Электрическое зондирование ячейки-подложки для оценки токсикологических профилей металлоорганического каркаса в режиме реального времени

Металлоорганические каркасы (МОФ) представляют собой гибриды, образующиеся в результате комбинации ионов металлов и органических линкеров ^1,2 в органических растворителях. Благодаря разнообразию таких комбинаций MOF обладают структурным разнообразием³, настраиваемой пористостью, высокой термической стабильностью и большой площадью поверхности ^4,5. Такие характеристики делают их привлекательными кандидатами в различных областях применения, от хранения газов^6,7 до катализа^8,9 и от контрастных веществ 10,11 до устройств доставки лекарств ^12,13. Тем не менее, внедрение MOF в такие приложения вызвало опасения по поводу их безопасности как для пользователей, так и для окружающей среды. Предварительные исследования показали, например, что клеточная функция и рост изменяются при воздействии на клетки ионов металлов или линкеров, используемых для синтеза MOF 1,14,15. Например, Tamames-Tabar et al. продемонстрировали, что ZIF-8 MOF, MOF на основе Zn, приводит к большему количеству клеточных изменений в клеточной линии рака шейки матки человека (HeLa) и клеточной линии макрофагов мыши (J774) по сравнению с MOFs на основе Zr и Fe. Такие эффекты, по-видимому, были обусловлены металлическим компонентом ZIF-8 (т.е. Zn), который потенциально мог индуцировать апоптоз клеток при распаде каркаса и высвобождении иона Zn¹. Аналогичным образом, Gandara-Loe et al. продемонстрировали, что HKUST-1, MOF на основе Cu, вызывает наибольшее снижение жизнеспособности клеток ретинобластомы мышей при использовании в концентрациях 10 мкг/мл или выше. По-видимому, это было связано с ионом металла Cu, включенным во время синтеза этого каркаса, который, будучи высвобожденным, мог индуцировать окислительный стресс в подвергшихся воздействию клетках¹⁵.

Более того, анализ показал, что воздействие MOFs с различными физико-химическими характеристиками может приводить к различным реакциям облученных клеток. Например, Wagner et al. продемонстрировали, что ZIF-8 и MIL-160 (каркас на основе Al), используемые при экспонировании иммортализированной эпителиальной клетки бронхов человека, приводят к клеточным реакциям, зависящим от физико-химических свойств каркасов, а именно гидрофобности, размера и структурных характеристик¹⁶. Кроме того, Chen et al. продемонстрировали, что концентрация 160 мкг/мл MIL-100(Fe) при воздействии на нормальные клетки печени человека (HL-7702) вызывает наибольшую потерю клеточной жизнеспособности, предположительно из-за металлического компонента этого специфического каркаса (т.е. Fe¹⁷).

Несмотря на то, что эти исследования классифицируют вредное воздействие MOFs на клеточные системы на основе их физико-химических характеристик и концентраций воздействия, что вызывает потенциальные опасения по поводу внедрения рамок, особенно в биомедицинских областях, большинство этих оценок основаны на колориметрическом анализе в одной временной точке. Например, было показано, что при использовании анализов (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) и водорастворимой соли тетразолия (WST-1) эти биохимические реагенты могут приводить к ложноположительным результатам при их взаимодействии с частицами, которым клетки также подвергались¹⁸. Показано, что соль тетразолия и нейтральные красные реагенты обладают высоким адсорбционным или связывающим сродством к поверхности частиц, что приводит к интерференции сигнала агента¹⁹. Более того, для других типов анализов, таких как проточная цитометрия, которая, как было показано ранее, используется для оценки изменений в клетках, подвергшихся воздействию^{MOFs 20,21}, было показано^, что основные проблемы должны быть обойдены, если мы хотим рассмотреть жизнеспособный анализ вредного воздействия частиц. В частности, необходимо учитывать диапазоны обнаружения размеров частиц, особенно в смешанных популяциях, таких как те, которые предлагаются MOFs или эталонами частиц, используемых для калибровки до клеточных^{изменений22}. Также было показано, что краситель, используемый во время мечения клеток для таких цитометрических анализов, может также взаимодействовать с наночастицами, воздействию которых подвергались^{клетки.}

Цель этого исследования состояла в том, чтобы использовать высокопроизводительный оценочный анализ в режиме реального времени для оценки изменений в поведении клеток при воздействии выбранного MOF. Оценки в режиме реального времени могут помочь получить представление об эффектах, зависящих от времени, связанных с окнами экспозиций¹⁶. Кроме того, они предоставляют информацию об изменениях в межклеточно-субстратных взаимодействиях, морфологии клеток и межклеточных взаимодействиях, а также о том, как такие изменения зависят от физико-химических свойств интересующих материалов и времени экспозиции^24,25 соответственно.

Для демонстрации валидности и применимости предложенного подхода использовали клетки бронхиального эпителия человека (BEAS-2B), ZIF-8 (гидрофобный каркас цеолитового имидазолата¹⁶) и зондирование импеданса электрических клеток-субстратов (ECIS). Клетки BEAS-2B представляют собой модель воздействия на легкие 26 и ранее использовались для оценки изменений при воздействии на клетки наноглин и их термически разлагаемых побочных продуктов^26,27,28, а также для оценки токсичности наноматериалов^, таких как одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ)¹⁸. Кроме того, такие клетки используются уже более 30 лет в качестве модели функции легочного эпителия²⁹. ZIF-8 был выбран из-за его широкого применения в катализе³⁰ и в качестве контрастных агентов³¹ для биовизуализации и доставки лекарств³² и, таким образом, из-за расширенного потенциала воздействия на легкие во время таких применений. Наконец, ECIS, неинвазивный метод в режиме реального времени, ранее использовался для оценки изменений в адгезии, пролиферации, подвижности и морфологии клеток в результате различных взаимодействий между аналитами (как материалами, так и лекарственными препаратами) и подвергшимися воздействию клетками^в режиме реального времени^16,18,28. ECIS использует переменный ток (AC) для измерения импеданса ячеек, иммобилизованных на золотых электродах, при этом изменения импеданса дают представление об изменениях сопротивления и емкости на границе раздела клетка-золотая подложка, барьерной функции, индуцированной межклеточными взаимодействиями, и покрытии таких золотых электродов надклеточным слоем^33,34. Использование ECIS позволяет проводить количественные измерения с наноразмерным разрешением неинвазивным способом в режиме реального времени^26,34.

В этом исследовании оценивается и сравнивается простота и легкость оценки индуцированных MOF изменений в клеточном поведении в режиме реального времени с одноточечными оценками анализа. Такое исследование может быть экстраполировано для оценки клеточных профилей в ответ на воздействие других частиц, представляющих интерес, что позволит провести безопасное тестирование частиц и последующее помощь в реализации. Кроме того, это исследование может дополнить генетические и клеточные анализы, которые представляют собой одноточечную оценку. Это может привести к более обоснованному анализу вредного воздействия частиц на клеточную популяцию и может быть использовано для скрининга токсичности таких частиц высокопроизводительным способом^16,35,36.

1. Синтез ЗИФ-8

1. Для целей этого примера используйте массовое соотношение 1:10:100 (металл:линкер:растворитель) для синтеза ZIF-8. Для этого отмерьте гексагидрат нитрата цинка и запишите измерение. Используйте пример соотношения масс, чтобы рассчитать количество, необходимое для линкера, 2-метилимидазола и растворителя (т. е. метанола).
2. Поместите гексагидрат нитрата цинка и линкер в две разные стеклянные пробирки. Добавьте половину рассчитанного количества метанола к гексагидрату нитрата цинка, а другую половину — к линкеру. Дайте каждому раствору раствориться.
3. Комбинируйте два раствора (т.е. растворы, содержащие металл и линкер соответственно). Поместите емкость с комбинированным раствором для реакции на перемешивающую пластину и перемешивайте при 700 об/мин в течение 24 ч при комнатной температуре (RT).

2. Коллекция ЗИФ-8

1. После завершения вышеуказанной реакции (т. е. через 24 ч) поместите раствор в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 3,075 x g в течение 5 мин (используйте равные количества и сбалансируйте ротор). Удалите все надосадочные жидкости из центрифугированных пробирок.
2. Добавьте метанол (5-15 мл) в центрифужные пробирки и повторно диспергируйте частицы.
3. Повторите этапы центрифугирования и промывки еще не менее двух-четырех раз. После последней стирки выпустите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах промывки удаляются все неосажденные частицы.
4. Снимите крышки тюбиков и наклейте сверху парапленочную ленту; Впоследствии проделайте отверстия в парапленке. Поместите пробирку (пробирки) с образцом в вакуумную камеру при RT для высыхания в течение 24 часов.

3. Морфология поверхности ZIF-8 (сканирующая электронная микроскопия [SEM])

1. Сухие порошки ЗИФ-8 устанавливают на углеродную ленту и распыляют в течение 120 с золото-палладием, чтобы предотвратить любое зарядение, которое может произойти во время СЭМ-анализа.
2. Установите ускоряющее напряжение микроскопа на 15 кВ. Сфокусируйте частицы и отрегулируйте увеличение (использовались увеличения 500x, 1 000x, 1 500x, 4 000x, 10 000x, 20 000x, 30 000x и 40 000x).
3. Изображение частиц под увеличением, которое позволяет четко оценить размер частиц и морфологию (рекомендуется учитывать диапазоны для частиц 5 мкм, 10 мкм и 20 мкм).
4. Соберите данные по крайней мере из трех различных полей зрения и рассмотрите для каждого из них разное увеличение.

4. Элементный состав ЗИФ-8

1. Следуйте инструкциям для получения СЭМ-изображений.
2. С помощью энергодисперсионного рентгеновского спектроскопии (EDX) микроскопа СЭМ проводят анализ элементного состава образца.
3. Убедитесь, что ускоряющее напряжение и увеличение SEM соответствуют монитору EDX. Выключите инфракрасную камеру на СЭМ-микроскопе.
4. На мониторе EDX перейдите в раздел Collect Spectrum (Сбор спектра ) и введите время сбора 200 с. Это рекомендуется для того, чтобы избежать заряда частиц и распада, которые могут привести к ложным оценкам.
5. Собирайте данные как минимум из трех разных полей зрения. После завершения сбора проанализируйте данные и определите интересующие элементы.

5. Клеточная культура

1. Культура иммортализировала клетки BEAS-2B в среде, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 0,2% пенициллином/стрептомицином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пассажи между 5-10 следует использовать для того, чтобы убедиться в том, что в используемой партии клеток ранее не происходило фенотипических изменений³⁷ (все реагенты перечислены в таблице материалов).
2. Возьмите планшет для клеточной культуры диаметром 100 мм и поместите на него 10 мл среды. Добавьте в планшет 1 мл клеточного раствора BEAS-2B.
3. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%_CO2) и дайте клеткам расти.
4. Проверьте пластину через 24 часа, чтобы определить, достигли ли ячейки 80% слияния. При этом 80%-ное слияние относится к проценту поверхности, покрытой слипшимися клетками. Если нет, смените среду и дайте клеткам расти до тех пор, пока не будет достигнут уровень слияния 80%.

6. Подсчет клеток

1. После того, как ячейки на пластине достигнут слияния 80%, удалите фильтрующий материал из пластины. Вымойте планшет 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
2. Снимите PBS с пластины. Добавьте 2 мл трипсина в планшет и поместите его в инкубатор (37 °C, 5% CO 2) на₂ минуты.
3. Добавьте 2 мл среды в планшет и протрите его вверх и вниз, чтобы удалить ячейки с планшета. Перелейте раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 123 x g в течение 5 минут.
4. Извлеките надосадочную жидкость из пробирки и добавьте 2 мл среды. Пропитывайте фильтрующий материал вверх и вниз, чтобы повторно диспергировать клетки.
5. Используя пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 20 мкл трипанового синего, а затем 20 мкл клеточного раствора (соотношение трипанового синего к клеточному раствору 1:1).
6. Поместите 10 мкл клеточной смеси на предметное стекло и поместите его на автоматический счетчик клеток. Подождите, пока экран не станет в фокусе, затем выберите Съемка.
7. На экране отображаются номера ячеек в реальном времени и их жизнеспособность. Диапазон измерений простирается от 1 x 10^4-1 x 10^{до 7} ячеек.
8. В качестве альтернативы можно подсчитать количество клеток вручную с помощью гемоцитометра.
   1. Для этого добавьте в гемоцитометр 15-20 мкл клеточного раствора, обработанного трипановым синим.
   2. Используйте вертикальный микроскоп с 10-кратной фокусировкой объектива на линиях сетки гемоцитометра.
   3. Подсчитайте количество клеток в четырех крайних квадратах и разделите число на четыре. Затем умножьте на 10 000, чтобы получить число живых клеток.
   4. Чтобы рассчитать жизнеспособность клеток, сложите количество живых и мертвых клеток, чтобы получить общее количество клеток, а затем разделите количество живых клеток на общее количество клеток.

7. Приготовление дозы ЗИФ-8

1. Приготовьте исходный раствор ЗИФ-8 в концентрации 1 мг/мл. Для этого измерьте количество ZIF-8 и добавьте деионизированную (DI) воду к частицам до достижения концентрации 1 мг/мл.
2. Прокачайте (установите ультразвуковой прибор в положение sonics) исходный раствор ZIF-8 в течение 2 мин с интервалом 30 с на водяной бане.
3. Приготовьте различные дозы ZIF-8 для клеточного воздействия, рассчитав количество исходного раствора и модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко, необходимой для достижения желаемых доз, используя уравнениеC 1 V₁ = C 2 V₂. Дозы будут варьироваться от 0 до 950 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте были выбраны дозы 0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл, 750 мкг/мл и 950 мкг/мл.

8. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC ₅₀)

1. После подсчета клеток засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 10⁴ кл/мл в 96-луночный планшет объемом 100 мкл/лунку.
   1. Для достижения плотности 4 x 10⁴ клеток/мл используйте C 1 V₁= C 2 V₂для расчета количества клеточного раствора, необходимого для соединения со средой.
   2. Следите за тем, чтобы для каждой дозы оставались пустые лунки; оставить эти скважины пустыми до экспозиции ЗИФ-8.
2. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 и дайте клеткам вырасти до сливающегося монослоя в течение 24 часов.
3. Извлеките среду из лунок и подвергните клетки BEAS-2B дозам ZIF-8 в диапазоне от 0 до 950 мкг/мл. Добавьте 100 мкл ZIF-8 в соответствующие лунки для заготовок и ячеек.
4. Поместите 96-луночные планшеты обратно в инкубатор на выдержку 48 часов.
5. После выдержки добавляют 10 мкл 4-[3-(4-идофенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]-1,3-бензолдисульфоната (WST-1) в каждую лунку (пустые и ячеечные) и инкубируют в течение 2 ч. Среда остается в колодцах; Соотношение 1:10 (реагент:среда).
6. Считывание изменений поглощения на пластинчатом ридере с длиной волны 485 нм.
7. Рассчитайте жизнеспособность ячейки с помощью программного обеспечения для определения значения IC 50 (см. раздел₁₀ ).

9. Измерение импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS)

1. Используйте 96-луночный планшет (96W10idf) для выполнения ECIS-анализа. Пластина²⁸ содержит межпальцевые соединительные электроды площадью около 4^мм2.
2. Во-первых, убедитесь, что все скважины считываются датчиками. Для этого поместите 96-луночную пластину на скважинную станцию и нажмите кнопку Setup .
3. Если скважины подключены правильно, появится зеленый цвет; Все неподключенные скважины будут выделены красным цветом. Если возникнет такой случай, снимите и снова вставьте луночную пластину и снова нажимайте кнопку «Настройка» до тех пор, пока все скважины не будут показывать приемлемые « зеленые» показания.
4. Стабилизируйте электроды в течение 40 минут с 200 мкл среды на лунку, чтобы предотвратить дрейф потенциала. Добавьте 200 мкл среды в каждую используемую лунку, а затем поместите 96-луночную пластину на станцию ECIS. Нажмите « Настройка/Проверка », чтобы убедиться, что пластина правильно подключена. Нажмите « Стабилизировать».
5. После завершения стабилизации снимите пластину со станции и удалите среду из каждой лунки.
6. Засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 10⁴ клетки/мл, объемом 100 мкл на лунку, в лунки, содержащие клетки, и поместите планшет на станцию ECIS в инкубаторе.
7. На мониторе нажмите « Проверить », чтобы определить, что все электроды считываются датчиками на станции.
8. Настройте измерение хода времени, выбрав Multiple Freq/Time (MFT). Программа будет измерять каждую скважину на семи различных частотах.
9. Нажмите кнопку «Пуск» и подождите 24 часа, чтобы клетки могли образовать сливающийся монослой.
10. Через 24 ч лунки, содержащие клетки, будут проявлять повышенное сопротивление на мониторе. Это показатель того, что клетки прикрепились к электродам.
11. Нажмите кнопку Пауза на мониторе, чтобы остановить сбор данных.
12. Установите дозы ZIF-8 на уровне, выше и ниже расчетного значения IC₅₀ , выполнив действия, описанные в разделе 7 выше.
13. Подвергните наночастицы ZIF-8 соответствующим пустым и ячеистым лункам объемом 100 мкл на лунку и поместите 96-луночную пластину обратно на станцию.
14. Нажмите « Проверить » еще раз на мониторе, чтобы убедиться, что датчики считывают показания всех электродов. Нажмите « Возобновить » и дайте системе поработать в течение 72 часов, чтобы отслеживать поведение и привязанность клетки.
15. После завершения сбора данных нажмите « Готово » на мониторе. Чтобы сохранить файл, нажмите «Файл» > «Сохранить как». Сохраните данные в виде файла электронной таблицы.
16. Чтобы получить альфа-параметры, нажмите на Model. Во всплывающем окне нажмите «Колодец только для мультимедиа», затем выберите колодец, в котором есть только мультимедиа.
17. Нажмите на Set Ref. На мониторе нажмите « Найти».
18. Если скважина, показанная в системе, не совпадает с той, что была выбрана, повторите шаг 9.16.
19. Нажмите « Установить». Нажмите на Fit T-Range , чтобы определить диапазон времени, необходимый для сбора данных.
20. Пока он обрабатывается, нажмите на Alpha. Когда система завершит анализ, нажмите « Сохранить RbA » и сохраните его как файл электронной таблицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству ECIS, которое можно найти на веб-сайте производителя³⁸.

10. Анализ данных

1. СЭМ
   1. Откройте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы проанализировать изображения РЭМ. Нажмите кнопку Файл > открыть, а затем выберите изображение для анализа.
   2. Нажмите на Image > Введите > 8 бит, чтобы преобразовать изображение в оттенки серого для выполнения пороговой операции.
   3. Откалибруйте измерение расстояния от пикселей до микрон. Щёлкните по инструменту «Прямая линия » и обведите длину каждой частицы, которую нужно измерить.
   4. Нажмите кнопку «Анализ», а затем «Задать масштаб». Известное расстояние будет установлено равным длине масштабной линейки на изображении SEM. Известная единица длины будет задана в микронах. Установите флажок «Глобальный» и нажмите «ОК».
   5. Нажмите на инструмент « Прямая линия » и обведите диаметр частицы, затем выберите «Анализ и измерение». Запишите результат длины.
   6. Повторите то же самое для всех собранных изображений. Усредните все диаметры, по крайней мере, от 60 частиц для подходящей статистической оценки.
2. ЭДХ
   1. Усредните все весовые проценты каждого элемента вместе со всеми собранными изображениями (см. раздел EDX выше).
   2. С помощью электронной таблицы постройте гистограмму каждого элемента по оси X и их средний процентный вес элемента по оси y.
3. ИК₅₀
   1. Усредните пустые лунки и усредните дозовые лунки для каждой репликации.
   2. Рассчитайте скорректированную пустоту, вычитая контрольное пустое среднее значение из среднего значения пустой дозы. Рассчитайте истинное значение ячейки для каждой дозы, вычитая скорректированную пустоту из среднего значения дозы.
   3. Вычтите скорректированное пустое значение для каждой дозы из среднего контрольного значения. Рассчитайте жизнеспособность клеток каждой дозы, используя уравнение: жизнеспособность клеток = (истинное значение клеток/(контрольное значение - скорректированное пустое значение)) x 100.
   4. Повторите это для всех остальных репликаций.
   5. Усредните жизнеспособность клеток для каждой репликации, чтобы получить окончательную жизнеспособность клеток для каждой дозы.
   6. В программном обеспечении выберите вкладку XY на экране.
   7. Введите значения концентрации (дозы) в столбец X и жизнеспособность клеток (%) от каждой дозы в столбец Y.
   8. Преобразуйте значения X , нажав кнопку Анализ > Преобразовать > ОК и Преобразовать X = Log(X)).
   9. Нормализуйте значения Y, выбрав лист « Преобразованные данные », щелкнув « Анализ», а затем выбрав «Нормализовать».
   10. Выберите таблицу данных Normalize of Transform (Нормализация преобразования ), щелкните Analyze ( Analyze) и выберите Nonlinear Regression (Curve Fit)). Выберите Dose-Response-Inhibition (Доза-реакция-ингибирование ) и нажмите Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (четыре параметра)). Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.
4. ECIS
   1. Возьмите из электронной таблицы столбцы сопротивления (Ом) для каждой репликации (пустые лунки и дозовые лунки) и усредните их вместе с частотой 4 000 Гц. Эта частота позволяет оценить межклеточный контакт³⁸.
   2. Рассчитайте скорректированное сопротивление, вычитая усредненный бланк из усредненной дозы для каждого повтора. Усредните скорректированную резистентность для репликаторов для каждой дозы.
   3. Повторите те же шаги для альфа-значений, чтобы вычислить средний альфа-параметр. Постройте график по оси X как время (h), а по оси Y — как средние значения сопротивления/альфа для каждого значения дозы.

11. Статистический анализ

1. СЭМ
   1. Выполните стандартное отклонение в файле электронной таблицы, где были рассчитаны средние диаметры частиц ZIF-8.
   2. Используя функцию STDEV в электронной таблице, выделите данные 60 частиц и нажмите Enter. Постройте график стандартного отклонения для каждого вычисленного среднего диаметра.
2. ЭДХ
   1. Аналогично SEM (шаги 11.1.1-11.1.2), рассчитайте стандартное отклонение для каждого среднего элементного состава с помощью функции СТАНДОТКЛОН в электронной таблице. Постройте график стандартных отклонений для каждого среднего элементного состава.
3. ИК₅₀
   1. Откройте программное обеспечение, используемое для расчета IC₅₀ , и нажмите « Сгруппированный технический паспорт».
   2. Введите дозы ZIF-8 в строки, помеченные как Группа А, Группа В и т. д. Введите среднюю жизнеспособность клеток для каждой дозы и реплицируйте в столбце, соответствующем дозе ZIF-8.
   3. Нажмите « Анализ» и в разделе «Анализ столбцов» выберите «Односторонний ANOVA (а также непараметрический или смешанный)».
   4. На вкладке «Экспериментальный дизайн» выберите «Без сопоставления» или «Сопряжение». В разделе Gaussian Distribution Of Residuals (Распределение невязок по Гауссу) выберите Yes use ANOVA. Наконец, выберите «Да использовать обычный тест ANOVA» в разделе «Предполагать равные SD».
   5. На вкладке « Множественные сравнения» выберите «Сравнить среднее значение каждого столбца со средним значением контрольного столбца». Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.

Используя обычную in vitro модельную клеточную линию39 (BEAS-2B), это исследование было направлено на то, чтобы продемонстрировать осуществимость и применимость ECIS для оценки изменений в поведении клеток при воздействии лабораторно синтезированного MOF. Оценка этих изменений была дополнена анализом с помощью традиционных колориметрических анализов.

Сначала были оценены физико-химические характеристики системы для обеспечения воспроизводимости используемых методов, валидности полученных результатов и соответствующего обсуждения этих результатов. Например, анализ морфологии поверхности ZIF-8 проводился с помощью СЭМ; Изображения показали, что каркасы имеют морфологию ромбического додекаэдра40 и средний размер 62,87 нм ± 9,61 нм (рис. 1A). Элементный состав МОФ определяли методомEDX-спектроскопии. Результаты показали, что основной состав ZIF-8 состоит из C, N и Zn (т.е. состава имидазолатного линкера и иона металла, Zn16) (рис. 1B). Предыдущая рентгеновская дифракция показала, что кристаллические фазы ZIF-8 идентифицировали специфические пики на 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° и 18°, причем такие пики были отнесены к плоскостям (002), (112), (022), (013) и (222) соответственно 16,41.

Для предлагаемого скрининга поведения клеток определяли IC 50 (концентрация, в которой ZIF-8 ингибирует рост клеток на50 %)29. Для этого клетки подвергали воздействию ZIF-8 в течение 48 ч в дозах от 0 до 950 мкг/мл (рис. 2A). График «доза-реакция» облученных клеток показан на рисунке 2B, с последующим зарегистрированным IC50 35,7 мкг/мл. Кроме того, анализ выявил дозозависимую тенденцию жизнеспособности клеток при воздействии ZIF-8.

После определения IC50 был проведен ECIS-анализ. Вкратце, ECIS использовался в качестве стратегии скрининга в реальном времени BEAS-2B, подвергшегося воздействию ZIF-8 MOFs в IC50, а также ниже и выше этой концентрации, а именно 15,7 мкг/мл (C1), 35,7 мкг/мл (C2), 55,7 мкг/мл (C3) и 75,7 мкг/мл (C4) соответственно, при этом клетки подвергались воздействию в течение общего периода 72 ч. Предполагалось, что включение ECIS позволит в режиме реального времени определять изменения в покрытии клеток, морфологии и жизнеспособности. Результаты ECIS регистрировались в виде изменений резистентности и изменений в межклеточно-субстратных взаимодействиях, а именно альфа-параметра42.

Тренды резистентности показаны на рисунке 3А в виде изменений профилей клеток, обработанных ZIF-8, по сравнению с контрольной группой (черная линия) (т.е. неэкспонированных клеток). В частности, анализ показал, что лунки, содержащие клетки на золотых электродах, подвергшихся воздействию доз С2-С4, показали первоначальное небольшое увеличение сопротивления сразу после воздействия клеток на каркасы (все относительно контрольных [т.е. необлученных клеток]). За этими первоначальными изменениями впоследствии последовало резкое снижение зарегистрированных резистенций, причем такое снижение преобладало в период между 6-8 часами после воздействия (рис. 3А). Полная потеря резистентности наблюдалась через 14-18 ч от времени экспозиции. Ячейки, подвергшиеся воздействию доз ниже значения IC50 , демонстрировали сопротивления, как и лунки с контрольными ячейками, примерно до 16-18 ч после воздействия, когда появляются потери сопротивления. Также при клеточном воздействии наблюдалось непрерывное возмущение сигнала скважин, используемых в экспериментах. Эти пертурнаменты сохранялись при анализе альфа-параметра (рис. 3B), и этот анализ также показал, что облученные клетки изменяют свои клеточно-субстратные взаимодействия с профилями, аналогичными резистентным. Более того, такие изменения зависели от времени воздействия и дозы, использованной при таком воздействии.

Рисунок 1: Изображение РЭМ и средний элементный состав частиц ZIF-8. (A) Репрезентативное изображение частиц ZIF-8. (B) Средний элементный состав частиц ZIF-8 (± столбцов стандартного отклонения [SD]). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Жизнеспособность клеток. (A) Схема клеточной обработки (создана с помощью Biorender.com). (B) жизнеспособность клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию частиц ZIF-8 в дозах от 0 до 950 мкг/мл; этот анализ был использован для определения IC50 (± SD баров; ***p = 0,0001 и **** p < 0,0001 относительно контроля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативная клеточная резистентность и изменения клеточного прикрепления. (A) Репрезентативная клеточная резистентность клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию частиц ZIF-8 ниже, при и выше концентрации IC50. (B) Изменения клеточного прикрепления (т.е. изменения альфа-параметра) клеток BEAS-2B при воздействии частиц ZIF-8 ниже и выше концентрации IC50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.