Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.

Abstract

Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (Parkin^T240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.

Introduction

Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии¹, врожденном иммунитете^2,3 и клеточной сигнализации ^4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)^6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем мире⁸. БП генетически связана с митофагией, митохондриальным путем контроля качества, необходимым для поддержания клеточного гомеостаза, который избирательно удаляет поврежденные митохондрии ^9,10. Исследования выявили несколько независимых путей митофагии, включая домен FUN14, содержащий 1 (FUNDC1)-опосредованную митофагию, Bcl-2-взаимодействующий белок 3 (BNIP3)-облегченную митофагию, NIX-зависимую митофагию и хорошо охарактеризованную PTEN-индуцированную киназу 1 (PINK1)/паркин-регулируемую митофагию^10,11. PINK1 (предполагаемая киназа) и Parkin (убиквитинлигаза E3) работают в тандеме с фосфо-убиквитинатом поврежденных митохондрий, что приводит к образованию аутофагосом, которые поглощают поврежденную органеллу и сливаются с лизосомами, чтобы инициировать деградацию 12,13,14,15,16. Мутации в Паркине были связаны с фенотипами, связанными с болезнью Паркина, такими как нейродегенерация из-за потери дофаминергических нейронов^17,18.

Здесь описан протокол, в котором клетки HeLa, обычно используемые иммортализированные клетки, полученные из рака шейки матки, используются для исследования роли паркина в поддержании здоровья митохондриальной сети. Клетки HeLa экспрессируют незначительные уровни эндогенного паркина и, следовательно, требуют экзогенной экспрессии паркина¹⁹. Чтобы изучить роль паркина в здоровье митохондриальной сети, клетки HeLa трансфицируют либо паркином дикого типа (Parkin^WT), либо мутантом паркина (Parkin^T240R), либо пустым контрольным вектором. ^{Parkin T240R} представляет собой аутосомно-рецессивную мутацию ювенильного паркинсонизма, которая влияет на активность лигазы Parkin E3, значительно снижая эффективность пути митофагии²⁰. Клетки HeLa подвергаются воздействию мягких (5 мкМ) или тяжелых (20 мкМ) концентраций карбонильного цианида м-хлорфенилгидразона (CCCP), митохондриального развязывающего агента. Лечение тяжелыми концентрациями CCCP обычно используется для индукции митофагии, опосредованной Паркином, в различных клеточных линиях, таких как клетки HeLa и COS-7^21,22,23.

После лечения протокол использует живую визуализацию митохондриальной сети с использованием двух доступных в настоящее время флуоресцентных красителей, нацеленных на митохондрии. Тетраметилродамин, этиловый эфир, перхлорат (TMRE) представляет собой катионный краситель, который флуоресцирует на основе потенциала митохондриальной мембраны²⁴, в то время как MitoSOX представляет собой митохондриальный супероксидный индикатор, где интенсивность флуоресценции зависит от концентрации^{супероксида 25}. Наконец, описанный протокол использует количественную оценку на основе флуоресценции и простой рабочий процесс для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида с минимальными возможностями для смещения пользователя. Хотя этот протокол был разработан для изучения функции митохондрий в клетках HeLa, он может быть адаптирован для дополнительных клеточных линий и первичных типов клеток для количественной характеристики здоровья митохондриальной сети.

Protocol

1. Подготовка биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности. Сбрызните поверхность шкафа и всех материалов 70% этанолом.

1. Культивирование и трансфекция клеток HeLa
   1. Культивирование 30 000 клеток HeLa в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора L-глютамина (HeLa media; см. Таблицу материалов). Поместите ячейки на 35-миллиметровые чашки для визуализации состеклянным дном (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл предварительно разогретой среды HeLa. Поддерживайте культуры HeLa при 5% CO₂ и 37 ° C^26,27.
   2. На следующий день после нанесения покрытия осмотрите 35-миллиметровые чашки для визуализации с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что клетки сливаются на ~ 50-60%. После слияния трансфицируйте клетки HeLa пустым желтым флуоресцентным белым вектором (YFP), YFP-Parkin^WT или YFP-Parkin^T240R (рис. 1A).
   3. Приготовьте две отдельные смеси в стерильных микроцентрифужных пробирках для каждой трансфекции. Перемешайте, постукивая по трубке или аккуратно пипетируя вверх и вниз.
      1. В пробирке 1 смешайте 200 мкл восстановленных сывороточных сред (см. Таблицу материалов) с 2 мкг плазмидной ДНК.
      2. В пробирке 2 смешайте 200 мкл восстановленной сывороточной среды с 6 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов)²⁸.
   4. Инкубируйте пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Добавьте пробирку 2 в пробирку 1, перемешайте пипеткой вверх и вниз и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
   5. Добавьте комплексы трансфекции по каплям в существующие чашки для визуализации, содержащие клеточные культуры HeLa, обеспечивая равномерное распределение по всей чашке. Поместите чашки для визуализации в инкубатор с 5% CO₂ и 37 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пометьте каждое блюдо соответствующей трансфицированной плазмидой. Для каждого эксперимента пометьте три чашки YFP-Parkin^WT (диметилсульфоксид [ДМСО; см. Таблицу материалов], 5 мкМ CCCP и 20 мкМ CCCP). Повторите маркировку с тремя тарелками YFP-Parkin^T240R и тремя пустыми векторными тарелками YFP.
2. Приготовление CCCP и флуоресцентных красителей
   ВНИМАНИЕ: Флуоресцентные красители часто чувствительны к свету. Храните красители в темноте, используя алюминиевую фольгу или коричневые центрифужные пробирки, чтобы уменьшить воздействие света.
   1. Сделайте рабочее сырье CCCP 5 мМ (см. Таблицу материалов), растворив 5 мг CCCP в 4,89 мл ДМСО. Сделайте 20 мМ рабочего материала CCCP, растворив 5 мг CCCP в 1,22 мл DMSO.
   2. Разбавьте 10 мкл исходного раствора MitoTracker Deep Red (см. Таблицу материалов) 1 мМ в 390 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее сырье 25 мкМ.
   3. Растворите 50 мкг MitoSOX Red²⁵ (см. Таблицу материалов) в 13 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее тело размером 5 мМ.
   4. Растворите 10 мг TMRE²⁴ (см. Таблицу материалов) в 19,4 мл ДМСО, чтобы получить исходный раствор 1 мМ. Разбавьте TMRE, добавив 10 мкл 1 мМ TMRE в 990 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее тело 10 мкМ.

2. Лечение CCCP и метечка митохондрий флуоресцентными зондами в клетках HeLa

ВНИМАНИЕ: Быстро выполните следующие шаги, чтобы убедиться, что клетки HeLa не находятся вне инкубатора в течение длительного периода времени.

1. На следующий день после трансфекции добавьте 2 мкл 5 или 20 мМ CCCP (конечная концентрация: 5 мкМ и 20 мкМ соответственно) к каждой экспериментальной пластине. Для контрольных пластин добавьте 2 мкл ДМСО. Верните планшеты в инкубатор с 5% CO₂ и 37 °C в течение 1,5 ч (рис. 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение CCCP длится в общей сложности 2 часа. Тем не менее, митохондрии помечаются флуоресцентными зондами в течение последних 30 минут лечения CCCP.
2. Через 1,5 часа выньте пластины из инкубатора и добавьте флуоресцентные зонды в чашки для визуализации. Верните планшеты в инкубатор с 5% CO₂ и 37 °C на 30 мин (рис. 1A).
   1. Эксперимент TMRE: добавьте 2 мкл 25 мкМ MitoTracker (конечная концентрация: 25 нМ) и 2 мкл 10 мкМ TMRE (конечная концентрация: 10 нМ).
   2. Эксперимент MitoSOX: добавьте 2 мкл 25 мкМ MitoTracker (конечная концентрация: 25 нМ) и 1 мкл 5 мМ MitoSOX (конечная концентрация: 2,5 мкМ).
3. После 2-часового лечения CCCP подготовьте клетки HeLa к визуализации (рис. 1A, B).
   1. Эксперимент TMRE: клетки HeLa сразу готовы к визуализации; убедитесь, что TMRE остается в среде для культивирования клеток HeLa.
   2. Эксперимент MitoSOX: Промойте клетки 3 раза 2 мл предварительно разогретого носителя HeLa, чтобы удалить свободный краситель MitoSOX. Добавьте 2 мл предварительно разогретой среды. Теперь клетки HeLa готовы к съемке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте клетки HeLa свежим, предварительно подогретым носителем HeLa, который содержит ту же концентрацию DMSO или CCCP, что и в экспериментальных условиях; не включайте MitoSOX или MitoTracker.

3. Настройка получения изображений конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение клеток HeLa с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного масляным иммерсионным объективом с 63x/1,40 числовой апертурой (NA) и камерой для окружающей среды (см. Таблицу материалов).

1. За 1 ч до визуализации включите CO₂, открыв клапан резервуара. Нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить контроллер окружающей среды для микроскопа. Используйте стрелки вверх и вниз на сенсорной панели, чтобы отрегулировать температуру до 37 °C и CO₂ до 5%. Нажмите «Установить», когда закончите.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что двери в экологическую камеру закрыты, и дождитесь стабилизации условий.
2. Настройки лазера
   1. Включите лазер белого света (WLL) и установите мощность лазера на 85% и регулятор возбуждения на максимальную мощность. Перейдите на вкладку « Приобрести », выберите « Добавить лазер» и в появившемся диалоговом окне переключите WLL в положение «Вкл.». Нажмите кнопку « Мощность лазера » и введите 85%. Нажмите кнопку «Управление возбуждением » и выберите « Максимальная мощность » в раскрывающемся меню (рис. 2A).
   2. Эксперимент TMRE: Установите спектры возбуждения и излучения для YFP, MitoTracker и TMRE.
      1. Для YFP установите лазер возбуждения на 514 нм и окно спектров излучения на 524-545 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите «Добавить лазер» и перетащите его в «Настройка 1». Дважды щелкните линию возбуждения и введите 514 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 524 для начала и 545 для конечной длины волны.
      2. Для MitoTracker Deep Red установите лазер возбуждения на 641 и окно спектров излучения на 650-750 нм. На вкладке «Приобретение» нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите ее в параметр 1. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 641 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 650 для начала и 750 для конечной длины волны.
      3. Для TMRE установите лазер возбуждения на 555 нм и окно спектров излучения на 557-643 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите его в Настройка 2. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 555 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 557 для начала и 643 для конечной длины волны.
   3. Эксперимент MitoSOX: Установите спектры возбуждения и излучения для YFP, MitoTracker и MitoSOX (рис. 2B).
      1. Для YFP установите лазер возбуждения на 507 нм и окно спектров излучения на 517-540 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите ее в Настройка 1. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 507 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 517 для начала и 540 для конечной длины волны.
      2. Для MitoSOX установите лазер возбуждения на 547 нм и окно спектров излучения на 564-636 нм. На вкладке «Получить » нажмите кнопку « Добавить новую настройку »; затем нажмите кнопку «Добавить лазер » и перетащите его в Настройка 2. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 547 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 564 для начала и 636 для конечной длины волны.
      3. Для MitoTracker Deep Red установите лазер возбуждения на 641 нм и окно спектров излучения на 652-742 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите его в настройку 3. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 641 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 652 для начала и 742 для конечной длины волны.
3. Настройки получения изображения (рис. 2C)
   1. Установите формат 1,024 x 1,024, скорость сканирования 600 Гц и среднее значение строки 3.
      1. Выберите вкладку «Приобретение» и нажмите кнопку «Формат ». В раскрывающемся меню выберите 1,024 x 1,024. Нажмите кнопку «Скорость » и выберите 600 в раскрывающемся меню. Затем нажмите кнопку «Среднее по линии » и в раскрывающемся меню выберите 3.
      2. Включите двунаправленное сканирование и установите фазу и коэффициент масштабирования на 22,61 и 1,50 соответственно.
         1. На вкладке «Приобретение» переключите двунаправленную кнопку в положение «Вкл.». Нажмите на настройку фазы X и установите ее на 22.61. Нажмите на настройку Zoom Factor и установите ее на 1.50.

4. Получение изображения

ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен сделать визуальное суждение, чтобы выбрать клетки на основе сигнала флуоресценции YFP. Избегайте перенасыщенных пикселей, так как они могут существенно повлиять на количественную оценку интенсивности флуоресценции. Используйте таблицу подстановки «больше/меньше», указывающую насыщенность пикселей, чтобы избежать получения насыщенных изображений.

1. Нажмите на интересующую настройку и нажмите Fast Live, чтобы обеспечить предварительный просмотр флуоресцентного изображения в реальном времени.
2. Отрегулируйте усиление и интенсивность, дважды щелкнув по соответствующему детектору. В появившемся диалоговом окне отрегулируйте усиление с помощью ползунка. Чтобы изменить интенсивность, дважды щелкните линию возбуждения и используйте стрелки вверх и вниз во всплывающем окне, чтобы изменить интенсивность. Нажмите кнопку Остановить, чтобы завершить предварительный просмотр.
   1. Эксперимент TMRE: сначала сфотографируйте контрольную пластину DMSO. Отрегулируйте усиление и интенсивность сигнала TMRE (настройка 2) так, чтобы интенсивность митохондриальной сети была чуть ниже насыщения; Сохраняйте усиление и интенсивность постоянными для эксперимента. Отрегулируйте усиление и интенсивность MitoTracker и YFP (настройка 1) так, чтобы митохондриальная сеть была видимой, но тусклой.
   2. Эксперимент MitoSOX: сначала сфотографируйте контрольную пластину DMSO. Отрегулируйте усиление и интенсивность сигнала MitoSOX (настройка 2) так, чтобы флуоресценция была видимой, но тусклой; Сохраняйте усиление и интенсивность постоянными для эксперимента. Отрегулируйте усиление и интенсивность YFP (настройка 1) и MitoTracker (настройка 3) так, чтобы митохондриальная сеть была видимой, но тусклой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите усиление и интенсивность TMRE и MitoSOX, так как эти значения должны оставаться постоянными на протяжении всего эксперимента. Флуоресцентные сигналы YFP и MitoTracker не количественно оцениваются в этом протоколе. Таким образом, усиление и интенсивность можно регулировать для каждого изображения. Наиболее эффективно иметь настройки усиления и интенсивности, при которых клетки хорошо видны, но все еще тусклые, чтобы гарантировать, что клетки не подвергаются чрезмерной интенсивности лазера, которая вызывает повреждение клеток или фотообесцвечивание.
3. После завершения настройки усиления и интенсивности нажмите « Пуск », чтобы получить изображение. Получение изображений 20 ячеек в каждом экспериментальном условии (например, пять изображений с четырьмя ячейками на изображение; Рисунок 2D).

5. Количественная оценка интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы изображений сохраняются в формате «.lif» и совместимы с ImageJ²⁹. Типы файлов, совместимые с ImageJ, указаны на их веб-сайте. Может потребоваться преобразовать тип файла, если он несовместим.

1. Создайте и сохраните интересующий регион (ROI).
   1. В ImageJ выберите Файл | Новинки | Рис. В появившемся диалоговом окне нажмите кнопку ОК.
   2. Нажмите кнопку «Прямоугольник» и нарисуйте рамку размером 6 микрон x 6 микрон. Откройте менеджер ROI, нажав «Анализировать» | Инструменты | ROI Manager и дождитесь появления диалогового окна с ROI manager (рисунок 3A). Добавьте прямоугольную рентабельность инвестиций для менеджера, нажав кнопку Добавить в диалоговом окне менеджера. Сохраните рентабельность инвестиций, выбрав «Еще», затем нажмите кнопку «Сохранить» и «ОК».
2. Измерьте интенсивность флуоресценции.
   1. На изображении J нажмите « Файл» и выберите « Открыть». В диалоговом окне выберите файлы изображений для эксперимента и нажмите кнопку Открыть.
   2. Дождитесь появления окна Bio-formats Import Options (рисунок 3B). Выберите «Разделить каналы » и нажмите «Открыть».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция разделения каналов позволяет открывать каждый канал на изображении как отдельное окно. Канальный ордер соответствует ордеру на приобретение.
      1. Эксперименты TMRE : YFP (настройка 1) – первый канал (c = 0); MitoTracker (Настройка 1) – второй канал (c = 1); и TMRE (настройка 2) – третий канал (c = 2).
      2. Эксперименты MitoSOX : YFP (настройка 1) – первый канал (c = 0); MitoSOX (настройка 2) – второй канал (c = 1); и MitoTracker (настройка 3) – третий канал (c = 2).
   3. Отрегулируйте яркость, выбрав «Изображение» | Отрегулируйте | Яркость (рис. 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте «Установить» или «Применить», чтобы яркость изображения не изменилась навсегда. Иногда интенсивность флуоресценции не видна в каналах TMRE или MitoSOX. Отрегулируйте яркость, чтобы упростить визуализацию. Изменение яркости не влияет на исходные значения интенсивности флуоресценции.
   4. Нажмите «Анализировать» и выберите «Установить измерения». Установите флажки Area (Площадь) и Среднее значение серого (Mean gray) и нажмите OK (рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение серого – это интенсивность флуоресценции.
   5. Откройте ROI Manager и загрузите ROI , сохраненный на шаге 5.1, нажав «Анализировать» | Инструменты | Менеджер по рентабельности инвестиций. В диспетчере рентабельности инвестиций нажмите «Еще», затем « Открыть» в появившемся списке и выберите сохраненную рентабельность инвестиций.
   6. Измерьте интенсивность флуоресценции пяти случайных областей в одной ячейке, выбрав сохраненную рентабельность инвестиций в диспетчере рентабельности инвестиций, и переместите рентабельность инвестиций в случайное место в ячейке (рис. 3E). Измерьте интенсивность флуоресценции, нажав клавишу M. Повторите этот шаг с четырьмя дополнительными неперекрывающимися областями. Когда появится диалоговое окно со значениями площади и среднего значения серого (рис. 3F), скопируйте и вставьте значения в электронную таблицу для анализа.
      1. Эксперимент TMRE : выберите изображение (c = 2).
      2. Эксперимент MitoSOX : выберите изображение (c = 2).
   7. Получите средние значения интенсивности флуоресценции. Используя программное обеспечение для работы с электронными таблицами (см. Таблицу материалов), усредните пять средних значений серого. Повторите этот процесс для каждой ячейки.
   8. Проанализируйте и сравните средние значения серого TMRE или MitoSOX в экспериментальных условиях с помощью статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов; Рисунок 4 и рисунок 5). Представляйте данные в виде гистограмм или скрипичных графиков.

Representative Results

Discussion

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации³⁰. Существуют важные технические ограничения, которые следует учитывать при разработке этих экспериментов. Клетки HeLa трансфицировали пустым вектором YFP, YFP-Parkin^WT или YFP-Parkin^T240R. Пустой вектор YFP был использован в качестве контроля, чтобы подтвердить, что экспериментальные результаты были специфичны для Паркина. Для переходной трансфекции экспериментально было определено отношение масс 1:3 для ДНК к реагенту трансфекции, чтобы получить самую высокую скорость трансфекции, где для каждой конструкции²⁸ использовали 2 мкг плазмидной ДНК. Важно было сохранить согласованность YFP-метки для всех конструкций, поскольку флуоресцентные белки различаются по врожденной яркости^31,32. Если необходимо использовать несколько флуоресцентных белковых меток, то следует выбирать флуоресцентные белки с аналогичной яркостью и фотостабильностью³³.

Для измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида были выбраны два хорошо документированных красителя. Сигнал флуоресценции TMRE основан на потенциале митохондриальной мембраны, в то время как интенсивность флуоресценции MitoSOX зависит от уровней супероксида. Для флуоресцентной визуализации не должно быть спектрального перекрытия между флуоресцентными зондами. Однако первоначальный протокол был выполнен с использованием mCherry-Parkin^WT и mCherry-Parkin^T240R, которые перекрывались со спектрами TMRE и MitoSOX с красным смещением. Чтобы избежать спектрального перекрытия и свести к минимуму потенциальные перекрестные помехи, были выбраны конструкции Паркина, помеченные YFP. Эта корректировка потребовала изменения цвета MitoTracker с зеленого на ярко-красный. Кроме того, была оптимизирована плотность покрытия клеток HeLa; Первоначально клетки HeLa были покрыты 45 000 клеток на чашку визуализации, но это привело к чрезмерному сливу блюд. Высокое слияние клеток может снижать эффективность трансфекции, способствовать гибели клеток и изменять клеточный метаболизм^34,35,36. Чтобы избежать этих потенциальных воздействий, клетки были покрыты плотностью 30 000 клеток на чашку визуализации.

Основным ограничением этого протокола является возможность предвзятости пользователя, особенно при выборе ячеек и мест окупаемости инвестиций. Протокол использует изменения интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX в качестве функционального считывания мембранного потенциала и уровней супероксида. Таким образом, отбор клеток с использованием этих зондов потенциально может повлиять на результаты эксперимента. Чтобы бороться с этой предвзятостью, мы выбрали клетки, основанные исключительно на экспрессии YFP. Неперекрывающиеся ROI были случайным образом выбраны в митохондриальной сети в клетке. Хотя этот метод ранее использовался для измерения интенсивности флуоресценции²⁷, могут быть приняты дополнительные меры по снижению смещения. Во-первых, исследование может быть ослеплено с помощью инструментов слепого анализа в ImageJ, чтобы предотвратить выбор ROI, который поддерживает ожидаемые результаты. Во-вторых, интенсивность флуоресценции может быть измерена с помощью передового программного обеспечения для анализа изображений, которое устраняет необходимость в окупаемости инвестиций.

Хотя в этом протоколе используется конфокальная микроскопия для количественного определения на основе флуоресценции, дополнительные методы, такие как проточная цитометрия, могут быть использованы для количественной оценки изменений флуоресценции в TMRE и MitoSOX³⁷. Здесь мы использовали конфокальную микроскопию, а не проточную цитометрию, чтобы визуализировать морфологию митохондриальной сети. Изложенный протокол может быть легко адаптирован для измерения флуоресценции TMRE и MitoSOX с помощью проточной цитометрии, дающей аналогичные экспериментальные результаты. Кроме того, анализы скорости потребления кислорода (OCR) могут быть использованы для обнаружения изменений функции митохондриальной цепи переноса электронов без катионных красителей. В то время как OCR обеспечивает чувствительную меру митохондриальной дисфункции, он не является специфическим для мембранного потенциала или концентрации супероксида, а вместо этого обеспечивает глобальную меру митохондриальной функции³⁸. Эти анализы могут быть выполнены в сочетании с экспериментами TMRE и MitoSOX для оценки здоровья митохондрий³⁹.

Хотя в этом протоколе особое внимание уделяется влиянию митохондриального разъединителя CCCP⁴⁰, можно использовать повреждающие реагенты с альтернативными механизмами. Например, антимицин А и олигомицин А являются ингибиторами цепи переноса электронов, обычно используемыми для индукции повреждения митохондрий посредством производства активных форм кислорода (АФК)³⁸. В то время как мы специально измеряли уровни митохондриального супероксида с помощью MitoSOX, внутриклеточные АФК можно было измерить с помощью CellROX. В клетках HeLa необходимо было сверхэкспрессировать паркин из-за низкой эндогенной экспрессии. В будущих исследованиях можно было бы наблюдать влияние экспрессии паркина на здоровье митохондриальной сети с использованием систем клеточных культур, которые экспрессируют эндогенный паркин⁴¹. Поскольку митохондрии являются важнейшими регуляторами энергетического обмена и клеточного гомеостаза, митохондриальная дисфункция связана с многочисленными заболеваниями, включая диабет 42, болезнь Альцгеймера 43,44,45^, рак⁴⁶ и заболевание печени ⁴⁷. Таким образом, этот рабочий процесс может быть адаптирован для изучения здоровья митохондрий и нарушения регуляции в соответствующих клеточных линиях и первичных культурах.

Materials

<strong>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</strong>
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&nbsp;	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&nbsp;	Gibco&nbsp;	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX&nbsp; Red&nbsp;	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&nbsp;	ThermoFisher Scientific	T669
<strong>Experimental models: Organisms/Strains</strong>
HeLa-M (<em>Homo sapiens</em>)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
<strong>Recombinant DNA</strong>
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
<strong>Software and Algorithms</strong>
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office&nbsp;	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
<strong>Other</strong>
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A