Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций

Краткое содержание

В настоящем протоколе представлен модифицированный метод обнаружения и количественного определения ДНК-белковых сшивок (ДПК) и их посттрансляционных модификаций (ПТМ), включая убиквитилирование, SUMOylation и АДФ-рибозилирование, индуцированные ингибиторами топоизомеразы и формальдегидом, что позволяет изучать образование и репарацию ДПК и их ПТМ.

Аннотация

ДНК-белковые сшивания (ДПК) — это частые, повсеместные и вредные повреждения ДНК, которые возникают в результате эндогенного повреждения ДНК, сбоев в работе ферментов (топоизомераз, метилтрансфераз и т. д.) или экзогенных агентов, таких как химиотерапевтические препараты и сшивающие агенты. После того, как ЦОД индуцированы, к ним оперативно привязываются несколько типов посттрансляционных модификаций (ПТМ) в качестве механизмов раннего реагирования. Было показано, что DPC могут модифицироваться убиквитином, малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO) и поли-АДФ-рибозой, которые подготавливают субстраты для передачи сигналов соответствующим назначенным ферментам репарации и, в некоторых случаях, координируют репарацию последовательным образом. Поскольку ПТМ возникают быстро и являются высокообратимыми, было сложно выделить и обнаружить ЦОД, сопряженные с ПТМ, которые обычно остаются на низких уровнях. Здесь представлен иммуноферментный анализ для очистки и количественного обнаружения убиквитилированных, SUMOylированных и АДФ-рибозилированных DPC (лекарственно-индуцированные топоизомеразные DPC и альдегид-индуцированные неспецифические DPC) in vivo. Этот анализ является производным от анализа RADAR (быстрый подход к восстановлению аддуктов ДНК), который используется для выделения геномной ДНК, содержащей DPC, путем осаждения этанола. После нормализации и расщепления нуклеаз ПТМ ДПК, включая убиквитилирование, SUMOylation и ADP-рибозилирование, выявляются методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител. Этот надежный анализ может быть использован для идентификации и характеристики новых молекулярных механизмов, которые восстанавливают ферментативные и неферментативные DPC, и имеет потенциал для обнаружения низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на конкретные факторы, регулирующие PTM для восстановления DPC.

Введение

Повреждение геномной ДНК происходит из-за спонтанного распада, внутренних повреждений и факторов окружающей среды¹. Образующиеся повреждения ДНК включают поврежденные основания, несоответствия, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы, меж- и внутрицепочечные сшивки, а также ДНК-белковые сшивания (ДПК). DPC образуется, когда связанный с хроматином белок захватывается на ДНК посредством ковалентного сцепления. ДПК индуцируются эндогенными повреждениями ДНК и реактивными метаболитами, а также экзогенными агентами, такими как химиотерапевтические препараты и бифункциональные сшивающие агенты. При определенных обстоятельствах ферментная дисфункция также может привести к образованию^ЦОД2. Огромная разница в индукторах DPC приводит к различию в идентичности ковалентно-связанного белка, области хромосомы, где образуется DPC, типе структуры ДНК, сшитой с белком, и химических свойствах ковалентной связи между белком и ДНК ^2,3,4.

В зависимости от их химической природы ЦОД обычно подразделяются на две группы: ферментативные ДПК и неферментативные ДПК. Некоторые ферменты, такие как топоизомеразы, гликозилазы и метил/ацилтрансферазы, действуют, образуя обратимые ковалентные промежуточные продукты фермент-ДНК во время их нормальных каталитических реакций. Они являются короткоживущими промежуточными продуктами фермент-ДНК и могут быть преобразованы в долгоживущие ферментативные ДПК при их захвате эндогенными или экзогенными агентами, в частности химиотерапевтическими препаратами³. Топоизомеразные ДПК являются одними из наиболее частых ферментативных ДПК в эукариотических клетках, которые могут быть продуцированы клинически полезными ингибиторами топоизомеразы (топотекан и иринотекан для топоизомеразы I [TOP1] и этопозид и доксорубицин для топоизомеразы II [TOP2]) и являются первичными терапевтическими механизмами этих ингибиторов ^5,6. ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ) 1, 3А и 3В являются мишенью 5-аза-2'-дезоксицитидина (также известного как децитабин) и образуют ДПК при воздействии препарата⁷. Реактивные агенты, а также ультрафиолетовое излучение и ионизирующее излучение индуцируют неферментативные ДПК, неспецифически сшивая белки с ДНК. Реактивные альдегиды, такие как ацетальдегид и формальдегид (ЖК), часто образуются как побочные продукты клеточного метаболизма, среди которых ЖК образуются в микромолярных концентрациях во время метаболизма метанола, перекисного окисления липидов и деметилирования гистонов. Кроме того, FA является химическим веществом для производства в больших объемах, производимым во всем мире, воздействию которого подвергаются многие люди как в экологическом^{, так} и в профессиональном ^плане.

Как ферментативные, так и неферментативные DPC очень токсичны для клеток, поскольку их громоздкие белковые компоненты эффективно препятствуют почти всем процессам, связанным с хроматином, включая репликацию и транскрипцию, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу, если их не восстановить. За последние два десятилетия репарация ЦОД была интенсивно изучена, и несколько белков/путей были идентифицированы как ключевые факторы, которые либо непосредственно восстанавливают ЦОД, либо модулируют процессы их репарации. Например, было хорошо установлено, что протеолиз белковой массы DPC является ключевым этапом репарации DPC, и что протеолиз может быть катализирован протеазами SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 или^26S протеасомным комплексом 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 в зависимости от типа клетки или клеточного контекста. Идентификация и характеристика этих протеаз в значительной степени опирались на комплекс in vivo ферментного анализа (ICE)^28,29 и быстрый подход к восстановлению аддукта ДНК (RADAR)^30,31, оба из которых выделяют молекулы ДНК и их ковалентно-связанные белки из свободных клеточных белков, что позволяет обнаруживать DPC с помощью щелевой блотины с использованием антител^, нацеленных на сшитые белки. Кроме того, в качестве средства обнаружения и количественного определения ДПК на уровне^{одной клетки 32} был использован метод иммуноокрашивания агарозной ДНК (ТАРДИС). В настоящее время исследователи выбирают анализ RADAR вместо анализа ICE для измерения DPC, поскольку анализ ICE основан на очистке нуклеиновых кислот с помощью градиентного ультрацентрифугирования хлорида цезия, что чрезвычайно трудоемко, в то время как анализ RADAR осаждает нуклеиновые кислоты с использованием этанола в течение гораздо более короткого периода времени.

В последние годы появляется все больше доказательств того, что множественные посттрансляционные модификации (ПТМ) участвуют в передаче сигналов и рекрутировании DPC-таргетированных протеаз 3,33,34,35. Например, было обнаружено, что TOP1- и TOP2-DPC конъюгируются малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO)-2/3, а затем SUMO-1 лигазой SUMO E3 PIAS4, независимо от репликации и транскрипции ДНК. Последовательные модификации SUMO, по-видимому, являются мишенью убиквитина, который депонируется в SUMOylated TOP-DPC и образует полимерные цепи через свой остаток лизина 48 с помощью убиквитин-лигазы, нацеленной на SUMO, называемой RNF4. Впоследствии полимер убиквитина вызывает сигнал и рекрутирует протеасому 26S в TOP-DPC^23,36. Недавно было показано, что один и тот же путь SUMO-убиквитин действует на DNMT1-DPC, а также на комплексы PARP-ДНК для их репарации^37,38. Кроме того, сообщалось, что SUMO-независимое убиквитилирование убиквитин-E3-лигазой TRAIP подготавливает ДПК к протеасомальной деградации репликационно-связанным образом³⁹. Подобно протеасомальной деградации TOP-DPC, протеолиз ферментативных и неферментативных DPC с помощью репликационно-связанного металлопротеазного SPRTN также требует убиквитилирования субстратов DPC в качестве механизма вовлечения SPRTN^40,41. Разграничение роли SUMOylation и убиквитилирования требует обнаружения DPC, помеченных этими PTM. Поскольку исходный анализ ICE и анализ RADAR полагаются на аппарат slot-blot/dot-blot для измерения непереваренных образцов ДНК, ни один из этих двух анализов не может разрешить и визуализировать PTM-сопряженные виды DPC с разной молекулярной массой. Чтобы решить эту проблему, мы расщепляли образцы ДНК после их очистки путем осаждения этанола и нормализации образца микрококковой нуклеазой, эндоэкзонуклеазой ДНК и РНК для высвобождения сшитых белков, что позволило нам разрешать белки, а также их ковалентные ПТМ с помощью электрофореза в додецилсульфатном полиакриламидном геле натрия (SDS-PAGE). Электрофорез позволил обнаружить и количественно определить ПТМ-конъюгированные ДПК с использованием специфических антител, нацеленных на ПТМ. Первоначально мы назвали этот усовершенствованный метод анализом DUST, чтобы подчеркнуть его надежность в обнаружении убиквитилированных и SUMOylated TOP-DPC²³. Позже мы расширили использование анализа для количественной оценки АДФ-рибозилирования TOP1-DPC in vivo, используя антитела против полимеров поли-АДФ-рибозы²⁰.

Здесь представлен подробный протокол для анализа, который обнаруживает и измеряет убиквитилированные, SUMOylированные и АДФ-рибозилированные DPC, который был оптимизирован для модифицированных TOP-DPC, индуцируемых их ингибиторами, и неспецифических/неферментативных DPC, индуцированных FA. Этот анализ изолирует PTM-конъюгированные DPC путем лизиза клеток хаотропным агентом, осаждения ДНК этанолом и высвобождения сшитых белков и их модификаторов с помощью микрококковой нуклеазы. Белки, связанные с ДНК, и их ПТМ количественно определяют методом иммуноблоттинга с использованием специфических антител. Этот анализ открывает новые возможности для выяснения молекулярных механизмов, с помощью которых клетка восстанавливает как ферментативные, так и неферментативные ДПК. В частности, он позволяет детально изучить индукцию и кинетику ПТМ, важных для регуляции деградации и репарации TOP-DPC, и, таким образом, позволяет открыть новые факторы, такие как Е3-лигазы, диктующие ПТМ, а также ингибиторы, нацеленные на эти факторы. Поскольку некоторые из PTM, ответственных за репарацию TOP-DPC, вероятно, участвуют в репарации DPC, индуцированных другими химиотерапевтическими препаратами, такими как препараты на основе платины²², этот анализ также имеет потенциал для применения для открытия новых лекарств и рациональной оптимизации комбинаторной терапии ингибиторами топоизомеразы или противоопухолевыми препаратами на основе платины в клетках пациента для определения схем лечения.

Протокол

1. Клеточная культура и медикаментозная обработка в клеточной линии эмбриональной почки человека 293 (HEK293)

1. Приготовьте питательную среду, модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% L-глутамином 2 мМ и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина.
2. Посев 1 x 10 6 клеток в 60-миллиметровую пластину или 6-луночную пластину для каждого условия обработки плюс контроль.
3. На следующий день обработайте клетки индукторами DPC по выбору.
   1. Чтобы индуцировать TOP1-DPC и их убиквитилирование и SUMOylation, добавляют к клеткам ингибитор TOP1 камптотецин в дозе 20 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
   2. Чтобы индуцировать TOP2α и β-DPCs, а также их убиквитилирование и SUMOylation, подвергают клетки добавлению этопозида ингибитора TOP2 при 200 мкМ и собирают клетки через 20, 60 и 180 минут.
   3. Для индуцирования неферментативных ДПК и их убиквитилирования и SUMOylation добавляют ФА в дозе 1 мМ и собирают клетки через 2 ч после экспозиции.
   4. Чтобы индуцировать PARylation TOP1-DPC, предварительно обрабатывают клетки в течение 1 ч для блокировки деPARylation ингибитором поли(АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) PDD00017273 при 10 мкМ с последующей совместной обработкой 20 мкМ камптотецином в течение 20, 60 и 180 мин.

2. Выделение и нормализация ДНК, содержащей сшитые белки

1. После обработки быстро аспирируйте среду с помощью всасывающей пипетки и промойте клетки ледяным 1-кратным фосфатным буфером (PBS). Немедленно лизируйте клетки в 600 мкл реагента ДНКзол, содержащего 1x ингибитор коктейля протеазы, 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 20 мМ N-этилмалеимид (ингибитор деСУМОилирующих и деубиквитилирующих ферментов).
2. Медленно перемешивайте пластину на вибрационной платформе в течение 10 минут при температуре 4 °C.
3. Добавьте 1/2 объема 100% холодного этанола (0,3 мл) непосредственно в планшет и повторяйте шаг 2.2 до тех пор, пока не станет виден непрозрачный агрегат нуклеиновых кислот. Переложите клеточный лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и подвергните пробирку центрифугированию с максимальной скоростью (20 000 x g) в течение 15 минут при 4 °C для осаждения нуклеиновой кислоты и ее сшитых белков.
4. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью всасывающей пипетки и промывают гранулы нуклеиновых кислот в 1 мл 75% этанола с последующим центрифугированием в течение 2 минут по 20 000 x g при 4 °C.
5. Отсасывайте надосадочную жидкость, откручивайте с той же скоростью и удаляйте оставшуюся жидкость с помощью пипетки P20. Высушите гранулу на воздухе в течение 5 минут.
6. Быстро растворите гранулу нуклеиновой кислоты в 0,1 мл ddH₂O. Повторно суспендируйте гранулу путем повторного пипетирования, затем инкубируйте на водяной бане с температурой 37 °C, пока гранула не набухнет, по крайней мере, в три раза больше (примерно 30 минут).
7. Продуцируйте образцы ультразвуковым процессорным зондом с амплитудой 30% в течение 10 с до полного растворения гранулы.
8. Необязательный этап: Обработать образцы смесью РНКазы А/Т1 (10 мкг РНКазы А и 25 ЕД РНКазы Т1) и инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Добавьте в пробирку 1/10 объема 3 М ацетата натрия и два объема ледяного 100% этанола с последующим центрифугированием при 20 000 x g в течение 10 мин для извлечения ДНК. Удалите надосадочную жидкость и растворите осажденную ДНК в 0,1 мл ddH₂O.
9. Дополнительный этап: центрифугируют образец в течение 5 мин при 20 000 x g и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку.
10. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью спектрометра в ультрафиолетовом диапазоне (UV-Vis). Типичный выход ДНК составляет около 600-800 нг/мкл. Соотношение А260/А280 должно быть снижено с 2,0-2,1 до 1,8-1,9 после удаления РНК.
11. Доведите концентрацию ДНК до 400-500 нг/мкл в 0,12 мл ddH 2 O. Перенесите 20 мкл образца в новую микроцентрифужную пробирку в качестве контроля загрузки непереваренной ДНК (см. шаг_2.4).
12. Чтобы расщепить ДНК, растворенную в оставшихся 100 мкл ddH₂O, добавьте в образец 2000 гелевых единиц микрококковой нуклеазы вместе с 1/10 объема (~11 мкл) 10-кратного реакционного буфера для микрококковых нуклеаз кальция. Инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.

3. Вестерн-блоттинг переваренных образцов ДНК

1. Добавьте 4 буфера для образца Laemmli, затем прокипятите образец в течение 5 минут.
2. Загрузите 5-6 мкг расщепленного образца (~15 мкл) на 4%-20% полиакриламидный гель, а затем SDS-PAGE⁴² для разрешения немодифицированных и PTM-конъюгированных DPC.
3. Для обнаружения ЖК-индуцированных неферментативных видов ДПК инкубируйте гель с красителем Coomassie blue в течение ночи при комнатной температуре. Смыть гель ddH 2 O в течение₂ч и получить изображение с помощью системы визуализации.
4. Перенесите гель и инкубируйте мембраны в течение ночи при 4 °C с соответствующими разведениями первичных антител в блокирующем буфере.
   1. Для выявления убиквитилирования проводят разведение антител к убиквитину в соотношении 1:100.
   2. Для обнаружения SUMO-1 или модификации SUMO-2/3 проводят разведение анти-SUMO-1 или антител к SUMO-2/3 в соотношении 1:250.
   3. Для обнаружения АДФ-рибозилирования проводят разведение антител к PAR в соотношении 1:500.
   4. Чтобы обнаружить общие TOP1-, TOP2α- или TOP2β-DPC, сделайте разведение антител к TOP1, анти-TOP2α или анти-TOP2β в соотношении 1:500.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения подробной информации о разведении антител.
5. Инкубируют 1x PBS-T (0,1% tween 20) промытую мембрану со вторичным антителом, разбавленным в 5000 раз в блокирующем буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре.
6. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

4. Щелевое блоттингирование непереваренных образцов ДНК

1. Развести 20 мкл непереваренного образца ДНК в 180 мкл натрий-фосфатного буфера (25 мМ, рН 6,6).
2. Разрежьте нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм) и уравновешивайте в течение 5 мин в натрий-фосфатном буфере.
3. Соберите щелевой блот-аппарат в соответствии с инструкциями производителя и подключите его к вакуумной системе.
4. Промойте лунки натрий-фосфатным буфером, применив вакуум. Убедитесь в отсутствии протечек в колодцах.
5. Остановите вакуум и загрузите 200 мкл ДНК на образец (1 мкг). Заполните пустые лунки 200 мкл натрий-фосфатного буфера.
6. Примените пылесос.
7. Когда все лунки полностью опустеют, остановите вакуум, загрузите 200 мкл натрий-фосфатного буфера в каждую лунку и повторите шаг 4.6.
8. Извлеките мембрану и заблокируйте 5%-ным блокирующим буфером в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
9. Зонд с антителом к двухцепочечной ДНК (дцДНК) в разведении 1:5 000 в течение ночи при 4 °C.
10. Промыть 3 раза с 1 PBS-T и инкубировать с разбавленным вторичным антителом против мышей, связанным с пероксидазой хрена (HRP) в соотношении 1:5.
11. Разработайте мембрану с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и получите изображение с помощью системы визуализации.

5. Денситометрический анализ

1. Используя ImageJ, рассчитайте отношение интенсивности каждой полосы/мазка к интенсивности слота непереваренной ДНК и нормализуйте это соотношение с таковым в клетках без/до медикаментозного лечения.

Результаты

Репрезентативные результаты, представленные на рисунке 1 , показывают образование и кинетику лекарственно-индуцированных TOP1-DPC, а также их сумоилирование и убиквитилирование. TOP1 расщеплял одну цепь дуплекса ДНК и образовывал ковалентный промежуточный продукт фермент-ДНК, называемый комплексом расщепления TOP1 (TOP1cc). Лечение камптотецином (CPT), ингибитором TOP1, связывается с TOP1cc и стабилизирует его, что приводит к образованию долгоживущих TOP1-DPC. Наблюдалось, что TOP1-DPC индуцируются и достигают пика через 20 минут после воздействия CPT. Одновременно TOP1-DPC модифицировались SUMO-2/3, который также достигал пика через 20 минут после лечения CPT. Поскольку SUMO-2 и SUMO-3 имеют 95% идентичность последовательности, антитела не отличают одно от другого. Через 60 мин TOP1-DPC и их модификация SUMO-2/3 уменьшались, сопровождаясь кульминацией их модификации SUMO-1 и убиквитилирования. После 60-минутного медикаментозного лечения уровни модификации и убиквитилирования TOP1-DPC SUMO-1 начали снижаться. У млекопитающих изоферменты TOP2 α и β действуют путем введения двухцепочечного разрыва ДНК, а также путем образования транзиторного и обратимого ковалентного комплекса фермент-ДНК (TOP2cc). Ингибиторы TOP2, такие как этопозид (ETOP), превращают TOP2cc в TOP2-DPC и индуцируют их SUMOylation и ubiquitylation. Подобно кинетике TOP1-DPC и их PTM, TOP2α- и β-DPC и их модификация SUMO-2/3 достигали пика на 20 мин, а затем начинали снижаться; в то же время их модификации SUMO-1 и убиквитина достигли пика на 60-й минуте (рис. 2). Было продемонстрировано, что клиренс TOP-DPC является результатом протеасомальной деградации, а клиренс TOP-DPC SUMOylation и ubiquitylation, вероятно, обусловлен рециркуляцией путем деSUMOylation и deubiquitylation, соответственно, их реверсивными ферментами. В экспериментах, показанных на рисунке 3 , изучались ФА-индуцированные неферментативные ЦОД и их ПТМ. Было замечено, что ЦОД и их СУМО-2/3, СУМО-1 и убиквитилирование формировались и накапливались дозозависимым образом ФА. Наконец, PARylation TOP1-DPC количественно детектировали с помощью антитела к PAR тем же методом (рис. 4). PARylation TOP1-DPC не обнаруживалось до тех пор, пока в клетку не был добавлен ингибитор PARG, что позволяет предположить, что PARylation происходит быстро и является очень динамичным. В соответствии с предыдущим выводом, ингибирование деПАРилирования PARGi, по-видимому, приводит к накоплению TOP1-DPC, вероятно, путем блокирования протеолитической деградации.

Рисунок 1: Количественный анализ образования и кинетики TOP1-DPC и их SUMOylation и ubiquitylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 20 мкМ CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Количественный анализ образования и кинетики TOP2-DPC и их SUMOylation и убиквитилирования при обработке ETOP в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 обрабатывали 200 мкМ ETOP в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Количественный анализ неферментативных ДПК и их сумоилирования и убиквитилирования при обработке ФА в клетках HEK293. (А) Клетки HEK293 обрабатывали ФА указанных концентраций в течение 2 ч. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Количественный анализ TOP1-DPC и их PARylation при обработке CPT в клетках HEK293. (A) Клетки HEK293 предварительно обрабатывали 10 мкМ PARGi в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали CPT в течение указанных периодов времени. Клеточные лизаты собирали и подвергали модифицированному RADAR-анализу и вестерн-блоттингу с указанными антителами. Непереваренные образцы ДНК подвергали слолевой блоттингу с использованием антител к дцДНК в качестве контроля нагрузки. (B) Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и построена с помощью программного обеспечения Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Описанный метод позволяет измерять ферментативные и неферментативные ДНК-белковые сшивки в клетках млекопитающих и является единственно подходящим подходом для изучения их убиквитилирования, SUMOylation и АДФ-рибозилирования. Щелевой блоттинг после анализа ICE или RADAR позволяет быстро обнаруживать специфические ферментативные DPC, такие как TOP-DPC, с помощью их антител. Однако недостатком этого метода является его неспособность разделять белки разной молекулярной массы, что делает невозможным определение размеров PTM-сопряженных ЦОД. Описанный способ решает проблему путем высвобождения сшитых белков с микрококковой нуклеазой, которая расщепляет ДНК до олигонуклеотидов с концевыми 3'-фосфатами, тем самым обеспечивая полное разделение белков (конъюгированных с олигонуклеотидами) с помощью SDS-PAGE. Таким образом, ЦОД, модифицированные мономерами и полимерами убиквитина, SUMO или АДФ-рибозы различных размеров, могут быть визуализированы и количественно определены антителами, нацеленными на эти ПТМ, что позволяет детально исследовать их образование и кинетику. Для обеспечения воспроизводимости и расчета статистической значимости требуются биологические повторы экспериментов.

Одной из наиболее распространенных проблем этого анализа является низкий выход ДНК после осаждения этанола. С одной стороны, выход ДНК может быть увеличен за счет большего количества исходного материала (клеток). С другой стороны, инкубация клеточных лизатов с этанолом в плоской пластине, а не в пробирке Эппендорфа, может заметно улучшить агрегацию молекул ДНК и, таким образом, облегчить их осаждение. Неспецифические сигналы, наблюдаемые в образцах без медикаментозной обработки, могут указывать на загрязнение нековалентным белком. В этом случае можно рассмотреть возможность промывки гранул ДНК буфером с высоким содержанием соли для удаления загрязняющих веществ перед ультразвуковой обработкой. Также рекомендуется отжимать образцы ДНК после ультразвуковой обработки и расщепления микрококковой нуклеазы и выбрасывать все нерастворимые. В случае плохого сигнала или его отсутствия можно попробовать несколько возможных решений. Во-первых, можно увеличить количество загрузки ДНК для SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Для обнаружения SUMOylated и ubiquitylated DPC species рекомендуется загрузить в гель не менее 4 мкг ДНК. Во-вторых, можно увеличить концентрацию препарата, чтобы индуцировать более высокие уровни DPC и связанных с ними PTM. В-третьих, рекомендуется инкубировать блоты с первичными антителами в течение еще одного дня, если полосы/мазки кажутся слабыми. 2-дневная инкубация может значительно потенцировать сигнал и, таким образом, снижает биологическую изменчивость по результатам независимых экспериментов²³. Зачистка мембраны для повторного окрашивания неизбежно приводит к потере определенного количества PTM-конъюгированных видов DPC, которые и без того находятся в низкой численности. Поэтому настоятельно рекомендуется использовать отдельные гели для определения убиквитина и SUMO, а не повторно зондировать один блот. Кроме того, гранулы ДНК должны быть промыты 75% этанолом для удаления оставшейся ДНК-золы, содержащей соль гуанидина, перед растворением в H2O или любых других растворителях, что в противном случае вызывает кристаллизацию образца после добавления загрузочного буфера Laemmli.

Рабочий процесс описанного метода гораздо более эффективен по времени по сравнению с громоздким ICE-анализом, поскольку он основан на быстром осаждении этанола вместо трудоемкого ультрацентрифугирования хлорида цезия для выделения геномной ДНК. Очистка на основе этанола приводит к низкому количеству белковых загрязнителей, которые обычно незначительны для иммунодетекции. Однако, когда дело доходит до аналитических исследований, таких как протеомный анализ на основе масс-спектрометрии или секвенирование нового поколения, которые требуют точности и прецизионности, центрифугирование с градиентом плотности хлорида цезия по-прежнему является более надежным подходом для выделения чистой ДНК с высоким содержанием. Этот метод также потенциально может быть применен для профилирования сайтов модификации на сшитых белках и определения типов сцепления полиубиквитилирования и поли-СУМОилирования с использованием соответствующих методов, основанных на масс-спектрометрии.

Следует отметить, что данный анализ позволяет идентифицировать и охарактеризовать факторы, регулирующие ПТМ для ремонта ЦОД. Например, беспристрастные высокопроизводительные методы скрининга (РНК-интерференция и CRISPR) являются мощными инструментами для обнаружения убиквитиновых E3-лигаз, SUMO-E3-лигаз и связанных с ними кофакторов, снижающих цитотоксичность индукторов DPC. Описанный метод позволяет проводить молекулярную валидацию этих белков, определяя, помогают ли они клеткам выживать после индукторов DPC путем репарации DPC. Новые низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на эти белки, идентифицированные, например, с помощью виртуального скрининга, также могут быть валидированы с помощью этого протокола. Учитывая, что ингибиторы топоизомеразы являются одними из наиболее часто назначаемых химиотерапевтических препаратов, этот надежный анализ может быть разработан в качестве инструмента для разработки препаратов, которые синергируют с клиническими ингибиторами топоизомеразы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Thermo Fisher	70011069
4– 20% сборный полиакриламидный гель	Bio-Rad	4561096
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747
AcquaStain (coomassie blue)	Bulldog Bio	AS001000
анти-дцДНК (мышиный моноклональный)	Abcam	27156	1: 5,000 рекомендуется разведение
анти-PAR (мышиный моноклональный)	R& D системы	4335-MC-100	1:500 рекомендуется разведение
анти-SUMO-1 (кролик моноклональный)	Технология клеточной сигнализации	4940	1:250 рекомендуется разведение
анти-SUMO-2/3 (кролик моноклональный)	Технология клеточной сигнализации	4971	1:250 рекомендуется разведение
анти-TOP1 (мышиный моноклональный)	BD Biosciences	556597	1:500 рекомендуется
разведение 1:500анти-ТОП2&альфа; (мышиный моноклональный)	Santa Cruz Biotechnology	SC-365799	1:250 рекомендуется разведение
анти-TOP2β (мышиный моноклональный)	Santa Cruz Biotechnology	SC-25330	1:250 рекомендуется разведение
антиубиквитином (мышиный моноклональный)	Santa Cruz Biotechnology	SC-8017	1:100 рекомендуется разведение
хлорида кальция	Sigma-Aldrich	499609	используется для расщепления микрококковых нуклеаз
Camptothecin	Sigma-Aldrich	PHL89593
системой	визуализации ChemiDo MPBio-Rad	12003154
Динатрийфосфат	Sigma-Aldrich	5438380100	Используется для изготовления буфера фосфата
натрия DNAzol	Thermo Fisher	10503027
DTT (дитиотреит)	Thermo Fisher	R0861
модифицированная среда Dulbecco's Eagle's	Sigma-Aldrich	11965084
Этиловый спирт, 200 пробы	Sigma-Aldrich	E7023
Этопозид	Sigma-Aldrich	1268808
формальдегид	Sigma-Aldrich	47608
Graphpad Prism Software	GraphStats	Prism 9.0.0
HRP-связанная мышь IgG	Cytiva	NA931	1: 5,000 рекомендуется HRP-связанное разведение
Rabbit IgG	Cytiva	NA934	1: Рекомендуется разведение 5 000
ImageJ Software	NIH, США	ImageJ 1.53e
L-глутамин	Fisher Scientific	25030081
Максимальная чувствительность ECL субстрат	Thermo Fisher	34095
Микрококковая нуклеаза	New England BioLabs	M0247S
Мононатрийфосфат	Sigma-Aldrich	S3139	Используется для изготовления фосфатно-натриевого буфера
NanoDrop 2000 спектрофотометр	Thermo Scientific	ND-2000
N-этилмалеимид	Thermo Fisher	23030	DeSUMOингибитор деубиквитилирования
Нитроцеллюлозная мембрана, 0,45 &; m	Bio-Rad	1620115
Обезжиренное сухое молоко	Bio-Rad	1706404XTU
PDD00017273	Selleckchem	S8862	Поли(АДФ-рибоза) ингибитор гликогидролазы
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher	15140122
Коктейль ингибиторов протеазы	Thermo Fisher	78430
Q700	Qsonica	Q700-110
Готовый к сборке трансферный комплект PVDF	Bio-Rad	1704274
Slot-blot аппарат	Bio-Rad	1706542
Щелевой фильтр-бумага	Bio-Rad	1620161
Trans-Blot турботрансферная система	Bio-Rad	1704150
Трис/Глицин/SDS электрофорез	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179
Вертикальная электрофорезная ячейка	Bio-Rad	1658004