Method Article

Разработка системы кормового анализа для оценки инсектицидного действия фитохимикатов на Helicoverpa armigera

DOI:

10.3791/65278

⸱

May 26th, 2023

 ,  ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается облигатный анализ кормления для оценки потенциально токсического действия фитохимического вещества на личинок чешуекрылых насекомых. Это высокомасштабируемый биотест на насекомых, легко оптимизирующий сублетальную и смертельную дозу, отпугивающую активность и физиологический эффект. Это может быть использовано для скрининга экологически чистых инсектицидов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helicoverpa armigera, чешуекрылое насекомое, является многоядным вредителем с мировым распространением. Это травоядное насекомое представляет угрозу для растений и продуктивности сельского хозяйства. В ответ растения вырабатывают несколько фитохимических веществ, которые негативно влияют на рост и выживание насекомого. Этот протокол демонстрирует метод облигатного анализа кормления для оценки влияния фитохимического вещества (кверцетина) на рост, развитие и выживание насекомых. В контролируемых условиях новорожденных содержали до второго возраста на заранее определенном искусственном рационе. Этим личинкам второго возраста было позволено питаться контрольной и содержащей кверцетин искусственной пищей в течение 10 дней. Масса тела насекомых, стадия развития, масса тела и смертность регистрировались через день. Изменение массы тела, различия в характере питания и фенотипы развития оценивались на протяжении всего времени анализа. Описанный анализ обязательного кормления имитирует естественный способ проглатывания и может быть масштабирован до большого количества насекомых. Это позволяет проанализировать влияние фитохимических веществ на динамику роста, переход в развитие и общую приспособленность H. armigera. Кроме того, эта установка также может быть использована для оценки изменений в параметрах питания и физиологических процессах пищеварения. В этой статье представлена подробная методология систем анализа кормов, которая может быть применена в токсикологических исследованиях, скрининге инсектицидных молекул и понимании химических эффектов при взаимодействии растений и насекомых.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биотическими факторами, влияющими на урожайность сельскохозяйственных культур, являются в основном патогенные агенты и вредители. Некоторые насекомые-вредители являются причиной от 15% до 35% потерь сельскохозяйственных культур и влияют на практику экономической устойчивости1. Насекомые, принадлежащие к отрядам жесткокрылых, полужесткокрылых и чешуекрылых, являются основными отрядами разрушительных вредителей. Высокоадаптивная природа окружающей среды способствовала развитию у чешуекрылых нескольких механизмов выживания. Среди чешуекрылых насекомых Helicoverpa armigera (хлопковый коробочный червь) может питаться примерно 180 различными сельскохозяйственными культурами и наносить значительный ущерб их репродуктивным тканям2. Во всем мире заражение H. armigera привело к убыткам в размере около 5 миллиардов долларовСША3. Хлопчатник, нут, голубиный горох, помидоры, подсолнечник и другие культуры являются хозяевами H. armigera. Он завершает свой жизненный цикл на разных частях растений-хозяев. Яйца, отложенные самками бабочек, вылупляются на листьях, после чего питаются вегетативными тканями на личиночных стадиях. Личиночная стадия является наиболее разрушительной из-за своей прожорливой и хорошо приспосабливающейся природы 4,5. H. armigera демонстрирует глобальное распространение и вторжение на новые территории благодаря своим замечательным признакам, таким как полифагия, отличные миграционные способности, более высокая плодовитость, сильная диапауза и появление устойчивости к существующим стратегиям борьбы с насекомыми6.

Различные химические молекулы, такие как терпены, флавоноиды, алкалоиды, полифенолы, цианогенные глюкозиды и многие другие, широко используются для борьбы с инвазией H. armigera 7. Однако частое применение химических молекул оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду и здоровье человека из-за приобретения их остатков. Кроме того, они оказывают губительное воздействие на различных хищников-вредителей, что приводит к экологическому дисбалансу 8,9. Поэтому возникает необходимость в исследовании безопасных и экологичных вариантов химических молекул борьбы с вредителями.

Природные инсектицидные молекулы, продуцируемые растениями (фитохимикаты), могут быть использованы в качестве перспективной альтернативы химическим пестицидам. К таким фитохимическим веществам относятся различные вторичные метаболиты, принадлежащие к классам алкалоидов, терпеноидов и фенольных соединений 7,10. Кверцетин является одним из самых распространенных флавоноидов (фенольных соединений), присутствующих в различных зернах, овощах, фруктах и листьях. Проявляет кормовую отпугивающую и инсектицидную активность против насекомых; Также он не вреден для естественных врагов вредителей11,12. Таким образом, данный протокол демонстрирует анализ кормления с использованием кверцетина для оценки его токсического действия на H. armigera.

Для оценки влияния природных и синтетических молекул на питание, рост, развитие и поведение насекомых были разработаны различные методы биотестирования13. Обычно используемые методы включают анализ листового диска, анализ отборного кормления, анализ капельного питания, контактный анализ, анализ покрытия диеты и анализ облигатного кормления13,14. Эти методы классифицируются в зависимости от того, как пестициды применяются к насекомым. Анализ на облигатное кормление является одним из наиболее часто используемых, чувствительных, простых и адаптируемых методов для тестирования вероятных инсектицидов и их смертельной дозы14. В анализе на облигатное кормление интересующая молекула смешивается с искусственной пищей. Это обеспечивает постоянство и контроль над составом рациона, обеспечивая надежные и воспроизводимые результаты. Важными переменными, влияющими на анализ питания, являются стадия развития насекомого, выбор инсектицида, факторы окружающей среды и размер образца. Продолжительность анализа, интервал между двумя записями данных, частота и количество корма, состояние здоровья насекомых и навыки обращения операторов также могут влиять на исход анализов кормления14,15.

Это исследование направлено на демонстрацию анализа на облигатное кормление для оценки влияния кверцетина на выживаемость и приспособленность H. armigera . Оценка различных параметров, таких как масса тела насекомых, уровень смертности и дефекты развития, даст представление об инсектицидных эффектах кверцетина. Между тем, измерение параметров питания, включая эффективность конверсии проглоченной пищи (ECI), эффективность конверсии переваренной пищи (ECD) и приблизительную усвояемость (AD), выявит антифидентные свойства кверцетина.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Личинки H. armigera были получены из Национального бюро ресурсов сельскохозяйственных насекомых (NBAIR) в Бангалоре, Индия. В общей сложности для настоящего исследования была использована 21 личинка второго возраста.

1. Приготовление искусственной диеты на основе нута

ПРИМЕЧАНИЕ: Список ингредиентов, необходимых для приготовления искусственной диеты, приведен в таблице 1.

  1. Взвесьте все фракции по отдельности в стакане, как указано в таблице 1, и приготовьте однородную смесь с помощью шпателя/магнитной мешалки.
  2. Прокипятите фракцию C при температуре около 100 °C в микроволновой печи в течение 5 минут, добавьте к фракции А и тщательно перемешайте.
  3. После тщательного перемешивания дайте смешанной фракции немного остыть, прежде чем добавлять фракцию Б (фракция Б содержит термолабильные компоненты).
  4. Вылейте в прозрачную чашку Петри из полистирола размером 150 мм х 150 мм.

2. Приготовление кверцетинсодержащей искусственной диеты

  1. Взвесьте соответствующее количество (1000 ppm) гидрата кверцетина (см. таблицу материалов) и растворите его в минимальном объеме органических растворителей, таких как этанол (2 мг/мл), диметилсульфоксид (ДМСО; 30 мг/мл) или диметилформамид (ДМФ). Здесь ДМСО используется для растворения кверцетина.
  2. Добавьте растворенный кверцетин в фракцию В, а затем добавьте в смесь фракций А и С (объем воды, восстановленной из фракции Б, равен объему добавленного ДМСО).
  3. Добавьте равный объем органического растворителя, используемого для растворения кверцетина, в контрольную диету.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показано схематическое изображение приготовления искусственных и кверцетинсодержащих диет.

3. Выращивание и поддержание культуры H. armigera

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте надлежащим образом очищенные и стерилизованные материалы для выращивания и содержания насекомых. Обращайтесь с насекомыми осторожно, соблюдая все стандартные правила эксплуатации 16,17,18, связанные со стерильностью и безопасностью.

  1. Храните яйца H. armigera в камере для разведения (пластиковая банка, покрытая муслиновой тканью) в условиях, описанных в шаге 3.3. Затем аккуратно перенесите новорожденных с помощью тонкой кисти на свежеприготовленную искусственную диету на основе нута.
  2. Для выращивания личинок используют искусственную диету, а для взрослых бабочек используют 20%-ный раствор сахарозы с 1%-ным поливитамином (см. таблицу материалов)19,20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку личинки H. armigera третьего и более старшего возраста проявляют склонность к каннибализму, необходимо выращивать каждую личинку в отдельном флаконе.
  3. Поддерживайте температуру на уровне 25 ± 1 °C и относительную влажность на уровне 70% в помещении для культивирования насекомых с фотопериодом 16 ч свет:8 ч темнота21.
  4. Выращивают одно поколение насекомых в лаборатории для получения однородности, а затем используют его для анализа кормления.
  5. При необходимости можно увеличить температуру помещения для культивирования насекомых до 28 °C, чтобы ускорить рост личинок и куколок22.

4. Настройка для анализа подачи

  1. Соберите личинок 21 второго возраста для каждого набора (контроль и лечение) и держите их подальше от рациона, примерно 1-3 часа.
  2. Контрольную и кверцетинсодержащую диету нарежьте на мелкие кусочки, запишите вес даваемого корма и тела насекомого и осторожно переложите насекомых в культуральные пробирки. Позвольте насекомым питаться соответствующим рационом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует рассматривать как 0-й день анализа кормления.
  3. Записывайте вес тела насекомого, диету, несъеденную пищу и фрасс через день (2, 4, 6, 8 и 10) до 10-го дня анализа.
  4. После 10-го дня продолжайте кормить их соответствующим рационом, чтобы наблюдать за дальнейшими изменениями в развитии и морфологии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в развитии поступают с помощью: (1) промежуточных звеньев между личинкой и куколкой, таких как задняя половина тела куколки с участками кутикулы личинки, головная капсула и грудные ноги; (2) предкуколки с полностью почерневшим телом; (3) низкорослые куколки с усадкой тела; (4) Промежуточные плодожорки со старой куколочной оболочкой. Морфологические изменения включают в себя уродливые взрослые особи бабочек с аномальным телом, искривленными крыльями и суставными ногами. Затем эти изменения сравнивают с насекомыми, которых кормили контрольной диетой.
  5. Замораживают насекомых на 10-й день, если исследование пороков развития и морфологических дефектов не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед замораживанием личинок их нужно подержать лишенными рациона не менее 3 ч, чтобы удалить остатки корма из пищеварительного тракта.

5. Запись и анализ данных

  1. В программном обеспечении GraphPad Prism (см. Таблицу материалов) выберите таблицу данных XY в диалоговом окне "Welcome or New Table" и введите в нее количество насекомых , реплицируемых рядом в подстолбцах. Затем дайте название оси X в виде количества дней, а в группах А и В дайте название названия как контроль и лечение кверцетином соответственно. Поставьте массу тела каждого насекомого под контроль и обработку, чтобы построить график массы тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ в GraphPad может варьироваться в зависимости от размера выборки и количества процедур.
  2. Сравните массу тела насекомых между контрольной и лечебной группами с помощью t-критерия Стьюдента (α = 0,05).
  3. Подсчитайте живых и мертвых личинок и куколок на 10-й день, чтобы построить кривую Каплана-Мейера для процента выживаемости с помощью программного обеспечения для построения графиков.
  4. Подсчитайте количество куколок и рассчитайте процент окукливания по приведенной формуле:
  5. Процент окукливания (%) = (количество образовавшихся куколок / общее количество личинок) x 100
  6. Сравните развитие личинок с точки зрения индексов питания23 по следующим формулам: ECI (%) = (прирост массы личинок/вес съеденного корма) x 100
    ECD (%) = (прирост массы личинок/[вес съеденного корма - вес фрасса]) x 100
    AD (%) = ([вес съеденного корма - вес фраса]/вес съеденного корма) x 100

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Личинки насекомых, которых кормили пищей, содержащей 1000 ppm кверцетина, показали значительное снижение массы тела на ~57% по сравнению с контрольной группой (рис. 2A). Снижение массы тела привело к уменьшению размеров тела личинок, обработанных кверцетином (рис. 2Б). Наблюдалось заметное снижение скорости питания личинок, питавшихся кверцетином, по сравнению с контролем (рис. 2C).

Кроме того, личинки, п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лабораторные биотесты полезны для прогнозирования результатов и получения сравнительных данных о токсичности нескольких соединений за короткий период времени по разумной цене. Биопроба кормления помогает интерпретировать взаимодействие между инсектицидами и инсектицидами типа «насекомое-растение». Это эффективный метод измерения токсичности различных веществ, который значительно упрощает процесс установления смертельной дозы 50 (ЛД50), смертельной концентрации 50 (ЛК50) или любой другой смертельной ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SM, YP и VN выражают признательность за стипендию, присужденную Комиссией по университетским грантам правительства Индии, Нью-Дели. RJ выражает признательность Совету по научным и промышленным исследованиям (CSIR), Индия, и CSIR-Национальной химической лаборатории, Пуна, Индия, за финансовую поддержку в соответствии с кодами проектов MLP036626, MLP101526 и YSA000826.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Агар АгарHimediaRM666Отвердитель
Аскорбиновая кислотаHimediaCMS1014Источник витамина
С Бенгалия GramNAИсточник белка и углеводов
КазеинSigmaC-5890Источник белка
ХолестеринSisco Research Laboratories34811Источник
Холин хлоридHimediaGRM6824соль аммония
DMSOSigma67-68-5Растворитель
GraphPad Prism v8.0https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
метилпарабенHimediaGRM1291противогрибковое средство
Мультивитаминная капсулаGalaxoSmithKlineNAИсточник витамина
КверцетинSigmaQ4951-10GФитохимическая
сорбиновая кислотаHimediaM1880Антимикробальное средство
СтрептомицинHimediaCMS220Антибиотик
Витамин Е капсулаNukind HealthcareNAИсточник витамина Е
Дрожжевой экстрактHimediaRM027Источник аминокислот
жирных кислот

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
  2. da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431(2020).
  3. Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
  4. Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
  5. Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
  6. Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
  7. Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835(2021).
  8. Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
  9. Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42(2021).
  10. Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189(2021).
  11. Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476(2021).
  12. Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945(2022).
  13. Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
  14. Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
  15. Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
  16. Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10(2017).
  17. Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341(2018).
  18. Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
  19. Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
  20. Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
  21. Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35(2007).
  22. Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
  23. Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
  24. Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
  25. Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
  26. ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
  27. Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
  28. Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
  29. Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
  30. Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23(2020).
  31. Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
  32. Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227(2012).
  33. Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768(2019).
  34. Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Feeding AssayHelicoverpa ArmigeraPhytochemical InsecticidesArtificial DietQuercetin TreatmentInsect GrowthLarval DevelopmentNutritional IndicesSurvival AnalysisPest Management

Related Articles