Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Теломеры - это повторяющиеся последовательности ДНК, присутствующие на концах хромосом. Они имеют тандемные повторы TTAGGG и поддерживают целостность генома, защищая хромосому как от износа, так и от проблемы репликации конца, что означает, что часть 3'-навеса не может быть реплицирована ДНК-полимеразой ^1,2. Короткие теломеры приводят к хромосомным аномалиям в клетках, из-за чего клетки постоянно останавливаются на стадии, называемой репликативным старением³. Короткие теломеры также вызывают множество других проблем, таких как дисфункция митохондрий ^4,5 и клеточная дисфункция.

Теломерные повторы ДНК теряются по мере деления клетки со средней потерей от 25 до 200.н. в год 6, что приводит к клеточному старению после определенного количества делений⁶. Старение связано с более высокой частотой сопутствующих заболеваний, которая отмечается укорочением длины теломер⁷. Анализ фрагментов рестрикции теломер (TRF), описанный Мендером, является очень дорогим методом⁸. Из-за этого он не применяется при количественном определении длины теломер в большинстве исследований.

В настоящее время в большинстве эпидемиологических исследований используются количественные измерения длины теломер на основе полимеразной цепной реакции (кПЦР). Однако метод на основе кПЦР является относительным методом измерения, поскольку он измеряет соотношение между теломерами и продуктами амплификации генов одной копии, а не абсолютную длину теломер. Измерение длины теломер с использованием протокола TRF является методом золотого стандарта, поскольку он может измерять распределение длины теломер в образце, а измерения могут быть выражены в абсолютных значениях в килобазах (кб). Однако его использование ограничено, поскольку он громоздкий, трудоемкий и дорогостоящий. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для измерения длины теломер с использованием TRF на основе хемилюминесценции.

TRF-анализ включает семь основных этапов: 1) культивирование клеток для выделения геномной ДНК, 2) выделение геномной ДНК с использованием метода фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (P:C:I), 3) рестрикционное переваривание геномной ДНК, 4) электрофорез в агарозном геле, 5) Южное блоттинг фрагмента ДНК рестрикционного расщепления, 6) гибридизация и детектирование с помощью хемилюминесценция - иммобилизованный зонд теломер визуализируется высокочувствительным хемилюминесцентным субстратом для щелочной фосфатазы, динатриевым 2-хлор-5-(4-метоксиспиро[1,2-диоксетан-3,2'-(5-хлортрицикло[3.3.1.13.7]декан])-4-ил]-1-фенилфосфатом (CDP-Star)-и 7) для получения информации о средней длине теломер и дальности из этих теломерных мазков.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах, используемых в протоколе ниже. В таблице 1 перечислены лабораторные реагенты вместе с оптимизированными объемами, а в таблице 2 показаны рабочие концентрации коммерчески доступных реагентов.

1. Клеточная культура

1. Поддерживайте клетки, длина теломер которых должна быть измерена (здесь использовались клетки A2780, которая представляет собой клеточную линию аденокарциномы яичников) в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), стрептомицином, пенициллином и амфотерицином B в чашке Петри диаметром 6 см. Инкубируйте при 37 ° C в увлажненной и контролируемой среде, содержащей 5% углекислого газа, до тех пор, пока клетки не будут сливаться на 80-100%.
2. Удалите носитель и промойте 5 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
3. Обработайте клетки 1 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для отделения клеток путем инкубации при 37 ° C в течение 3-5 минут.
4. Добавьте 2 мл полной среды DMEM для инактивации трипсина и соберите клетки в центрифугирующую пробирку.
5. Гранулируют ячейки в дозе 2,348 × г в течение 5 мин.
6. Промыть гранулы 1x PBS и центрифугой при 2,348 × г в течение 5 мин.
7. Храните гранулы при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек может варьироваться в зависимости от клеточной линии. Мы получили примерно 2,5 × 10^{ячеек 6} в случае клеточной линии A2780, которая используется на дальнейших этапах.

2. Выделение геномной ДНК

1. Добавьте 500 мкл буфера для лизиса (10 мМ трис-Cl, рН 8,0; 25 мМ ЭДТА, рН 8,0; 100 мМ NaCl; 0,5% мас./об. додецилсульфата натрия) в гранулу клетки и аккуратно перемешайте, используя обрезанный наконечник (с диаметром отверстия не менее 2 мм). Добавьте 20 мкг/мл свежеприготовленной РНКазы А и аккуратно перемешайте путем инверсии.
2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин и время от времени переворачивать пробирку во время инкубации.
3. Добавьте протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и аккуратно перемешайте путем инверсии 10 раз. Инкубировать при 55 °C в течение 2 часов. Переворачивайте пробирку через равные промежутки времени (каждые 10 мин) во время инкубации.
4. Добавьте 500 мкл реагента фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и аккуратно перемешайте путем инверсии 20 раз. Центрифуга при 9,391 × г в течение 15 мин при комнатной температуре (около 25 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А показаны три слоя, полученные после центрифугирования.
5. Удалите вязкий верхний водный слой из трех видимых слоев, поместите в свежую пробирку с помощью отрезанного кончика и добавьте равное количество хлороформа. Смешайте путем легкой инверсии 20 раз.
6. Центрифугируют пробирки при концентрации 9,391 × г в течение 15 мин при комнатной температуре.
7. Соберите водный слой и добавьте соответствующее количество 5 М NaCl так, чтобы конечная концентрация NaCl составляла 0,2 М.
8. Добавьте два объема 100% этанола. Смешайте путем легкой инверсии 20-25 раз. Центрифугу при 15,871 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 500 мкл 70% этанола для промывки гранул. Центрифугу при 15 871 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. Удалите надосадочную жидкость, высушите гранулы на воздухе в течение нескольких минут и добавьте 50 мкл стерильной воды, не содержащей нуклеаз. Дайте ДНК регидратироваться в течение 1-2 дней при комнатной температуре. Смешайте пипеткой, используя отрезанный наконечник.
11. Измерьте концентрацию ДНК с помощью ультрафиолетовой (УФ)-спектрофотометрии. При необходимости разбавьте образцы стерильной безнуклеазной водой, чтобы получить минимальную концентрацию 300-500 нг/мкл.
12. Проверьте целостность ДНК, запустив ее на 1% агарозный гель (рис. 1B).
13. Храните разбавленную ДНК при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

3. Переваривание геномной ДНК

1. Приготовьте ферментную смесь Rsa1 (20 ЕД) и Hinf1 (20 ЕД) и добавьте 2 мкл буфера для рестрикционного расщепления на реакцию.
2. Возьмите соответствующий объем геномной ДНК таким образом, чтобы общее количество ДНК составило 1,5 мкг. Восполните объем стерильной безнуклеазной водой, чтобы общий объем после добавления фермента составил 20 мкл.
3. Хорошо перемешайте, постукивая, с последующим импульсным вращением.
4. Инкубировать смесь при 37 °C в течение 2 ч.

4. Электрофорез в агарозном геле

1. Приготовьте 0,8% агарозный гель размером 10 см × 15 см в 1x буфере трис ацетата ЭДТА (TAE) с использованием высококачественной агарозы.
2. Добавьте 5 мкл загрузочного красителя к каждому расщепленному образцу геномной ДНК, таким образом получив окончательный объем 25 мкл, и загрузите образцы в гель.
3. Приготовьте смесь молекулярных маркеров, используя 1 мкл молекулярного маркера (лестницу), 3 мкл стерильной воды без нуклеазы и 1 мкл красителя с 5-кратной загрузкой.
4. Загрузите 5 мкл смеси молекулярных маркеров на обе стороны геномных образцов ДНК, если имеется большее количество образцов (~ 10), или только на одной стороне, если их меньше или равно пяти образцам.
5. Запускайте гель при 5 В/см в течение 6 ч. После завершения прогона сделайте надрез на одном углу геля, чтобы отметить порядок загрузки.
6. Погрузите гель в 0,25 М HCl на 10 мин при комнатной температуре при легком перемешивании.
7. Дважды смойте гель дистиллированной водой.
8. Денатурируют ДНК путем погружения геля в раствор 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl дважды на 15 мин каждый при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
9. Дважды смойте гель дистиллированной водой.
10. Нейтрализуют ДНК путем погружения геля в раствор 0,5 М трис-HCl и 3 М NaCl (рН 7,5) дважды в течение 15 мин при комнатной температуре при мягком перемешивании.

5. Южное блоттинг

1. Отрежьте капроновую мембрану размером 10 см × 12 см и сделайте насечку в том же положении, что и гель.
2. Активируйте мембрану, окунув ее в дистиллированную воду, а затем 20-кратный буфер с солевым цитратом натрия (SSC) (см. Таблицу 1).
3. Настройте передачу.
   1. Возьмите чистый стеклянный поднос и поставьте в него другой поднос в перевернутом положении. Создайте фитиль, используя обычную фильтровальную бумагу, так, чтобы концы касались основания внешнего лотка.
   2. Нанесите гель поверх фильтровальной бумаги. Аккуратно поместите активированную нейлоновую мембрану поверх геля так, чтобы насечки перекрывались, и удалите пузырьки воздуха, перекатываясь по стеклянному стержню.
   3. Поместите 2-сантиметровую кучу 9,5 см × 11,5-сантиметровую целлюлозную фильтровальную бумагу, а затем 6-сантиметровую кучу обычной фильтровальной бумаги тех же размеров. Поместите груз поверх этой установки так, чтобы внизу было равное распределение веса. Заполните внешний лоток 20-кратным буфером SSC (см. рис. 2).
   4. Оставьте настройку для переноса на ночь.
4. После южного переноса закрепите перенесенную ДНК на мембране с помощью УФ-сшивания на УФ-трансиллюминаторе или УФ-сшивающем агенте. Используйте лампу 302 нм 8 Вт в течение 5 минут или лампу 254 нм 8 Вт в течение 2 минут, что соответствует примерно 120 мДж. Убедитесь, что сторона мембраны, на которую переносится ДНК, обращена к лампе.
5. Дважды промойте мембрану 25 мл 2-кратного буфера SSC.
6. При необходимости приостановите протокол, полностью высушив кляксу и храня ее при температуре 2-8 ° C после неплотного заворачивания в фольгу до дальнейшей обработки.

6. Гибридизация и хемилюминесцентное обнаружение

1. Предварительно подогрейте буфер перед гибридизацией до 42 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги включают объемы растворов/буферов, которые должны быть использованы на 100^см2 блоттинга.
2. Инкубируйте мембрану в 10 мл буфера для прегибридизации в течение 1 ч при 42 ° C с мягким перемешиванием для прегибридизации.
3. Добавьте 0,5 мкл зонда теломер на 5 мл предварительно подогретого буфера для предварительной гибридизации, чтобы получить гибридизационный раствор.
4. Инкубируйте блоттинг в 10 мл гибридизационного раствора при 42 °C в течение 3 ч при осторожном перемешивании.
5. Промойте промокшую кляксу строгим буфером 1 (таблица 1) дважды в течение 10 мин (по 25 мл каждый) при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
6. Предварительно подогрейте строгий буфер 2 (таблица 1) в течение 30 мин при 50 °C.
7. Промойте блоттинг строгим буфером 2 два раза в течение 15 мин (по 25 мл каждый) при 50 °C при осторожном перемешивании.
8. Смойте 15 мл буфера для стирки в течение 5 минут при осторожном перемешивании при RT.
9. Инкубируйте мембрану в 10 мл свежеприготовленного 1x блокирующего раствора в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
10. Инкубируют мембрану в 10 мл антидигиоксигенина, конъюгированного с рабочим раствором щелочной фосфатазы (см. Таблицу 2), в течение 30 мин при ЛТ с легким перемешиванием.
11. Дважды промойте промокшку буфером для стирки при комнатной температуре в течение 15 минут при осторожном перемешивании.
12. Инкубировать в 10 мл детектирующего буфера в течение 5 мин при ЛТ при легком перемешивании.
13. Удалите избыточный буфер обнаружения и держите мембрану с ДНК обращенной вверх на гибридизационном пакете или ацетатном листе. Добавьте ~1-1,5 мл раствора субстрата по каплям на мембрану, сразу же положите на нее еще один лист и инкубируйте в течение 5 мин при RT.
14. Отожмите излишки субстрата для визуализации.
15. Визуализируйте пятно в течение примерно 20 минут в гелевой системе документирования, собирая несколько изображений в разные моменты времени. Выберите ненасыщенные изображения для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае слабого сигнала визуализация может проводиться в течение более длительного периода времени.

7. Анализ

1. Получив файлы изображений, экспортируйте их для публикации в .tif формате с максимально возможным разрешением (в данном случае 600 dpi).
2. Установите Telotool программное обеспечение. Для этого требуется определенная версия (R2012a) MATLAB (в свободном доступе).
3. Откройте программное обеспечение и нажмите кнопку « Загрузить файл изображения » в правом верхнем углу.
4. После загрузки изображения нажмите «Инвертировать изображение», чтобы фон изображения был черным, а мазки/полосы белыми.
5. Обрежьте изображение с верхними углами, начиная с лунок. После того, как выбор обрезки будет сделан, щелкните правой кнопкой мыши внутри него и выберите «Обрезать изображение».
6. После того, как изображение будет обрезано, нажмите « Рассчитать полосы движения» и разрешите автоматическое обнаружение полосы движения.
7. Если полосы движения не были обнаружены должным образом, например, если определенные полосы вообще не были обнаружены или если были обнаружены дополнительные или частичные полосы движения, выполните регулировку полосы движения, как описано ниже.
   1. Нажмите «Настроить полосы движения» и в открывшемся всплывающем окне добавьте и/или отрегулируйте полосы движения по мере необходимости, а затем нажмите « Применить и закрыть».
8. После регулировки дорожек убедитесь, что на каждой из дорожек видна красная точка, и отрегулируйте лестницы с помощью кнопки Ladder Fit , убедившись, что количество пиков на обеих полосах лестницы находится в одинаковом положении. Удалите все посторонние пики с помощью кнопки «Удалить экстремум ».
9. После того, как лестницы будут отрегулированы, выберите « Профили дорожек», нажмите « Подгонка лестницы» и выберите «Полиномиальная посадка».
10. Нажмите « Линия тренда» в соответствии с рекомендациями программного обеспечения, а затем выберите «Исправлено » в следующем варианте.
11. Нажмите « Получить результаты», чтобы отобразить результаты в виде таблицы, в которой строка «Средний TRF » представляет собой измерение длины теломер соответствующих образцов полосы движения.
12. Нажмите « Сохранить все », чтобы сохранить результаты в виде электронной таблицы.

Извлеченная геномная ДНК (гДНК), которая была запущена на 1% агарозном геле, показала хорошую целостность, как показано на рисунке 1B, что указывает на то, что образец может быть использован для дальнейшей последующей обработки TRF. Затем проводили анализ TRF путем изменения объемов растворов, необходимых на каждом этапе (см. Таблицу 1 и Таблицу 2). Сигнал TRF был хорошо виден (рис. 3). Таким образом, изменяя объемы и концентрации раствора, можно обрабатывать больше образцов без какого-либо негативного влияния на результаты, а длину теломер можно успешно определить с помощью свободно доступного программного обеспечения, такого как Telotool10.

Рисунок 1: Выделение и проверка качества геномной ДНК. (A) Три различные фазы разделения, полученные при центрифугировании после добавления фенола: хлороформа: изоамилового спирта. Верхний водный слой содержит гДНК, интерфаза содержит белки, а нижняя органическая фаза содержит деградированную РНК, клеточный мусор и липиды. (B) Изображение 1% агарозного геля, показывающее неповрежденную непереваренную гДНК. На полосе 1 показана лестница размером 1 кб, а на полосе 2 показана непереваренная гДНК линии раковых клеток A2780. Аббревиатура: гДНК = геномная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Иллюстрация установки переноса Южного блоттинга. Репрезентативная диаграмма, показывающая системный узел для переноса повторных мазков теломер из геля в нейлоновую мембрану путем капиллярного действия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Хемилюминесцентное обнаружение TRF после Южного блоттинга и гибридизации. Блот, показывающий ряд теломерных повторов в виде мазка на полосе 2. На полосе 1 показан молекулярный маркер с молекулярными массами (kb) полос, указанными слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Список реагентов, используемых в этом протоколе. Таблица содержит реагенты, приготовленные в лаборатории, а также сведения об их хранении, рекомендуемое использование реагентов набора для анализа длины теломер TAGGG и измененные объемы их использования в соответствии с оптимизацией в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Список коммерчески доступных реагентов с измененными инструкциями по применению. Таблица содержит коммерчески доступные реагенты, а также различные разведения, сведения об их хранении и их рекомендуемое использование набором для анализа длины теломер TAGGG и измененные объемы использования в соответствии с оптимизацией в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Конфликт интересов у авторов отсутствует.