Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций

Повреждение геномной ДНК происходит из-за спонтанного распада, внутренних повреждений и факторов окружающей среды¹. Образующиеся повреждения ДНК включают поврежденные основания, несоответствия, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы, меж- и внутрицепочечные сшивки, а также ДНК-белковые сшивания (ДПК). DPC образуется, когда связанный с хроматином белок захватывается на ДНК посредством ковалентного сцепления. ДПК индуцируются эндогенными повреждениями ДНК и реактивными метаболитами, а также экзогенными агентами, такими как химиотерапевтические препараты и бифункциональные сшивающие агенты. При определенных обстоятельствах ферментная дисфункция также может привести к образованию^ЦОД2. Огромная разница в индукторах DPC приводит к различию в идентичности ковалентно-связанного белка, области хромосомы, где образуется DPC, типе структуры ДНК, сшитой с белком, и химических свойствах ковалентной связи между белком и ДНК ^2,3,4.

В зависимости от их химической природы ЦОД обычно подразделяются на две группы: ферментативные ДПК и неферментативные ДПК. Некоторые ферменты, такие как топоизомеразы, гликозилазы и метил/ацилтрансферазы, действуют, образуя обратимые ковалентные промежуточные продукты фермент-ДНК во время их нормальных каталитических реакций. Они являются короткоживущими промежуточными продуктами фермент-ДНК и могут быть преобразованы в долгоживущие ферментативные ДПК при их захвате эндогенными или экзогенными агентами, в частности химиотерапевтическими препаратами³. Топоизомеразные ДПК являются одними из наиболее частых ферментативных ДПК в эукариотических клетках, которые могут быть продуцированы клинически полезными ингибиторами топоизомеразы (топотекан и иринотекан для топоизомеразы I [TOP1] и этопозид и доксорубицин для топоизомеразы II [TOP2]) и являются первичными терапевтическими механизмами этих ингибиторов ^5,6. ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ) 1, 3А и 3В являются мишенью 5-аза-2'-дезоксицитидина (также известного как децитабин) и образуют ДПК при воздействии препарата⁷. Реактивные агенты, а также ультрафиолетовое излучение и ионизирующее излучение индуцируют неферментативные ДПК, неспецифически сшивая белки с ДНК. Реактивные альдегиды, такие как ацетальдегид и формальдегид (ЖК), часто образуются как побочные продукты клеточного метаболизма, среди которых ЖК образуются в микромолярных концентрациях во время метаболизма метанола, перекисного окисления липидов и деметилирования гистонов. Кроме того, FA является химическим веществом для производства в больших объемах, производимым во всем мире, воздействию которого подвергаются многие люди как в экологическом^{, так} и в профессиональном ^плане.

Как ферментативные, так и неферментативные DPC очень токсичны для клеток, поскольку их громоздкие белковые компоненты эффективно препятствуют почти всем процессам, связанным с хроматином, включая репликацию и транскрипцию, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу, если их не восстановить. За последние два десятилетия репарация ЦОД была интенсивно изучена, и несколько белков/путей были идентифицированы как ключевые факторы, которые либо непосредственно восстанавливают ЦОД, либо модулируют процессы их репарации. Например, было хорошо установлено, что протеолиз белковой массы DPC является ключевым этапом репарации DPC, и что протеолиз может быть катализирован протеазами SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 или^26S протеасомным комплексом 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 в зависимости от типа клетки или клеточного контекста. Идентификация и характеристика этих протеаз в значительной степени опирались на комплекс in vivo ферментного анализа (ICE)^28,29 и быстрый подход к восстановлению аддукта ДНК (RADAR)^30,31, оба из которых выделяют молекулы ДНК и их ковалентно-связанные белки из свободных клеточных белков, что позволяет обнаруживать DPC с помощью щелевой блотины с использованием антител^, нацеленных на сшитые белки. Кроме того, в качестве средства обнаружения и количественного определения ДПК на уровне^{одной клетки 32} был использован метод иммуноокрашивания агарозной ДНК (ТАРДИС). В настоящее время исследователи выбирают анализ RADAR вместо анализа ICE для измерения DPC, поскольку анализ ICE основан на очистке нуклеиновых кислот с помощью градиентного ультрацентрифугирования хлорида цезия, что чрезвычайно трудоемко, в то время как анализ RADAR осаждает нуклеиновые кислоты с использованием этанола в течение гораздо более короткого периода времени.

В последние годы появляется все больше доказательств того, что множественные посттрансляционные модификации (ПТМ) участвуют в передаче сигналов и рекрутировании DPC-таргетированных протеаз 3,33,34,35. Например, было обнаружено, что TOP1- и TOP2-DPC конъюгируются малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO)-2/3, а затем SUMO-1 лигазой SUMO E3 PIAS4, независимо от репликации и транскрипции ДНК. Последовательные модификации SUMO, по-видимому, являются мишенью убиквитина, который депонируется в SUMOylated TOP-DPC и образует полимерные цепи через свой остаток лизина 48 с помощью убиквитин-лигазы, нацеленной на SUMO, называемой RNF4. Впоследствии полимер убиквитина вызывает сигнал и рекрутирует протеасому 26S в TOP-DPC^23,36. Недавно было показано, что один и тот же путь SUMO-убиквитин действует на DNMT1-DPC, а также на комплексы PARP-ДНК для их репарации^37,38. Кроме того, сообщалось, что SUMO-независимое убиквитилирование убиквитин-E3-лигазой TRAIP подготавливает ДПК к протеасомальной деградации репликационно-связанным образом³⁹. Подобно протеасомальной деградации TOP-DPC, протеолиз ферментативных и неферментативных DPC с помощью репликационно-связанного металлопротеазного SPRTN также требует убиквитилирования субстратов DPC в качестве механизма вовлечения SPRTN^40,41. Разграничение роли SUMOylation и убиквитилирования требует обнаружения DPC, помеченных этими PTM. Поскольку исходный анализ ICE и анализ RADAR полагаются на аппарат slot-blot/dot-blot для измерения непереваренных образцов ДНК, ни один из этих двух анализов не может разрешить и визуализировать PTM-сопряженные виды DPC с разной молекулярной массой. Чтобы решить эту проблему, мы расщепляли образцы ДНК после их очистки путем осаждения этанола и нормализации образца микрококковой нуклеазой, эндоэкзонуклеазой ДНК и РНК для высвобождения сшитых белков, что позволило нам разрешать белки, а также их ковалентные ПТМ с помощью электрофореза в додецилсульфатном полиакриламидном геле натрия (SDS-PAGE). Электрофорез позволил обнаружить и количественно определить ПТМ-конъюгированные ДПК с использованием специфических антител, нацеленных на ПТМ. Первоначально мы назвали этот усовершенствованный метод анализом DUST, чтобы подчеркнуть его надежность в обнаружении убиквитилированных и SUMOylated TOP-DPC²³. Позже мы расширили использование анализа для количественной оценки АДФ-рибозилирования TOP1-DPC in vivo, используя антитела против полимеров поли-АДФ-рибозы²⁰.

Здесь представлен подробный протокол для анализа, который обнаруживает и измеряет убиквитилированные, SUMOylированные и АДФ-рибозилированные DPC, который был оптимизирован для модифицированных TOP-DPC, индуцируемых их ингибиторами, и неспецифических/неферментативных DPC, индуцированных FA. Этот анализ изолирует PTM-конъюгированные DPC путем лизиза клеток хаотропным агентом, осаждения ДНК этанолом и высвобождения сшитых белков и их модификаторов с помощью микрококковой нуклеазы. Белки, связанные с ДНК, и их ПТМ количественно определяют методом иммуноблоттинга с использованием специфических антител. Этот анализ открывает новые возможности для выяснения молекулярных механизмов, с помощью которых клетка восстанавливает как ферментативные, так и неферментативные ДПК. В частности, он позволяет детально изучить индукцию и кинетику ПТМ, важных для регуляции деградации и репарации TOP-DPC, и, таким образом, позволяет открыть новые факторы, такие как Е3-лигазы, диктующие ПТМ, а также ингибиторы, нацеленные на эти факторы. Поскольку некоторые из PTM, ответственных за репарацию TOP-DPC, вероятно, участвуют в репарации DPC, индуцированных другими химиотерапевтическими препаратами, такими как препараты на основе платины²², этот анализ также имеет потенциал для применения для открытия новых лекарств и рациональной оптимизации комбинаторной терапии ингибиторами топоизомеразы или противоопухолевыми препаратами на основе платины в клетках пациента для определения схем лечения.

1. Клеточная культура и медикаментозная обработка в клеточной линии эмбриональной почки человека 293 (HEK293)

1. Приготовьте питательную среду, модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% L-глутамином 2 мМ и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина.
2. Посев 1 x 10 6 клеток в 60-миллиметровую пластину или 6-луночную пластину для каждого условия обработки плюс контроль.
3. На следующий день обработайте клетки индукторами DPC по выбору.
   1. Чтобы индуцировать TOP1-DPC и их убиквитилирование и SUMOylation, добавляют к клеткам ингибитор TOP1 камптотецин в дозе 20 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
   2. Чтобы индуцировать TOP2α и β-DPCs, а также их убиквитилирование и SUMOylation, подвергают клетки добавлению этопозида ингибитора TOP2 при 200 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
   3. Для индуцирования неферментативных ДПК и их убиквитилирования и SUMOylation добавляют ФА в дозе 1 мМ и собирают клетки через 2 ч после экспозиции.
   4. Чтобы индуцировать PARylation TOP1-DPC, предварительно обрабатывают клетки в течение 1 ч для блокировки деPARylation ингибитором поли(АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) PDD00017273 при 10 мкМ с последующей совместной обработкой 20 мкМ камптотецином в течение 20, 60 и 180 мин.

2. Выделение и нормализация ДНК, содержащей сшитые белки

1. После обработки быстро аспирируйте среду с помощью всасывающей пипетки и промойте клетки ледяным 1-кратным фосфатным буфером (PBS). Немедленно лизируйте клетки в 600 мкл реагента ДНКзол, содержащего 1x ингибитор коктейля протеазы, 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 20 мМ N-этилмалеимид (ингибитор деСУМОилирующих и деубиквитилирующих ферментов).
2. Медленно перемешивайте пластину на вибрационной платформе в течение 10 минут при температуре 4 °C.
3. Добавьте 1/2 объема 100% холодного этанола (0,3 мл) непосредственно в планшет и повторяйте шаг 2.2 до тех пор, пока не станет виден непрозрачный агрегат нуклеиновых кислот. Переложите клеточный лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и подвергните пробирку центрифугированию с максимальной скоростью (20 000 x g) в течение 15 минут при 4 °C для осаждения нуклеиновой кислоты и ее сшитых белков.
4. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью всасывающей пипетки и промывают гранулы нуклеиновых кислот в 1 мл 75% этанола с последующим центрифугированием в течение 2 минут по 20 000 x g при 4 °C.
5. Отсасывайте надосадочную жидкость, откручивайте с той же скоростью и удаляйте оставшуюся жидкость с помощью пипетки P20. Высушите гранулу на воздухе в течение 5 минут.
6. Быстро растворите гранулу нуклеиновой кислоты в 0,1 мл ddH₂O. Повторно суспендируйте гранулу путем повторного пипетирования, затем инкубируйте на водяной бане с температурой 37 °C, пока гранула не набухнет, по крайней мере, в три раза больше (примерно 30 минут).
7. Продуцируйте образцы ультразвуковым процессорным зондом с амплитудой 30% в течение 10 с до полного растворения гранулы.
8. Необязательный этап: Обработать образцы смесью РНКазы А/Т1 (10 мкг РНКазы А и 25 ЕД РНКазы Т1) и инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Добавьте в пробирку 1/10 объема 3 М ацетата натрия и два объема ледяного 100% этанола с последующим центрифугированием при 20 000 x g в течение 10 мин для извлечения ДНК. Удалите надосадочную жидкость и растворите осажденную ДНК в 0,1 мл ddH₂O.
9. Дополнительный этап: центрифугируют образец в течение 5 мин при 20 000 x g и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку.
10. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью спектрометра в ультрафиолетовом диапазоне (UV-Vis). Типичный выход ДНК составляет около 600-800 нг/мкл. Соотношение А260/А280 должно быть снижено с 2,0-2,1 до 1,8-1,9 после удаления РНК.
11. Доведите концентрацию ДНК до 400-500 нг/мкл в 0,12 мл ddH 2 O. Перенесите 20 мкл образца в новую микроцентрифужную пробирку в качестве контроля загрузки непереваренной ДНК (см. шаг_2.4).
12. Чтобы расщепить ДНК, растворенную в оставшихся 100 мкл ddH₂O, добавьте в образец 2000 гелевых единиц микрококковой нуклеазы вместе с 1/10 объема (~11 мкл) 10-кратного реакционного буфера для микрококковых нуклеаз кальция. Инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.

3. Вестерн-блоттинг переваренных образцов ДНК

1. Добавьте 4 буфера для образца Laemmli, затем прокипятите образец в течение 5 минут.
2. Загрузите 5-6 мкг расщепленного образца (~15 мкл) на 4%-20% полиакриламидный гель, а затем SDS-PAGE⁴² для разрешения немодифицированных и PTM-конъюгированных DPC.
3. Для обнаружения ЖК-индуцированных неферментативных видов ДПК инкубируйте гель с красителем Coomassie blue в течение ночи при комнатной температуре. Смыть гель ddH 2 O в течение₂ч и получить изображение с помощью системы визуализации.
4. Перенесите гель и инкубируйте мембраны в течение ночи при 4 °C с соответствующими разведениями первичных антител в блокирующем буфере.
   1. Для выявления убиквитилирования проводят разведение антител к убиквитину в соотношении 1:100.
   2. Для обнаружения SUMO-1 или модификации SUMO-2/3 проводят разведение анти-SUMO-1 или антител к SUMO-2/3 в соотношении 1:250.
   3. Для обнаружения АДФ-рибозилирования проводят разведение антител к PAR в соотношении 1:500.
   4. Чтобы обнаружить общие TOP1-, TOP2α- или TOP2β-DPC, сделайте разведение антител к TOP1, анти-TOP2α или анти-TOP2β в соотношении 1:500.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения подробной информации о разведении антител.
5. Инкубируют 1x PBS-T (0,1% tween 20) промытую мембрану со вторичным антителом, разбавленным в 5000 раз в блокирующем буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре.
6. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

4. Щелевое блоттингирование непереваренных образцов ДНК

1. Развести 20 мкл непереваренного образца ДНК в 180 мкл натрий-фосфатного буфера (25 мМ, рН 6,6).
2. Разрежьте нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм) и уравновешивайте в течение 5 мин в натрий-фосфатном буфере.
3. Соберите щелевой блот-аппарат в соответствии с инструкциями производителя и подключите его к вакуумной системе.
4. Промойте лунки натрий-фосфатным буфером, применив вакуум. Убедитесь в отсутствии протечек в колодцах.
5. Остановите вакуум и загрузите 200 мкл ДНК на образец (1 мкг). Заполните пустые лунки 200 мкл натрий-фосфатного буфера.
6. Примените пылесос.
7. Когда все лунки полностью опустеют, остановите вакуум, загрузите 200 мкл натрий-фосфатного буфера в каждую лунку и повторите шаг 4.6.
8. Извлеките мембрану и заблокируйте 5%-ным блокирующим буфером в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
9. Зонд с антителом к двухцепочечной ДНК (дцДНК) в разведении 1:5 000 в течение ночи при 4 °C.
10. Промыть 3 раза с 1 PBS-T и инкубировать с разбавленным вторичным антителом против мышей, связанным с пероксидазой хрена (HRP) в соотношении 1:5.
11. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

5. Денситометрический анализ

1. Используя ImageJ, рассчитайте отношение интенсивности каждой полосы/мазка к интенсивности слота непереваренной ДНК и нормализуйте это соотношение с таковым в клетках без/до медикаментозного лечения.

Репрезентативные результаты, представленные на рисунке 1 , показывают образование и кинетику лекарственно-индуцированных TOP1-DPC, а также их сумоилирование и убиквитилирование. TOP1 расщеплял одну цепь дуплекса ДНК и образовывал ковалентный промежуточный продукт фермент-ДНК, называемый комплексом расщепления TOP1 (TOP1cc). Лечение камптотецином (CPT), ингибитором TOP1, связывается с TOP1cc и стабилизирует его, что приводит к образованию долгоживущих TOP1-DPC. Наблюдалось, что TOP1-DPC индуцируются и достигают пика через 20 минут после воздействия CPT. Одновременно TOP1-DPC модифицировались SUMO-2/3, который также достигал пика через 20 минут после лечения CPT. Поскольку SUMO-2 и SUMO-3 имеют 95% идентичность последовательности, антитела не отличают одно от другого. Через 60 мин TOP1-DPC и их модификация SUMO-2/3 уменьшались, сопровождаясь кульминацией их модификации SUMO-1 и убиквитилирования. После 60-минутного медикаментозного лечения уровни модификации и убиквитилирования TOP1-DPC SUMO-1 начали снижаться. У млекопитающих изоферменты TOP2 α и β действуют путем введения двухцепочечного разрыва ДНК, а также путем образования транзиторного и обратимого ковалентного комплекса фермент-ДНК (TOP2cc). Ингибиторы TOP2, такие как этопозид (ETOP), превращают TOP2cc в TOP2-DPC и индуцируют их SUMOylation и ubiquitylation. Подобно кинетике TOP1-DPC и их PTM, TOP2α- и β-DPC и их модификация SUMO-2/3 достигали пика на 20 мин, а затем начинали снижаться; в то же время их модификации SUMO-1 и убиквитина достигли пика на 60-й минуте (рис. 2). Было продемонстрировано, что клиренс TOP-DPC является результатом протеасомальной деградации, а клиренс TOP-DPC SUMOylation и ubiquitylation, вероятно, обусловлен рециркуляцией путем деSUMOylation и deubiquitylation, соответственно, их реверсивными ферментами. В экспериментах, показанных на рисунке 3 , изучались ФА-индуцированные неферментативные ЦОД и их ПТМ. Было замечено, что ЦОД и их СУМО-2/3, СУМО-1 и убиквитилирование формировались и накапливались дозозависимым образом ФА. Наконец, PARylation TOP1-DPC количественно детектировали с помощью антитела к PAR тем же методом (рис. 4). PARylation TOP1-DPC не обнаруживалось до тех пор, пока в клетку не был добавлен ингибитор PARG, что позволяет предположить, что PARylation происходит быстро и является очень динамичным. В соответствии с предыдущим выводом, ингибирование деПАРилирования PARGi, по-видимому, приводит к накоплению TOP1-DPC, вероятно, путем блокирования протеолитической деградации.

Рисунок 1: Количественный анализ образования и кинетики TOP1-DPC и их SUMOylation и ubiquitylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 20 мкМ CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Количественный анализ образования и кинетики TOP2-DPC и их SUMOylation и убиквитилирования при обработке ETOP в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 200 мкМ ETOP в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Количественный анализ неферментативных ДПК и их сумоилирования и убиквитилирования при обработке ФА в клетках HEK293. (А) Клетки HEK293 обрабатывали ФА указанных концентраций в течение 2 ч. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Количественный анализ TOP1-DPC и их PARylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 предварительно обрабатывали 10 мкМ PARGi в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих интересов.