Оценка афидицидного действия энтомопатогенных грибов в отношении партеногенетического насекомого, горчичной тли, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Горчичная тля (L. erysimi) является печально известным вредителем, который поражает различные крестоцветные культуры, нанося значительный экономический ущерб¹. Несмотря на то, что для борьбы с нашествием тлей было рекомендовано несколько систематических инсектицидов, частое использование этих инсектицидов вызывает опасения по поводу устойчивости к пестицидам ^2,3. Таким образом, с точки зрения экологически чистой борьбы с вредителями, энтомопатогенные грибы (EPF) могут служить подходящей альтернативной стратегией борьбы. EPF является насекомым-патогеном, способным заражать хозяев, проникая в их кутикулу, что делает его мощным средством для борьбы с тлей и другими насекомыми, сосущими растения⁴. Кроме того, EPF зарекомендовал себя как осуществимый и устойчивый метод борьбы с вредителями, обеспечивающий такие преимущества, как антагонизм патогенов растений и стимулирование роста растений⁵.

EPF может быть получен путем травли насекомых или выделен из трупов насекомых в полевых условиях ^6,7. Однако перед дальнейшим применением грибковых изолятов необходим скрининг патогенности. Было проведено несколько исследований эффективности EPF против тли, которая является значительным вредителем сельскохозяйственных культур, способным нанести серьезный ущерб ^8,9. Горчичная тля, среди различных видов тли, была проверена на восприимчивость к нескольким штаммам Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. и даже Alternaria, который в первую очередь известен как сапрофитный и патогенный гриб для растений, но показал некоторые летальные эффекты против горчичной тли^10,11,12.

Для оценки эффективности EPF против тли в лабораторных условиях биопробы можно разделить на две основные части: инокуляционная камера и грибковая инокуляция. В настоящем протоколе описывается строительство инокуляционной камеры, в которой тля может поддерживаться с помощью различных методов, таких как вырезанный лист с черешком, обернутым влажным хлопком, вырезанный листовой диск с чашкой Петри, выстланный влажной фильтровальной бумагой, непосредственное обслуживание горшечных растений или вырезанный листовой диск, погруженный в водный агар в чашке Петри или контейнере^{10. 11,13}. Распространенные методы инокуляции грибов включают опрыскивание конидий, погружение тли в суспензию конидий, погружение листьев в суспензию конидий и инокуляцию эндофитов растений^11,14,15,16. Несмотря на то, что существуют различные методы инокуляции, биотесты должны имитировать условия применения в полевых условиях. Например, в случае с методом окунания листьев^12,17 можно оценить эффективность EPF, но поскольку тля поражает пораженные грибком листья, спинная сторона тли, которая является предпочтительным местом проникновения^, обычно не подвергается воздействию грибка.

Для оценки афидицидного действия EPF в лабораторных условиях в данном протоколе предлагается использовать метод отрывных листьев, описанный Yokomi и Gottwald¹⁸, с некоторыми модификациями с последующей инокуляцией конидий с помощью микрораспылителя. Этот метод поддерживает примерно 100% влажность в биопробирной камере не менее семи дней, не требуя дополнительного пополнения водой^18,19. Кроме того, ограничение тлей одной поверхностью обеспечивает их подверженность опрыскиванию конидиями и облегчает наблюдения²⁰. Однако тля может застрять на открытой поверхности агара при перемещении внутри инокуляционной камеры. Кроме того, регистрация данных в эксперименте в чашке Петри с горчичными тлями, которые являются партеногенетическими насекомыми, может быть сложной задачей из-за их быстрого развития и размножения. Трудно отличить привитых взрослых особей от их потомства без изъятия. Детали того, как действовать на этом этапе, редко упоминаются, и некоторые противоречивые факторы, такие как площадь потребления листьев, должны быть оптимизированы.

Этот протокол демонстрирует стабильную систему скрининга вирулентности изолятов EPF против горчичной тли, что позволяет выбирать потенциальные изоляты против различных видов тлей из обширной библиотеки EPF. Можно идентифицировать тлю, собранную в полевых условиях, и создать достаточную лабораторную популяцию горчичной тли для оценки афидицидного действия различных грибковых изолятов с использованием простой и осуществимой методологии с последовательными результатами. Тля развила многочисленные эволюционные механизмы в ответ на интенсивное и повторяющееся антропогенное давление на агроэкосистемы, что создает проблемы для продовольственной безопасности⁹. Таким образом, описанный метод может быть расширен для оценки потенциальных изолятов EPF против различных видов тлей.

ПРИМЕЧАНИЕ: Полная блок-схема показана на рисунке 1.

1. Сбор и уход за горчичной тлей

1. Сбор горчичной тли
   1. Переверните листья и визуально проверьте наличие горчичной тли на крестоцветных культурах в поле.
   2. Запишите информацию о месте отбора проб (например, GPS) и растениях-хозяевах, а также подтвердите историю применения инсектицидов у фермеров.
   3. С помощью аспиратора насекомых или тонкой малярной кисти (см. Таблицу материалов) соберите около 50 горчичных тлей в центрифужную пробирку объемом 50 мл из крестоцветных культур в поле и доставьте образец в лабораторию в течение 3 часов.
   4. Подготовьте временную чашку Петри для поддержания с вырезанными листьями крестоцветных и фильтровальной бумагой, пропитанной водой, на дне.
   5. Поместите пять тлей на чашку Петри для временного содержания при комнатной температуре (25 ± 2 °C) с относительной влажностью 70% и фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота) в течение 14 дней, чтобы убедиться, что тля избавлена от естественных врагов перед дальнейшим выращиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что тля, собранная в поле, свободна от естественных врагов, таких как паразитоидные осы или энтомопатогенные грибы, крайне важно убедиться в отсутствии этих организмов, прежде чем приступать к дальнейшему выращиванию.
2. Содержание горчичной тли
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для борьбы с горчичной тлей используйте листья крестоцветных, не содержащие пестицидов (в том числе биопестицидов).
   1. Обеспечьте стабильный и достаточный запас листьев крестоцветных (около 25 см² ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретайте листья крестоцветных либо на рынке, либо выращивайте растения. Перед длительным массовым выращиванием горчичной тли можно было протестировать несколько различных видов крестоцветных, чтобы найти подходящего крестоцветного. После того, как вид крестоцветного листа закреплен, не меняйте его. В данном исследовании использовали комацуну (Brassica rapa var. perviridis) в фазе 6-7 листьев (см. таблицу материалов). Дополнительно утилизируйте 2-3 самых старых листа.
   2. Добавьте воду до того, как фильтровальная бумага на дне полностью высохнет.
   3. Ежедневно наблюдайте за плотностью популяции горчичной тли. Популяция должна вырасти в 2-3 раза через 7 дней.
   4. Когда численность тли увеличится, разрежьте первоначально вырезанные листья с горчичной тлей на 4-6 более мелких частей и поместите каждый небольшой кусочек листа с горчичной тлей в одну чашку Петри со свежим вырезанным листом и фильтровальной бумагой, пропитанной водой.
   5. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 25 °C с фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота) и ежедневно наблюдайте за плотностью популяции горчичной тли.
   6. Удаляйте первоначальные вырезанные листья после того, как большая часть тли мигрирует на свежие вырезанные листья до того, как первоначальные листья сгниют.

2. Молекулярная идентификация горчичной тли

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения вида горчичной тли, собранной в полевых условиях, была проведена молекулярная идентификация с использованием двух молекулярных маркеров: последовательности, охарактеризованной амплифицированной областью (SCAR) на основе A05Le, разработанной Lu et ^al.21, и участка 1-й субъединицы цитохромоксидазы горчичной тли (COI) горчичной тли.

1. Выделение геномной ДНК горчичной тли
   1. Соберите примерно 50 тлей в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тля, используемая для молекулярной идентификации, должна быть потомками одной единственной тли, и различные стадии также могут быть объединены в одну и ту же пробирку для извлечения ДНК.
   2. Гомогенизируйте тлю с помощью гранулированного пестика и извлеките ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК Gene-Spin в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
   3. Элюируют геномную ДНК с помощью 50 мкл предварительно нагретой воды, не содержащей нуклеаз.
2. ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК
   1. Амплифицировать целевые последовательности ДНК из геномной ДНК тли с помощью ПЦР Master Mix (2x) с парами праймеров A05LeF/A05LeR и LeCO1F/LeCO1R (таблица 1) с различными программами ПЦР²¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция ПЦР общим объемом 20 мкл состоит из матрицы геномной ДНК тли объемом 2 мкл, 1 мкл прямого и 1 мкл обратного праймеров, 10 мкл ПЦР Master Mix (см. таблицу материалов) и 6 мкл ddH₂O.
   2. Проводят ПЦР в амплификаторе (см. Таблицу материалов) по следующей программе: 94 °C в течение 5 мин, 25 циклов по 94 °C в течение 45 с, 61 °C (для A05LeF/A05LeR) и 58 °C (для LeCO1F/LeCO1R) в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин с последующим окончательным расширением 72 °C в течение 5 мин.
   3. Проанализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в 1% агарозном геле для подтверждения идентичности горчичной тли (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пара праймеров A05LeF/A05LeR успешно амплифицирует правильный размер фрагмента ДНК, она убедительно идентифицирует собранную в поле тлю как горчичную тлю²¹. Пары праймеров приведены в таблице 2.
   4. Очистите продукт ПЦР от ампликона COI горчичной тли с помощью коммерчески доступного набора для геля/ПЦР в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) и секвенируйте продукт ПЦР с помощью коммерческой службы секвенирования.
3. Анализ последовательностей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно Lu et ^al.21, изгиб ДНК A05Le представляет собой специфичный для горчичной тли фрагмент ДНК; Таким образом, продукт A05Le PCR не нуждается в дополнительном секвенировании.
   1. Проверьте качество считывания с помощью программного обеспечения Chromas (см. Таблицу материалов) после получения последовательности LeCO1.
   2. Обрежьте чтение низкого качества в восходящем и нисходящем потоках, открыв файл fasta (или txt) и удалив чтение низкого качества.
   3. Отправьте обрезанную последовательность в NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с параметрами по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если размеры ампликонов наборов праймеров A05Le и LeCO1 верны, теоретически поиск последовательности по стандартным базам данных NCBI должен совпадать с выбором горчичной тли.

3. Приготовление энтомопатогенных грибов

ПРИМЕЧАНИЕ: EPF, использованный в данном исследовании, приведен в таблице 1.

1. Извлечение EPF из библиотеки грибов
   1. Разморозьте консервированные грибы (конидии, взвешенные в 30% глицерине) из морозильной камеры при температуре -80 °C.
   2. Переложите небольшое количество (примерно 10 мкл) суспензии конидий на планшет 6 см 1/4 декстрозного агара Сабуро (SDA) (0,75 г бульона декстрозы Сабуро с 1,5 г агара на 100 мл ddH₂O) и равномерно распределите ее с помощью клеточного разбрасывателя в ламинарном проточном колпаке.
   3. Чашку Петри запечатайте парафиновой пленкой и выдержите в темноте при температуре 25 °C в течение 10-14 дней.
   4. Повторное культивирование грибных изолятов путем разбрызгивания грибковой массы на планшете 1/4 SDA и инкубации грибов в темноте при 25 °C в течение 10-14 дней перед сбором²² конидий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грибковую культуру следует использовать примерно за 10 дней до инокуляции тли. Культуру EPF, возраст которой превышает 14 дней, не рекомендуется использовать в тесте на вирулентность.
2. Приготовление суспензии конидий
   1. Соскоблить конидии с 10-14-дневной культуры грибов на 1/4 планшета SDA путем инокуляции петлей после добавления 2-3 мл 0,03% Tween 80 (см. Таблицу материалов).
   2. Соберите грибковую суспензию в центрифужную пробирку.
   3. Встряхните раствор с наибольшей скоростью, подсчитайте количество конидий с помощью гемоцитометра под световым микроскопом и доведите концентрацию суспензии конидий до^10-8 конидий/мл.
   4. Перелейте суспензию конидий в микрораспылитель, стерилизованный ультрафиолетовым излучением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом снова взболтайте суспензию конидий, так как конидии склонны к выпадению осадка. Перед использованием микроопрыскиватель должен подвергаться воздействию ультрафиолетового излучения в ламинарном колпаке в течение 30 минут.

4. Скрининг вирулентности против горчичной тли

1. Подготовка вновь появившихся взрослых особей
   1. Переместите акрылых (без крыльев) и алатных (крылатых) взрослых особей из чашки Петри на свежесрезанные листья, чтобы воспроизвести новое потомство того же возраста. Удаляют взрослых особей через 24 ч, чтобы избежать скученности и свести к минимуму производство алированного потомства^23,24. В дальнейших экспериментах будут использоваться только взрослые особи.
   2. Выращивают потомство до взрослой стадии и удаляют потомство, которое не развивается во взрослую стадию через 48 ч (рис. 3), чтобы предотвратить возрастные различия между тлями для эксперимента. Дополнительно удаляют взрослых особей.
2. Подготовка камеры для инокуляции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала подготовить крестоцветные листья диаметром 9 см, чтобы листовой диск можно было погрузить в водный агар до затвердевания.
   1. Очистите листья крестоцветных водопроводной водой, удалите грязь и остатки, а также любых других членистоногих, если таковые имеются.
   2. Вытрите излишки воды бумажным полотенцем и проверьте, нет ли других членистоногих на поверхности листьев крестоцветных с помощью стереомикроскопа. Удалите всех членистоногих, если таковые имеются.
   3. Вырежьте листовой диск диаметром 9 см, либо непосредственно надавливая нижней чашкой Петри на лист в качестве формы, либо с помощью ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если листья меньше 9 см в диаметре, соедините пару вырезанных листьев.
   4. Приготовьте 1,5% водный агар для каждой чашки Петри, нагревая и растворяя 450 мг агара (см. таблицу материалов) в 30 мл ddH₂O с помощью микроволновой печи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество 1,5% водного агара может быть скорректировано в зависимости от масштаба эксперимента.
   5. Залейте 30 мл 1,5% водного агара в чашку Петри диаметром 9 см до застывания в ламинарном колпаке, а затем подождите, пока агар остынет до ~40 °C, пока поверхность агара не затвердеет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, не затвердела ли поверхность, осторожно горизонтально встряхнув чашку Петри.
   6. Поместите листовой диск абаксиальной поверхностью вверх поверх водного агара, заглубляя листовой диск в агар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму воздействие на поверхность агара.
   7. После того, как водный агар полностью застынет, закройте крышку чашки Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте крышку для испарения воды, если на крышке сразу же конденсируется много капель.
   8. Поместите 20 взрослых особей на диск листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать под стереомикроскопом, чтобы предотвратить повреждение ротового аппарата.
3. Инокуляция EPF и наблюдение
   1. Откройте крышку инокуляционной камеры и распылите 0,3 мл суспензии конидий (с шага 3.2) непосредственно на тлю и листовой диск с высоты около 15 см над листовым диском.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед распылением снова взбейте суспензию конидий. Перед экспериментом следует проверить зоны опрыскивания, так как они могут различаться у разных опрыскивателей. В этом случае рекомендуется 0,3 мл на расстоянии 15 см. Зона опрыскивания должна покрывать весь листовой диск, а листовой диск должен покрываться тонким слоем суспензии конидий. Если капли сходятся в стоячей воде на листе, объем прививки следует уменьшить. Очистите стол 70% этанолом перед инокуляцией и между использованием различных изолятов.
   2. Подождите, пока суспензия конидий высохнет, а затем закройте крышку, чтобы не утонула горчичная тля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тля редко бродит во время эксперимента; Тем не менее, следить за тем, чтобы тля не сбежала, все же необходимо.
   3. Загерметизируйте инокуляционную камеру парафиновой пленкой для поддержания высокой относительной влажности и поместите инокуляционную камеру в инкубатор при температуре 25 °C с фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота).
   4. Откройте крышку инокуляционной камеры для подсчета смертности под стереомикроскопом каждые 12 ч в течение 5 дней.
   5. Вытрите прилипшую к покрытию медвяную росу бумажным полотенцем и удалите вновь появившуюся тлю тонкой малярной кистью. Промывайте крышку водопроводной водой каждые 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Период наблюдения может варьироваться для разных видов тли в зависимости от продолжительности жизни взрослых особей.
   6. Держите труп на листовом диске на микоз, чтобы подтвердить успешную инокуляцию.
4. Подтверждение всхожести конидий
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным. Подтвердить скорость прорастания конидий попарно при проведении скрининга вирулентности для обеспечения активности конидий.
   1. Капните одну каплю суспензии конидий объемом 5 мкл на 1/4 SDA для трех репликаций.
   2. Через 18 ч рассчитайте всхожесть с помощью светового микроскопа. Подсчитайте случайным образом не менее 100 спор в одной капле, чтобы подтвердить скорость прорастания грибка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, всхожесть изолятов, используемых в эксперименте, должна быть выше 90%.

5. Биотестирование отобранных изолятов EPF

ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляты EPF, показавшие высокую вирулентность, которые были отобраны на этапе 4, были подвергнуты биотесту против горчичной тли с использованием четырех концентраций суспензий конидий (в диапазоне от 10⁴ до 10⁷ конидий/мл).

1. Приготовление суспензии конидий
   1. Повторите шаг 3.1 для восстановления выбранных изолятов EPF.
   2. Повторите шаг 3.2 для приготовления суспензии конидий в четырех концентрациях, включая 10⁴, 10^{5,10 6} и 10⁷ конидий/мл.
2. Подготовка вновь появившихся взрослых особей
   1. Повторите шаг 4.1, чтобы подготовить только что появившихся взрослых.
3. Подготовка камеры для инокуляции
   1. Повторите шаг 4.1. подготовить инокуляционную камеру.
4. Инокуляция EPF и наблюдение
   1. Повторите шаг 4.3. провести посев EPF и наблюдение с четырьмя концентрациями суспензии конидий соответственно.

6. Статистический анализ

1. Расчет скорректированной смертности
   1. Рассчитайте скорректированную смертность, используя формулу²⁵ Эбботта, как показано ниже:
      Скорректированная смертность (%) = [(M_T− M_C) × 100%] / (100− M_C)
      M_T представляет смертность в группе лечения, а M_C представляет смертность в контрольной группе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смертность контрольной группы не должна быть выше 20%.
   2. Откройте программную платформу SPSS (см. таблицу материалов), создайте переменные, включающие "treatment" и "cor_mor" (представляющие скорректированную смертность), и введите расчетные результаты для инокуляции разных изолятов в один и тот же момент времени с одинаковой концентрацией инокуляции.
   3. Выберите Analyze, Compare Mean and Proportions, Independent-Samples T Test в SPSS для независимого t-критерия.
   4. В SPSS введите обработку в поле "Grouping Variable" и cor_mor в поле "Test Variable(s)". Определите группы по различным грибным изолятам. Нажмите OK для анализа.
2. Расчет медианы летального времени (LT 50) и медианной летальной концентрации (LC₅₀)
   1. Откройте SPSS, создайте переменные "total", "response" и "duration"/"concentration" и введите записанный результат в электронную таблицу.
   2. Выберите Analyze, Regression, Probit в SPSS, чтобы вычислить LT 50 и/или LC₅₀.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если кумулятивная смертность в конечном итоге не превышает 50%, LT 50 и/или LC₅₀ не могут быть оценены.
   3. Введите итог в поле "Total Observed", отклик в поле "Response Frequency", длительность/концентрация в поле "Covariate(s)". Нажмите OK для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, нажмите « Параметры » и установите «Уровень значимости для использования коэффициента гетерогенности» на 0,05.

Представленная блок-схема иллюстрирует стабильное состояние горчичной тли от полевого сбора до скрининга вирулентности. Содержание тли от полевого сбора обеспечило стабильный рост колоний тлей при достаточной кормовой базе. Тля, собранная в полевых условиях, была подтверждена как горчичная тля с помощью молекулярных маркеров, включая размер ампликона ПЦР и секвенирование LeCO1. Скрининг вирулентности, проведенный с использованием метода отрывных листьев, показал стабильную выживаемость горчичной тли, при этом контрольная группа показала 85% выживаемости (рис. 4).

Во время скрининга вирулентности Cc-NCHU-213 продемонстрировал самую быструю способность убивать тлю, что привело к 50% и 90% смертей через 3 и 4,5 дня после инокуляции (d.p.i.) соответственно (рис. 4). Тем не менее, различные способности к уничтожению тли наблюдались среди пяти изолятов B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 и -153 демонстрировали медленную способность к уничтожению тли, со смертностью только 5% при 3 d.p.i., даже если исключить эффекты 0,03%-ного распыления Tween 80 или других летальных факторов (рис. 4). Таким образом, скорректированная формула смертности была использована для нормализации контрольной смертности. Большинство изолятов EPF против горчичной тли показали скорректированные показатели смертности выше 70% в течение 5 d.p.i., за исключением Pl-NCHU-152 (табл. 3). Среди этих изолятов EPF Bb-NCHU-286 продемонстрировал самый высокий уровень смертности – 100% (табл. 3). Кроме того, микоз EPF наблюдался на трупах горчичной тли, инфицированных Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum и Cordyceps cateniannulata во время скрининга вирулентности, что свидетельствует об эффективности этой системы (рис. 5).

По результатам скрининга вирулентности для биотестирования против горчичной тли были отобраны два изолята EPF, а именно Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213, обладающие быстрой активностью по уничтожению насекомых (40% и 50% смертности при 3 d.p.i. соответственно). Результаты показали достоверно различающиеся скорректированные показатели смертности для Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 при 3 и 4 d.p.i. при посеве 107 конидий/мл (рис. 6). В анализе LT50 лечение 107 конидиями/мл Cc-NCHU-213 показало значительно меньшую продолжительность по сравнению с другими методами лечения (табл. 4). Кроме того, значение LC50 Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) было ниже, чем у Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), что указывает на то, что Cc-NCHU-213 обладает большей вирулентностью против горчичной тли (табл. 5).

Рисунок 1: Экспериментальная блок-схема скрининга вирулентности EPF против горчичной тли. (А) Создание системы разведения горчичной тли. (B) Подготовка EPF. (C) Грибковая инокуляция. (D) Статистический анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Электрофорез геномной ДНК горчичной тли, амплифицированной наборами праймеров A05Le и Le CO1. Электрофорез проводили на 1% агарозном геле. M = 100.н. ДНК-лестница; bp = пары оснований. Красной звездочкой обозначен изгиб цели амплификации ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Различия между нимфой четвертого возраста и взрослой горчичной тлей . (А) Нимфа четвертого возраста. (Б) Взрослый. Голени задних ног нимфы четвертого возраста беловатые (отмечены красной стрелкой). Вновь появившаяся тля удалялась мелким верблюжьим кустарником во время тестов на вирулентность. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Тепловая карта смертности 13 изолятов EPF против горчичной тли методом отрывных листьев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Наблюдение грибкового микоза 13 изолятов EPF. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Скорректированная смертность грибковых изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение (SD). Смертность от Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 в один и тот же момент времени с одинаковой концентрацией прививки сравнивали с помощью независимого t-критерия, и смертность, отмеченная звездочкой, достоверно отличалась (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Изоляты EPF, использованные в данном исследовании.

Таблица 2: Пары праймеров, используемые для молекулярной идентификации горчичной тли.

Таблица 3: Скорректированные показатели смертности 13 изолятов EPF против горчичной тли через 5 дней после инокуляции.

Таблица 4: Значения LT50 грибных изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли при различных концентрациях конидий. *Количество наблюдаемых насекомых. Значения †LT50 , отмеченные разными буквами, считались существенно отличающимися, поскольку их 95% доверительные границы не перекрывались. ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степеней свободы.

Таблица 5: Значения LC50 грибных изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли. *Количество наблюдаемых насекомых. Значения †LC50 , отмеченные разными буквами, считались достоверно отличающимися, так как их 95% доверительные границы не перекрывались. ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степеней свободы.

Авторы заявляют, что в данной работе отсутствует конфликт интересов.