Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида на основе флуоресценции с использованием визуализации в реальном времени в клетках HeLa

Summary

Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.

Abstract

Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (Parkin^T240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.

Introduction

Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии¹, врожденном иммунитете^2,3 и клеточной сигнализации ^4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)^6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем ....

Protocol

1. Подготовка биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности. Сбрызните поверхность шкафа и всех материалов 70% этанолом.

1. Культивирование и трансфекция клеток HeLa
   1. Культивирование 30 000 клеток HeLa в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора L-глютамина (HeLa media; см. Таблицу материалов). Поместите ячейки на 35-миллиметровые чашки для визуализации состеклянным дном (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл предва....

Results

В этом протоколе количественное определение на основе флуоресценции использовалось для измерения мембранного потенциала и уровней супероксида митохондриальной сети после обработки CCCP (рис. 1). В этом рабочем процессе использовались клетки HeLa, иммортализированная клеточная линия, полученная из рака шейки матки. Клетки HeLa обычно используются для изучения митохондриальной биологии и являются относительно плоскими, что позволяет легко визуализировать митохондриальную сеть с помощью микроск.......

Discussion

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации³⁰. Существуют важные технические ограничения, которые следует учитывать при разработке этих экспериментов. Клетки HeLa трансфицировали пустым вектором YFP, YFP-Parkin^WT или YFP-Parkin^T240R. Пустой вектор YFP был использован в качестве контроля, чтобы подтвердить, что .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Химические вещества, пептиды и рекомбинантные белки
CCCP (карбонильный цианид m-хлорфенилгидразон)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) с 4,5 г/л глюкозы	Gibco	11-965-084
DMSO, безводный	ThermoFisher Scientific	D12345
Фетальная бычья сыворотка	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (реагент для трансфекции)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (раствор L-глютамина)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker темно-красный	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (редуцированная сывороточная среда)	ThermoFisher Scientific	31985070
тетраметилродамин, этиловый эфир, перхлорат (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Экспериментальные модели: Организмы/штаммы
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Кембриджский институт медицинских исследований)	N/A
>рекомбинантная ДНК
EYFP пустой вектор	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	Эта статья	Получена путем сайт-направленного мутагенеза из YFP-Parkin
WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
программное обеспечение и алгоритмы
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (программное обеспечение для работы с электронными таблицами)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Программное обеспечение для анализа)	Программное обеспечение GraphPad	https://www.graphpad.com
Other
35 мм Тарелка, покровное стекло No 1,5, диаметр стекла 20 мм, Инкубатор	MatTek	P35G-1.5-20-C
без покрытия (Климатическая камера)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Инвертированный микроскоп	Leica	N/A
Программное обеспечение для деконволюции молнии	Leica	N/A
STELLARIS 8 Конфокальный микроскоп	Leica	N/A