Method Article

Трехмерная методика визуализации ультраструктурных изменений митохондрий в раковых клетках поджелудочной железы

DOI:

10.3791/65290

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как реконструировать митохондриальные кристы для получения 3D-визуализации с высокой точностью, высоким разрешением и высокой пропускной способностью.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание динамических особенностей ультраструктуры клеточных органелл, которая не только богата неизвестной информацией, но и сложна с трехмерной (3D) точки зрения, имеет решающее значение для механистических исследований. Электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает хорошую глубину изображения и позволяет реконструировать стеки изображений с высоким разрешением для исследования ультраструктурной морфологии клеточных органелл даже в нанометровом масштабе; Поэтому 3D-реконструкция приобретает все большее значение благодаря своим несравненным преимуществам. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) представляет собой высокопроизводительную технологию получения изображений, которая позволяет реконструировать большие структуры в 3D из одной и той же интересующей области на последовательных срезах. Поэтому применение СЭМ в крупномасштабной 3D-реконструкции для восстановления истинной 3D-ультраструктуры органелл становится все более распространенным. В этом протоколе мы предлагаем комбинацию серийных ультратонких срезов и методов 3D-реконструкции для изучения митохондриальных крист в клетках рака поджелудочной железы. Подробная информация о том, как выполняются эти методы, описана в этом протоколе пошагово, включая метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (OTO), последовательную визуализацию ультратонких срезов и дисплей визуализации.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются одними из самых важных органелл в клетке. Они служат центральным узлом клеточной биоэнергетики и метаболизма 1,2 и играют важнейшую роль в развитии рака3. Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из самых трудно поддающихся лечению онкологических заболеванийиз-за его быстрого распространения и высокого уровня смертности. Митохондриальная дисфункция, которая в основном вызвана изменениями в морфологии митохондрий 3,5,6,7, связана с механизмами заболевания, лежащими в основе ПК8. Митохондрии также очень динамичны, что отражается в частых и динамичных изменениях в их сетевой связности и структуре крист9. Изменение структуры крист может непосредственно влиять на функцию митохондрий и клеточное состояние 10,11, которые значительно изменяются во время роста опухолевых клеток, метастазирования и изменений микроокружения опухоли 12,13.

В последние годы ученые изучали эту органеллу с помощью ЭМ-наблюдений14,15,16,17; Например, исследователи проанализировали динамику митохондрий с помощью методов 3D-реконструкции 6,7,18,19. Общая концепция и метод 3D-реконструкции изображений электронной микроскопии были официально установлены еще в 1968 году и включали в себя сочетание электронной микроскопии, электронной дифракциии компьютерной обработки изображений для реконструкции фагового хвоста Т4. До настоящего времени технология 3D-визуализации электронной микроскопии добилась значительных успехов с точки зрения разрешения изображения 21, степени автоматизации22 и объема обработки23 и использовалась во все более широком масштабе в биологических исследованиях, от уровня тканей до уровня ультраструктуры органелл в нанометровом масштабе24. В последние годы 3D-визуализация в электронной микроскопии также стала перспективной технологией для широкого спектра применений25,26,27.

Растущее внимание к митохондриальным кристам особенно иллюстрирует основные требования к визуализации ультраструктурного объема. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была использована для визуализации образцов, собранных на медной сетке (400 меш)28, при этом электронный пучок проходит через разрез. Однако из-за ограниченного диапазона медной сетки невозможно полностью отобразить непрерывные срезы одного и того же образца29. Это усложняет изучение структур-мишеней при ПЭМ-визуализации. Кроме того, ПЭМ полагается на трудоемкие и подверженные ошибкам ручные задачи, включая вырезание и сбор нескольких срезов и их последовательную визуализацию21, поэтому он не приспособлен для ультраструктурных реконструкций образцов большого объема23. В настоящее время реконструкция изображений больших объемов образцов с высоким разрешением достигается за счет использования специализированного оборудования, такого как массив камер TEM (TEMCA)30 или две системы TEMCA второго поколения (TEMCA2)31, которые позволяют автоматизировать высокопроизводительную визуализацию за короткое время. Тем не менее, этот тип визуализации не имеет преимущества в том, что он прост в получении и универсален из-за необходимости индивидуального оборудования.

По сравнению с ПЭМ, метод автоматической генерации тысяч последовательных объемных изображений для больших площадей на основе SEM 32,33 повышает эффективность и надежность последовательной визуализации и обеспечивает более высокое z-разрешение34. Например, серийная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) позволили достичь 3D-реконструкции ультраструктуры с высокой скоростью, эффективностью и разрешением35,36. Тем не менее, поверхность блока неизбежно срезается механическим способом алмазным ножом SBF-SEM или фрезерованием сфокусированным ионным пучком FIB-SEM33,37. Из-за деструктивного действия двух методов на образцы невозможно повторно реконструировать ту же структуру мишени для дальнейшего анализа38,39,40. Кроме того, в нескольких исследованиях была предпринята попытка реконструировать ультраструктуру 3D-органелл раковых клеток с помощью ЭМ для наблюдения за патологическими изменениями12. По этим причинам для дальнейшего выяснения патологических механизмов раковых клеток, таких как клетки рака поджелудочной железы, мы предлагаем новую технологию 3D-реконструкции изображений серийных срезов с использованием ультрамикротома и полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа (FE-SEM) для анализа ультраструктуры митохондрий на уровне крист; С помощью этой технологии можно получать данные с высоким разрешением, используя эффективный и доступный метод. Серийные ультратонкие срезы, изготовленные с помощью ультрамикротома, могут храниться в сетчатом футляре и многократно повторяться, даже по прошествиинескольких лет. FE-SEM высоко ценится как инструмент в различных областях исследований благодаря своей способности обеспечивать получение изображений с высоким разрешением, большим увеличением и универсальностью42. В попытке отобразить тонкую структуру органелл в 3D, метод получения последовательных стеков 2D-изображений с полезным разрешением с использованием обратно рассеянных электронов, полученных с помощью FE-SEM 43,44, также может быть использован для достижения высокопроизводительной и многомасштабной визуализации целевых областей или связанных с ними структур без специального оборудования45. Генерация артефактов заряда напрямую влияет на качество получаемых изображений, поэтому особенно важно сократить время выдержки.

Таким образом, настоящее исследование развивает экспериментальные процедуры, используемые в этом методе SEM для реконструкции 3D-структуры митохондриальных крист46. В частности, мы показываем процесс, разработанный для достижения полуавтоматической сегментации митохондриальных областей и оцифровки 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения Amira, который также включает в себя изготовление образцов срезов с использованием традиционного метода подготовки образцов OTO44,47, завершение сбора срезов с помощью ультрамикротомной резки и получение последовательных 2D-данных с помощью FE-SEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка материала

  1. Культивируют 2 x 106 клеток Panc02 в 12 мл среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина) и выдерживают при 37 °C и влажности 95% в атмосфере 5% углекислого газа и 95% воздуха в течение 48 ч.
  2. Соберите клетки Panc02, центрифугируйте при 28 x g в течение 2 мин, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Убедитесь, что образец имеет соответствующий размер (1 x 107 клеток), так как в противном случае следующие этапы фиксации и обезвоживания не будут работать.
  3. Добавьте 1 мл 2,5% глутарового альдегида в качестве фиксатора для фиксации свежих клеток Panc02 в пробирках микроцентрифуги объемом 1,5 мл на ночь при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы необходимо центрифугировать при 1,006 x g в течение 5 мин на каждом из следующих этапов (шаги 1.3-1.11).
  4. Отсасывайте фиксатор и дважды промывают образцы 0,1 М фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем дважды промывают двойной дистиллированной водой (ddH2O) комнатной температуры в течение 10 мин каждый.
  5. Добавляют 50 мкл раствора, содержащего 1% тетраоксид осмия (OsO 4) и 1,5% ферроцианида калия в соотношении 1:1 при4 °С в течение 1 ч. Затем дважды промыть 0,1 M PBS в течение 10 минут каждый раз и промыть ddH2O еще 10 минут.
  6. Добавьте 1 мл 1% тиоуглеводразида (ТГС), инкубируйте при комнатной температуре от 30 мин до 1 ч, а затем промойте ддН2О четыре раза по 10 мин каждый раз.
  7. Добавьте 50 мкл 1%OsO4, закрепите при комнатной температуре на 1 ч, а затем смойте ddH2O четыре раза по 10 мин каждый раз.
  8. Добавьте 1 мл 2% уранилацетата при температуре 4 °C на ночь, а затем смойте ddH2O четыре раза в течение 10 минут каждый раз.
  9. Добавляют 1 мл раствора Уолтона (0,066 г нитрата свинца, растворенного в 10 мл 0,03 моль/л исходного раствора аспарагиновой кислоты) при 60 °C в течение дополнительного 1 ч инкубации.
  10. Промывайте ddH 2 O четыре раза в течение 10 минут каждый раз, а затем обезвоживайте в серии дифференцированного спирта в течение 10 минут каждый раз: 50% спирта, 70% спирта, 80% спирта, 90% спирта 1 раз и 100% спирта2раза. Затем дважды обезвоживайте в 100% ацетоне по 10 минут каждый раз. Используйте по 1 мл каждого раствора для обезвоживания.
  11. Смешайте 200 мкл ацетона с эпоксидной смолой Pon 812 в соотношении 3:1, 1:1 и 1:3. Замочите образец в смоле при комнатной температуре на 2 ч, 4 ч и 4 ч соответственно, а затем возьмите 100% эпоксидную смолу Pon 812 для пропитки на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этапов окрашивания и заделки смолы важно работать в вытяжном шкафу, так как это токсичные вещества. Кроме того, во время эксперимента необходимо надеть лабораторные халаты и перчатки, устойчивые к растворителям.
  12. Поместите образцы в форму для встраивания, а затем поместите в духовку при температуре 60 °C на 48 часов для полимеризации. Используйте плоскую заделку29 , чтобы уменьшить появление смолы вокруг образца. Это упрощает установку образца и снижает влияние артефактов заряда на последующую сегментацию изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего создания горизонтальной режущей поверхности можно добавить небольшое количество смолы в отверстие формы, стараясь не переполнить его.
  13. Готовят кремниевые пластины, предварительно промывая их, а затем гидрофилизируя концентрированным раствором Н2 СО4/Н2О2 в течение 30 мин. На гидрофилизированные кремниевые пластины с помощью ультрамикротома поочередно нарезать полоски толщиной 70 нм и высушить их в духовке при температуре 60 °C в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно захватывайте срез по мере того, как ломтик всплывает на поверхность пластин, чтобы предотвратить потерю или деформацию среза.

2. Получение изображений и трехмерная реконструкция

  1. Перед установкой кремниевой пластины на сцену трижды промойте срезы дистиллированной водой и высушите их на воздухе. Отрежьте проводящую углеродную ленту размером 1 см x 0,5 см и приклейте ее между кремниевой пластиной и этапом образца SEM, чтобы завершить настройку образца (Рисунок 2E).
  2. Установите параметр ускоряющего напряжения FE-SEM на 2 кВ с рабочим расстоянием 4 мм (рис. 3B и табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы улучшить соотношение сигнал/шум и уменьшить шум на изображении, по возможности наблюдайте при малом увеличении. По мере увеличения кратности дальность сканирования РЭМ уменьшается, что приводит к увеличению накопления заряда на изображениях.
  3. Нажмите на значок H/L в верхней строке меню. Во-первых, при малом увеличении сориентируйте первую секцию целевых полос среза, а затем снова нажмите на опцию H/L (рис. 3A), чтобы переключиться в режим большого увеличения; Соберите подходящее изображение для интересующей структуры, отрегулировав яркость, контрастность и увеличение изображения.
  4. Выберите Project View > Open Data (Открытые данные) и импортируйте файлы изображений для анализа в программное обеспечение.
  5. Выровняйте изображения, щелкнув Align Slices > Edit (рисунок 4B), и отрегулируйте значение Intensity Range в строке меню в левом нижнем углу, изменив прозрачность изображения. Здесь используйте полуавтоматическую стратегию выравнивания; В частности, с помощью автоматического выравнивания сделайте так, чтобы изображения перекрывались с предыдущим изображением, а затем выполните ручную тонкую настройку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе, в процессе выравнивания, предыдущее изображение использовалось в качестве эталона, а операции перемещения и поворота были использованы для максимального перекрытия целевой структуры двух изображений. Нажатие на Align Current Slice Pair может помочь автоматически выровнять изображения, но может произойти неправильное размещение.
  6. Выберите модуль «Извлечение подтома» и обрежьте выровненные наборы данных, чтобы они соответствовали размеру перекрывающейся части всего стека.
  7. В подразделе Segmentation (рис. 4C) выберите Resample > Segmentation > Save. Выберите порог инструмента «Волшебная палочка» и размер инструмента «Кисть», чтобы выбрать правильный диапазон. Опять же, используйте полуавтоматический метод сегментации, сначала используя Волшебную палочку, чтобы автоматически выбрать подходящую большую область, а затем используйте Кисть, чтобы точно описать детали.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Волшебная палочка может быть применена к сегментированным изображениям на основе очевидных различий в интенсивности пикселей, существующих между интересующей структурой и окружающими структурами, путем изменения значения Маскирования и использования Предельной линии рисования. Он не способен различать артефакты заряда, возникающие при получении изображения. Это может привести к некорректной сегментации по целевым регионам. Инструмент «Кисть » можно использовать для сегментации вручную, чтобы точно реконструировать биологические структуры.
  8. В разделе Segmentation > Selection, нажмите на значок + , чтобы добавить выбранную область (рисунок 4C).
  9. Повторите описанный выше шаг (2.8) для выбора одной и той же целевой структуры на разных изображениях до тех пор, пока не будет завершен выбор для реконструкции интересующих микроструктур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процессов митохондриального ремоделирования выбор целевого объекта должен быть выполнен по изображению в середине группы последовательных изображений. Если по первому или последнему снимку выбрана нужная зона, то результат реконструкции не сможет представить полную 3D-визуализацию.
  10. После завершения региональной сегментации сгенерируйте файл изображения в соответствии с наилучшими результатами по размеру объекта и разрешению изображения. Нажмите на Crop Editor, а затем введите число 6 в поле Virtual Slider (Виртуальный ползунок ) (Рисунок 4C).
  11. В раскрывающемся меню слева щелкните правой кнопкой мыши серую область под подразделом « Проект » и выберите «Создать поверхность» > « Создать» > «Применить». В созданном файле используйте модуль " Вид поверхности" для создания структуры поверхности и 3D-представления.

3. Количественная оценка

  1. Нажмите « Удалить небольшие пятна» > «Применить» (рисунок 4D). В подразделе Project щелкните правой кнопкой мыши на серой области и выберите Label Analysis > Apply (рисунок 4D).
  2. Настройте имя столбца и выберите группу мер. Выберите Volume3d и Length3d в поле Собственные измерения.
  3. Нажмите кнопку «Применить» в левом нижнем углу экрана. Скопируйте данные и график в статистическое программное обеспечение, такое как GraphPad.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При культивировании клеток (рис. 1А) мы сначала разделили клетки рака поджелудочной железы на контрольную группу, культивируемую с использованием полной питательной среды, группу (1S,3R)-RSL348 (RSL3, активатор ферроптоза, 100 нМ) и группу RSL3 (100 нМ) плюс ферростатин-149 (Fer-1, ингибитор ферроптоза, 100 нМ). С помощью описанных выше экспериментальных этапов сканирующий электронный микроскоп получил 38 (дополнительный рисунок 1), 43 (дополни...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь метод представляет собой полезное пошаговое руководство по применению техники 3D-реконструкции, которая включает в себя применение технологии электронной микроскопии и обработки изображений для укладки и сегментации 2D-томографических изображений, полученных из последовательных ультратонких срезов. Этот протокол подчеркивает ограниченность 2D-изображений, которая может быть решена с помощью 3D-визуализации ультраструктуры органеллы, которая имеет преимущества высокой воспроизводимости структур на выс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (Z23H290001, LY19H280001); гранты Национального фонда естественных наук Китая (82274364, 81673607 и 81774011); а также Исследовательский проект общественного благосостояния Научно-технического гранта Хучжоу (2021GY49, 2018GZ24). Мы ценим большую помощь, техническую поддержку и экспериментальную поддержку со стороны Общественной платформы Медицинского исследовательского центра Академии китайских медицинских наук, Чжэцзянского китайского медицинского университета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
АцетонSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Аспарагиновая кислотаMCEHY-42068
Модифицированный орел Дульбекко' s среднийGibco11995115
ЭтанолMerck100983
Ферростатин-1MCEHY-100579
Фетальная бычья сывороткаGibco10437010
Полевой эмиссионный сканирующий электронный микроскопHITACHISU8010
ГлутаральдегидAlfa Aesar A10500.22
Свинец НитратСАНТА-КРУЗsc-211724
Тетраоксид осмияСАНТА-КРУЗSC-206008B
Panc02Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур 
Пенициллин-стрептомицинBiosharpBL505A
фосфатный буферный физиологический растворBiosharpBL302A
Pon 812 Эпоксидная смолаSPI CHEMGS02660
ферроцианид калияМаклинP816416
тиокарбогидразидMerck223220
ультрамикротомLEICAEMUC7
Uranyl АцетатRHAWNR032929
98102213

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39(2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644(2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610(2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037(2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604(2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673(2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254(2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350(2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383(2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118(2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56(2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38(2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804(2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368(2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373(2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068(2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321(2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414(2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021(2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371(2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431(2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340(2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740(2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916(2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036(2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699(2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996(2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial UltrastructurePancreatic Cancer CellsThree Dimensional ReconstructionScanning Electron MicroscopySerial Ultrathin SectionMitochondrial CristaeElectron MicroscopyOrganelle MorphologyOTO MethodMitochondrial Dysfunction

Related Articles