Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) связаны с различными заболеваниями, и для их визуализации часто используется иммунофлуоресценция. Тем не менее, существуют различные протоколы окрашивания, и во многих случаях исследуется только один тип ткани. Здесь мы устанавливаем общеприменимый протокол для окрашивания НВЛ в тканях мышей и человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) высвобождаются нейтрофилами в ответ на бактериальную инфекцию или травматическое повреждение тканей, но также играют роль в аутоиммунных заболеваниях и стерильном воспалении. Они представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из двухцепочечных нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков. После высвобождения НВЛ могут захватывать и убивать внеклеточные патогены в крови и тканях. Кроме того, НВЛ участвуют в гомеостатической регуляции, стимулируя адгезию и коагуляцию тромбоцитов. Тем не менее, нарушение регуляции выработки НВЛ также связано с различными заболеваниями, включая сепсис или аутоиммунные расстройства, что делает их многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства. Помимо электронной микроскопии, визуализация НВЛ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации в настоящее время является одним из немногих известных методов демонстрации НВЛ-взаимодействий в тканях. Поэтому для визуализации НЭО используются различные методы окрашивания. В литературе описаны различные протоколы окрашивания, и мы выделили четыре ключевых компонента, демонстрирующих высокую вариабельность между протоколами: (1) типы используемых антител, (2) использование аутофлюоресцентных редуцирующих агентов, (3) методы получения антигена и (4) пермеабилизация. Поэтому протоколы иммунофлюоресцентного окрашивания in vitro были системно адаптированы и усовершенствованы в данной работе, чтобы сделать их применимыми для различных видов (мышей, человека) и тканей (кожа, кишечник, легкие, печень, сердце, межпозвоночные диски). После фиксации и заделки парафином на предметные стекла были установлены секции толщиной 3 мкм. Эти образцы окрашивали первичными антителами к миелопероксидазе (МПО), цитруллинированному гистону Н3 (Н3цит) и нейтрофильной эластазе (НЭ) в соответствии с модифицированным протоколом окрашивания. Предметные стекла окрашивали вторичными антителами и исследовали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Результаты анализировались в соответствии с оценочным листом, а различия фиксировались полуколичественно.
Здесь мы представляем оптимизированный протокол окрашивания NET, подходящий для различных тканей. Мы использовали новое первичное антитело для окрашивания H3cit и уменьшали неспецифическое окрашивание с помощью аутофлуоресцентного редуцирующего агента. Кроме того, мы продемонстрировали, что окрашивание НЭТ требует постоянной высокой температуры и бережного обращения с образцами.
Введение
Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет колич....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В это исследование были включены ткани мышей, полученные в ходе экспериментов, одобренных Гамбургским государственным управлением по исследованиям на животных, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Гамбург, Германия (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). В качестве тканей использовались мышиные легкие и толстая кишка из септической модели и обожженная кожа. Мы использовали 8-недельных самцов и самок мышей. Во всех экспериментах соблюдалась Европейская директива 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях. Обезличенные образцы человека включали ткани неонатального энтероколита, обожженной кожи, атрезию желчевыводящих путей, спондилодисцит и миокард....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Прежде чем приступить к оптимизации протокола, мы определили ключевые шаги для успешного окрашивания, выполнив поиск в PubMed исследований, в которых ткань FFPE использовалась для иммуноокрашивания НВЛ, и сравнили их протоколы. Наиболее перспективные различия протоколов были определены в качестве ключевых шагов для оптимизации протокола, в то время как шаги, которые в основном соответствовали друг другу, не были изменены (табл. 1).
Таблица 1: Исследование PubMed по имм.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой работе мы стремились адаптировать и оптимизировать существующие протоколы визуализации НЭО для большего количества типов тканей, начиная с самого процесса окрашивания. Первым критическим шагом для этого метода является выбор наиболее подходящих антител. Для НЭ мы попробовали антитела к НЭ от мыши-хозяина на ткани человека, которые не показали надежного окрашивания по сравнению с НЭ от хозяина-кролика. Кроме того, Thålin et al. предложили H3cit (R8) в качестве более специфичного антитела для внеклеточного окрашиван.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было основано Немецким научно-исследовательским обществом (BO5534). Мы благодарим Антонию Кивитт, Морица Ленца, Йоханну Хагенс, д-ра Аннику Хойер и приват-доцента д-ра Инго Кёнигса за предоставленные нам образцы. Кроме того, авторы благодарят команду Центра микроскопии УКЭ (Core facility, UKE Medical School) за поддержку в проведении иммунофлуоресцентной микроскопии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильное>разбавление | |||
| Антитело к нейтрофильной эластазе 100&микро; g | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Антитела к антигистонам H3 (цитруллин R2 + R8 + R17) 100&микро; g | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Антитело к миелопероксидазе [2C7] против человека 100 &микро; g | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Антитела к миелопероксидазе [2D4] против мышей 50 &микро; g | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Программное обеспечение для микроскопии Axiovision | Zeiss | 4.8.2. | |
| Блокирующий раствор с сывороткой ослика (ГОТОВЫЙ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ) 50мл | GeneTex | ||
| Покровные стекла | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Цитрат pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 мг | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS разведение антител DCS 500 мл | DCS диагностика | DCS AL120R500 | |
| Муравьиный козел Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Осёл против кролика AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Осёл против кролика Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Флюорограмма-G Монтажная среда | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Стеклянная подставка для предметного стекла | Roth | H552.1 | |
| Антитела к МПО человека/мыши | R& D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Гидрофобная ручка | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 и 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reduction Reagent Kit (RUO) 100 мл | Maxvision | MB-L | |
| Микроскопическая камера | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Микроволновая печь | Bosch | HMT84M421 | |
| мышь IgG1 отрицательный контроль | Dako | X0931 Aglient | 1:50 и 1:5 |
| Нормальный козий контроль IgG | R& D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Фосфат буферный физиологический раствор (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP окрашивающая банка | Roth | 2292.2 | |
| Рекомбинантный антигистон H3 (цитруллин R8) антитела 100&микро; g | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Рекомбинантный кролик IgG, моноклональный [EPR25A] - Контроль изотипа 200&микро; g | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| Горки SuperFrost Plus | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris буферизованный физиологический раствор (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Водяная баня | Memmert | 830476 | |
| Рисоварка | с водяной банейreishunger | RCP-30 | |
| Мокрая камера | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Широкопольный микроскоп Zeiss | Axiovert 200M |
Ссылки
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
