцов в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пермеабилизация усиливает связывание первичных антител с внутриклеточными белками-мишенями в фиксированных образцах.
9. Промойте предметные стекла еще раз дважды в TBST по 3 минуты каждый раз.
10. Подготовьте влажную камеру, и уложите слайды. Вытрите излишки воды с предметных стекол бумажными салфетками. Обведите каждый образец гидрофобной барьерной ручкой, чтобы раствор антител не стекал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания образцов. Лучше всего работать с небольшими участками.

4. Блокирование связывания неспецифических антител

1. Возьмите готовый к применению блокирующий раствор с ослиной сывороткой (Таблица материалов) и капните пипеткой по одной капле на каждый образец. Инкубируйте в течение 30 мин при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап блокировки сводит к минимуму связывание вторичного антитела с неспецифическими сайтами связывания в образце. После блокирования этих неспецифических эпитопов и нанесения первичного антитела вторичное антитело будет связываться с первичным антителом и не взаимодействовать с поверхностью ткани. Готовый к применению блокирующий реагент хранится при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
2. Удалите излишки блокирующего раствора с предметных стекол, постукивая краем предметных стекол по твердой поверхности. Не смывайте их.

5. Первичные антитела

1. Первичные антитела разводят в буфере для разведения антител (Таблица материалов). Используйте примерно 100 мкл готового раствора для каждого образца. Для антител NE и H3cit (R8) и изоконтроля разбавляют до концентрации 5 мкг/мл. Для МПО и соответствующего изоконтроля используют 10 мкг/мл. Подготовьте по одной пробирке для каждого первичного антитела и по одной для каждого изоконтрольного антитела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: H3cit (R8)/MPO или NE/MPO и их изоконтроль можно комбинировать для окрашивания НЭО. Для комбинации H3cit (R8)/MPO разбавляют до конечной концентрации 5 мкг/мл для H3cit (R8) и 10 мкг/мл для MPO до конечного объема 100 мкл на образец. Для NE/MPO разбавляют до конечной концентрации 5 мкг/мл для NE и 10 мкг/мл для MPO до конечного объема 100 мкл на образец. Для изоконтроля используйте ту же концентрацию, что и для каждого соответствующего антитела. Всегда используйте новый наконечник для пипетки для каждого используемого антитела. Первичные антитела можно хранить при 4 °C в течение 1-2 недель и при −20 °C или −80 °C до 1 года.
2. Имея два образца на одном предметном стекле, используйте один для изоконтроля антител, а другой для разведения антител MPO/H3cit или MPO/NE. Используйте примерно 100 мкл для каждого образца и равномерно распределите раствор антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания образцов. Будьте осторожны, чтобы не перепутать изоконтроль и первичные антитела.
3. Хранить во влажной камере в течение ночи при температуре 4 °C.
4. На следующий день удалите излишки раствора первичных антител со слайдов и сложите их в кювету. Промыть три раза в течение 5 мин каждый раз TBST, чтобы смыть оставшийся раствор первичных антител.

6. Вторичные антитела

1. Приготовьте вторичный раствор антител. Используйте два разных флуоресцентных вторичных антитела: ослиный антикозий для МПО и ослиный антикроличий для окрашивания H3cit. Разбавьте каждый из них до концентрации 7,5 мкг/мл буфером для разведения антител (таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для двойного окрашивания используйте два флуоресцентных антитела с разными областями возбуждения и минимальным спектральным перекрытием. Объедините оба вторичных антитела и разбавьте до конечной концентрации 7,5 мкг/мл для каждого антитела для получения конечного объема 100 мкл на образец. Защищают антитела от света. Вторичные антитела могут храниться при 2-8 °C в течение 6-8 недель или при -80 °C до 1 года.
2. Храните предметные стекла во влажной камере и добавляйте 100 мкл раствора вторичных антител в каждый образец. Дайте им инкубироваться в течение 30 минут в защищенном от света месте.
3. Удалите излишки раствора вторичных антител и сложите предметные стекла в стойку для слайдов. Погрузите три раза на 5 минут каждый в банку для окрашивания, наполненную PBS, чтобы смыть оставшиеся несвязанные антитела.
4. Приготовьте раствор DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (Таблица материалов) и разбавьте до концентрации 1 мкг/мл деионизированной водой. Погрузите штатив для показа в банку для окрашивания раствором DAPI и инкубируйте в течение 5 минут при RT в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI используется в качестве флуоресцентного красителя для двухцепочечной ДНК. Приготовленный раствор DAPI можно использовать многократно. Готовый раствор DAPI храните в RT. Концентрат DAPI можно хранить при температуре −20 °C до 1 года.
5. Погрузите решетку на 5 минут в банку для окрашивания с PBS, чтобы смыть излишки раствора DAPI.

7. Монтаж и хранение образцов, микроскопический анализ

1. Смонтируйте образцы с помощью покровных пластин и монтажной среды (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только небольшое количество монтажного средства и сотрите излишки среды влажными салфетками. Наденьте перчатки и избегайте случайного стирания каких-либо средств с покровных стекол или слайдов. Избегайте образования пузырьков и используйте ватные палочки, чтобы осторожно надавить на покровные стекла, чтобы удалить пузырьки с предметных стекол.
2. Для визуализации используют широкопольный микроскоп или конфокальный микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала сделайте снимок isocontrol. Уменьшите время экспозиции флуоресцентных фильтров (за исключением синего фильтра для DAPI) до тех пор, пока сигнал не будет обнаружен почти до конца. Затем используйте этот параметр для изучения соответствующих образцов. Ищите области, где флуоресцентный сигнал может быть обнаружен в каждом отдельном образце с помощью флуоресцентного канала. После получения изображения области программа генерирует составное изображение всех каналов и показывает различные сигналы флуоресценции в виде наложения разных цветов. Затем изображение может быть дополнительно проанализировано для совместной локализации с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как ImageJ.
3. Храните предметные стекла при температуре 4 °C до 6 месяцев.

Прежде чем приступить к оптимизации протокола, мы определили ключевые шаги для успешного окрашивания, выполнив поиск в PubMed исследований, в которых ткань FFPE использовалась для иммуноокрашивания НВЛ, и сравнили их протоколы. Наиболее перспективные различия протоколов были определены в качестве ключевых шагов для оптимизации протокола, в то время как шаги, которые в основном соответствовали друг другу, не были изменены (табл. 1).

Таблица 1: Исследование PubMed по иммуноокрашиванию НВЛ методом FFPE. В этой таблице показаны переменные в протоколе иммуноокрашивания в рассмотренных исследованиях. Используемые протоколы были разделены на основные этапы, а затем сравнены друг с другом. Шаги с наиболее многообещающими отличиями затем были взяты в качестве ключевых шагов для оптимизации и адаптированы для нашего протокола. Этапы, которые в основном соответствовали друг другу, не были изменены, например, время инкубации первичного антитела (ночь, 4 °C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Основываясь на наших выводах, мы пришли к выводу, что антитела, выбранные для нацеливания на эпитопы, были первым критическим шагом. По меньшей мере в 10 различных протоколах антитела triH3cit использовались (см. таблицу 1; Первичная колонка антител). Тем не менее, Thålin et al. обнаружили, что клон H3cit (R8) демонстрировал меньшую внецелевую перекрестную реактивность к нецитруллинированным гистонам и демонстрировал пренебрежимо малую вариабельность между партиями. Таким образом, мы решили сравнить результаты окрашивания triH3cit и H3cit (R8) между собой28.

В четырех исследованиях использовали антитела человека и мыши к MPO. Кроме того, в двух других протоколах применялся MPO (2D4) для тканей мышей и MPO (2C7) для тканей человека (см. таблицу 1; Первичная колонка антител). Поэтому мы отдельно сравнили МПО (2C7) с МПО-антителами человека/мыши к тканям человека и МПО (2D4) с МПО-антителами человека/мыши к тканям мыши. НЭ был выявлен с помощью по крайней мере пяти различных антител, но только три из них показали хорошие результаты окрашивания на предоставленных изображениях. Тем не менее, одно антитело больше не было доступно на рынке, поэтому мы сравнили антитело NE от хозяина кролика с антителом от мыши для нашей серии тестов в тканях человека. Для образцов мышей, по-видимому, не было доступной и надежной альтернативы антителам NE, выращенным у кролика-хозяина в начале этого исследования. Поскольку одно NE и оба антитела H3cit получены от одного и того же кролика-хозяина, их нельзя комбинировать для двойного окрашивания с помощью этого протокола. Вторичное антитело специфично для постоянной области первичного антитела, которая определяется хозяином, в котором оно было выращено. Если используются два первичных антитела, полученных от одного и того же хозяина, вторичное антитело может связываться с обоими первичными антителами, и окрашивание будет неспецифичным. Тем не менее, двойное окрашивание предпочтительнее, чем одинарное, поскольку может быть обнаружено и локализовано больше компонентов NET. Поэтому результат окрашивания будет более конкретным. Следовательно, мы дважды окрасили H3cit и MPO, чтобы получить более надежный протокол обнаружения.

Несмотря на сходство используемых антител, разведения антител различались почти во всех протоколах; например, для triH3cit диапазон концентраций составлял от 0,5 мкг/мл до 20 мкг/мл17,18. Для каждого использованного антитела мы пробовали различные разведения и получили удовлетворительные результаты окрашивания во всем диапазоне, описанном в литературе.

Кроме того, можно обнаружить много сходства в инкубационном времени первичного антитела (в течение ночи при 4 °C), а также в использовании и разведении вторичного антитела (см. таблицу 1; Инкубационная колонка первичных антител). Поэтому мы не стали менять эти шаги в нашей серии тестов и выполнили их по протоколу, описанному выше.

Следующим критическим шагом, определенным из литературы, было извлечение антигена. Этот шаг важен, потому что из-за фиксации формалина эпитопы антител маскируются через метиленовые мостики, которые могут быть обращены вспять, нагревая участок ткани в подходящем буфере29. Цитрат TRS при рН 6 и буфер EDTA TRS при рН 9 использовались одинаково часто в литературе и давали сходные результаты (см. табл. 1; столбец буфера TRS). Таким образом, мы выбрали цитрат pH 6 TRS для нашей серии тестов. Для получения антигена мы протестировали два различных метода нагрева: микроволновую печь (сначала 1 минуту при 360 Вт, а затем 9 минут при 90 Вт) и водяную баню (60 °C в течение 90 минут, 96 °C в течение 10 минут).

Последним шагом, который показал некоторую вариабельность в литературе, была пермеабилизация с помощью Triton X-100. Этот шаг требовал оптимизации, так как при обработке детергентом клеточная мембрана становится проницаемой для антител, а внутриклеточные эпитопы могут достигать30. В предыдущих протоколах использовались различные концентрации Triton X-100 в диапазоне от 1% до 0,1% (см. таблицу 1; Колонна пермеабилизации). Поэтому мы попробовали две концентрации Triton X-100 (0,2% и 0,5%) и одну серию без проницаемости Triton.

Определив эти ключевые шаги, мы модифицировали их и попытались оптимизировать протокол. Затем изображения рассматривались в соответствии с оценочным листом, а различия регистрировались полуколичественно и сравнивались (см. табл. 2).

Таблица 2: Таблица результатов оптимизации шагов протокола. В этой таблице показаны результаты для адаптированных этапов: аутофлуоресцентно-редуцирующий агент, извлечение антигена и пермеабилизация. Прежде чем начать эту серию тестов, мы проверили наилучшую комбинацию и концентрацию антител. Слайды оценивались в 10 различных областях, а затем одна репрезентативная область оценивалась по шкале от (-) для отрицательного результата до (++) для положительного результата, содержащего NET. Частично положительные результаты включали более высокое диффузное фоновое окрашивание ненейтрофильных клеток. Аббревиатуры: n/u = не используется; - = отрицательный результат; +/-частично положительное окрашивание; + = умеренное специфическое окрашивание; + = хорошее окрашивание НВЛ и нейтрофилов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Первичные антитела
Прежде чем адаптировать протокол, мы постарались найти наилучшую комбинацию антител. Здесь triH3cit показал большее внутриклеточное окрашивание гистонами, чем H3cit (R8). Для обнаружения НЭО мы решили использовать антитело H3cit (R8) для оптимизации нашего протокола. Это антитело связывалось только с внеклеточным H3cit и не проявляло окрашивания внутриклеточного H3cit в этой концентрации (см. рис. 1A, B).

Что касается окрашивания МПО, мы сравнили антитела к МПО человека/мыши с МПО (2C7) для тканей человека (см. рис. 1C, D) и МПО (2D4) для тканей мыши (см. рис. 1E, F). Антитела к MPO (2D4) и MPO (2C7) не могли обеспечить последовательное окрашивание для нескольких типов тканей, в то время как MPO человека/мыши приводили к надежному, хорошему окрашиванию MPO. Таким образом, мы выбрали МПО человека/мыши для нашего протокола окрашивания.

Для НЭ мы попробовали НЭ-антитело от мыши-хозяина на ткани человека, которое показало окрашивание НЭ только в одном из пяти образцов по сравнению с надежным окрашиванием НЭ-антител от кролика-хозяина. Кроме того, антитела NE от хозяина кролика применимы к тканям человека и мыши. (см. рис. 1G,H).

Рисунок 1: Сравнение первичных антител в различных тканях. (A) Ткани неонатального энтероколита человека (НЭК), окрашенные H3cit (R8) (красный). Здесь можно обнаружить только внеклеточный сигнал. (B) Та же ткань, окрашенная triH3cit (R2,8,17) (красный). Это антитело создает более широкий сигнал с интенсивным внутриклеточным окрашиванием цитруллинированных гистонов (желтые стрелки). (С,Д) Ткани NEC человека (C) и ткани заворота мышей (E) с хорошим окрашиванием для H3cit (R8) (красный) и MPO мыши/человека (зеленый). Совместная локализация сигналов H3cit, MPO и DAPI (синяя) указывает на формирование NET (белые стрелки). (Д,Ж) Для сравнения, при использовании (D) MPO (2C7) для тканей NEC человека и (F)MPO (2D4) (зеленый) для ткани заворота мышей сигнал MPO не был получен. (Г) Обожженный образец кожи человека с очень сильным окрашиванием на антитела к НЭ от хозяина-кролика (пурпурный) по сравнению с отрицательным результатом окрашивания (Н) для антител НЭ от мыши-хозяина. Сведения об управлении изотипом см. на дополнительном рисунке Изоконтроль 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Депарафинизация
Здесь ксилол был заменен лимоненом, что было эквивалентно лучшей депарафинизации образцов тканей по сравнению с ксилолом, с меньшей автофлуоресценцией на заднем плане (см. рис. 2A, B).

Аутофлуоресцентно-восстановительный агент
Готовое к применению автофлуоресцентно-восстановительное средство на основе суданского черного можно наносить на 2-20 минут. Здесь мы применяли его в течение 0 минут, 5 минут и 10 минут. Когда блокирование не использовалось, некоторые образцы мышей показали более неспецифическое окрашивание, и можно было достичь частичного положительного окрашивания (см. рис. 2C). Время блокировки 5 мин показало хорошие результаты во всех типах тканей, кроме H3cit и MPO в легочной и кожной ткани мыши (см. табл. 2). При 10-минутном времени блокировки в некоторых образцах окрашивание начинало быть менее ярким, поэтому 5-минутный временной интервал является лучшим выбором для блокирования автофлуоресценции (см. рис. 2D, E).

Рисунок 2: Методы депарафинизации и использование аутофлюоресцентного восстановителя. (A) Ткань спондилодисцита человека, депарафинизированная лимоненом и окрашенная на H3cit (красный) и MPO (зеленый). Прерывистое формирование сигналов и частичная колокализация указывают на наличие НВЛ (белая стрелка). (В) Один и тот же образец ткани депарафинизируют ксилолом, что приводит к аналогичным результатам окрашивания, что указывает на то, что широко используемый ксилол может быть заменен замещающей средой. (К-Э) Легочная ткань мыши после индуцированного сепсиса демонстрирует различные паттерны окрашивания НЭ (пурпурный) при использовании разного времени инкубации аутофлуоресцентного редуцирующего агента. При отсутствии восстановителя автофлуоресценции на изображении C по-прежнему видно легкое фоновое окрашивание эритроцитов (красная стрелка). Напротив, на рисунке D видно, что после 5-минутной инкубации с агентом, снижающим автофлуоресценцию, излучается четкий сигнал. Через 10 мин качество окрашивания на изображении E снижается, и сигнал становится менее ярким. Сведения об управлении изотипом см. на дополнительном рисунке Изоконтроль 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Методы получения антигена
Для НЭ-окрашивания образцы нагревали в цитратном буфере рН 6 в течение 10 мин в микроволновой печи (сначала в течение 1 мин при 360 Вт, а затем в течение 9 мин при 90 Вт), в течение 10 мин на водяной бане при 96 °С или в течение 90 мин на водяной бане при 60 °С. Здесь более высокие температуры в микроволновой печи и водяной бане показали стабильно умеренное или хорошее извлечение антигена (см. рисунок 3A). Существенной разницы между микроволновой печью и водяной баней с температурой 96 °C обнаружено не было (см. таблицу 2). Более того, было показано, что на водяной бане с температурой 60 °C окрашивание было только частично положительным или отсутствовало (см. рис. 3Б). Только подвздошная кишка и миокард человека показали хорошие специфические результаты. В связи с тем, что при использовании водяной бани с температурой 60 °C не удалось обеспечить адекватное окрашивание НЭ, серия испытаний на водяной бане при 60 °С для H3cit и MPO была отвергнута.

Для двойного окрашивания MPO и H3cit образцы нагревали в цитратном буфере pH 6 в микроволновой печи в течение 10 мин (сначала в течение 1 мин при 360 Вт, а затем в течение 9 мин при 90 Вт) или на водяной бане при 96 °C в течение 10 мин. Здесь оба метода показали хорошие специфические результаты, с несколько более благоприятными результатами для водяной бани с температурой 96 °C (см. рис. 3C). Только легочные и кожные ткани мышей могли достичь умеренного общего рейтинга (см. таблицу 2).

Однако превышение инкубационного времени в 40 мин при 96 °C приводило к менее интенсивному окрашиванию антителами, в то время как можно было наблюдать значительно большее фоновое окрашивание (см. рисунок 3D).

Рисунок 3: Методы извлечения антигена. (A) Ткань заворота мыши, окрашенная на NE (пурпурный) с использованием 10-минутного инкубационного времени при 96 °C для получения тепла, показывает значительно более сильный сигнал, чем (B) при инкубации образца в течение 90 минут на водяной бане с 60 °C. (C) Кроме того, 10-минутная инкубация при 96 °C при извлечении антигена также приводит к сильному сигналу для H3cit (красный) и MPO (зеленый) с комбинированным окрашиванием NET (белые стрелки). Д: Однако кипячение образцов в течение более 40 минут приводит к менее специфичному внеклеточному окрашиванию H3cit и отсутствию окрашивания MPO. Сведения об управлении изотипом см. на дополнительном рисунке Isocontrol 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Пермеабилизация
Мы попробовали пермеабилизацию образцов Triton X-100 в двух разведениях (0,2% и 0,5%) в течение 10 мин и сравнили это с 10 мин в деионизированной воде. В этом случае 10 мин с Тритоном 0,2% показали хорошие результаты для всех типов тканей, хотя различия были невелики по сравнению с 0,5% Тритоном и деионизированной водой (см. Таблицу 2).

Дополнительный рисунок Isocontrol 1: Элементы управления изотипом для Figure 1. На всех изображениях видно хорошее окрашивание DAPI (синий), но нет сигнала для флуоресцентных антител. Это подтверждает, что связывание первичных антител на рисунке 1 специфично для целевого антигена, а не является результатом неспецифического связывания или белковых взаимодействий. (A) Ткани неонатального энтероколита человека (НЭК), окрашенные изоконтрольным антителом к H3cit (R8) (красный). (B) Ткань NEC, окрашенная изоконтрольным антителом к H3cit (R2,8,17) (красная). (C) Ткань NEC (E) и ткань заворота мыши, окрашенные изоконтрольными антителами к H3cit (R8) (красный) и МПО мыши/человека (зеленый). (D) Ткань NEC, окрашенная изоконтрольными антителами к H3cit (R8) (красный) и MPO (2C7) (зеленый). (F) Ткань заворота кисти мыши, окрашенная изоконтрольными антителами к H3cit (R8) (красный) и MPO 2D4 (зеленый). Г: Обожженный образец кожи человека, окрашенный изоконтрольным антителом к антителу NE от хозяина кролика (пурпурный). (H) Та же ткань, окрашенная изоконтрольным антителом к антителу NE от мыши-хозяина (пурпурной). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок Isocontrol 2: Элементы управления изотипом для Figure 2. На всех изображениях видно хорошее окрашивание DAPI (синий), но нет сигнала для флуоресцентных антител. Это подтверждает специфическое связывание первичных антител на рисунке 2. На изображениях C-E все еще видны некоторые фоновые пятна пурпурного цвета из-за длительного времени экспозиции. Однако сигнал NE на рисунке 2 можно отличить от фонового окрашивания. (А) Ткань спондилодисцита человека, депарафинизированная лимоненом и окрашенная изоконтрольными антителами к H3cit (R8) (красный) и МПО мыши/человека (зеленый). (В) Тот же образец ткани депарафинизировали ксилолом и окрасили изоконтрольными антителами к H3cit (красный) и MPO (зеленый). (с) Легочную ткань мыши, окрашенную изоконтрольным антителом к НЭ (пурпурным), без использования аутофлуоресцентного редуцирующего агента. (Д) Эту же ткань окрашивают изоконтрольным антителом к НЭ (пурпурным) и 5 мин инкубации с аутофлюоресцентно-восстановительным агентом. (E) Ту же ткань, окрашенную изоконтрольным антителом к НЭ (пурпурным) и 10-минутную инкубацию с аутофлуоресцентно-восстановительным агентом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок Isocontrol 3: Элементы управления изотипом для рисунка 3. На всех изображениях видно хорошее окрашивание DAPI (синий), но нет специфического сигнала для флуоресцентных антител. Это подтверждает специфическое связывание первичных антител на рисунке 3. (A) Ткань заворота кишки мыши, окрашенная изоконтрольным антителом к NE (пурпурным) с использованием 10-минутного инкубационного времени при 96 °C для получения тепла. (B) Ту же ткань окрашивают изоконтрольным антителом к NE (пурпурным) и извлекают теплом в течение 90 мин на водяной бане с температурой 60 °C. (C) Та же ткань, окрашенная изоконтрольным антителом к H3cit (красный) и MPO (зеленый) и с теми же условиями получения тепла, что и в A. Зеленая точка показывает артефакт окрашивания агрегированных вторичных антител. (D) Ту же ткань окрашивают изоконтрольным антителом к H3cit (красный) и MPO (зеленый) и используют 40-минутное время инкубации при 96 °C для получения тепла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок Isocontrol 4: Элементы управления изотипом для рисунка 4. Все следующие изоэлементы взяты с того же слайда, что и соответствующий «неудачный» эксперимент. Неудачные попытки не были преднамеренными, поэтому некоторые изоконтрольные группы кажутся пригодными для использования, в то время как образец — нет. (A) Ткань NEC окрашена антителами изоконтроля к H3cit (красный) и MPO (зеленый). Этот образец обрабатывался быстрее, не высыхая. Поэтому не видно чрезмерного окрашивания фона. Зеленая и красная структуры являются вторичными агрегатами антител. (В) Ткань спондилодисцита окрашена изоконтрольным антителом к НЭ (пурпурным). Здесь депарафинизация прошла успешно, поэтому остатков парафина не видно. (с) Ткань NEC окрашена изоконтрольным антителом к H3cit (красный) и MPO (зеленый). Несмотря на то, что были использованы те же неправильно хранящиеся вторичные антитела, для этого изображения изоконтроля не следует ожидать окрашивания. Таким образом, это изображение не может быть использовано для оценки конкретной привязки соответствующего изображения. (Д) Обожженная кожа человека, окрашенная изоконтрольными антителами к H3cit (красный) и MPO (зеленый). Здесь монтаж был выполнен более тщательно, и не видно рассеивания света через пузырьки воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.