Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка влияния новой процессорной системы охлаждающей ячейки на изоляцию островковых клеток

782 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65321

⸱

11 августа 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

В этой статье

Краткое содержание

Протокол здесь описывает пользовательскую систему процессора охлаждающей ячейки, совместимую с чистой комнатой надлежащей производственной практики (GMP) для улучшения жизнеспособности ячейки после обработки.

Аннотация

Стандартное оборудование для клеточной терапии, включая золотой стандартный клеточный процессор для очистки островков человека для клинической трансплантации, редко охлаждается, потенциально подвергая клетки воздействию повышенных температур на этапе центрифугирования. Индивидуальные системы охлаждения имеют прямое преимущество для жизнеспособности и функционирования островков человека. Данное исследование было разработано с целью проверки эффективности недавно разработанной, легкодоступной системы охлаждения процессора ячеек, требующей минимальных модификаций, а также для оценки ее влияния на жизнеспособность клеток человека и окружающую среду в чистых помещениях GMP. Система охлаждения, представляющая собой механически охлаждаемый теплообменник с температурой -30 °C, использовалась для подачи охлажденного медицинского сухого воздуха в чашу процессора ячеек через отверстие, просверленное в крышке центрифуги. В связи с ограниченным количеством доноров поджелудочной железы в Катаре, валидация системы проводилась с непрерывной очисткой с градиентом плотности объединенной охристой оболочки костного мозга человека. Стерильность, турбулентность и количество частиц измерялись в чистых помещениях классов C и B. Турбулентность вокруг охлаждаемого процессора ячеек не возникала, а также не образовывались избыточные частицы размером 0,5 мкм и 5 мкм в воздухе в соответствии со стандартами GMP для чистых помещений. В начале и в конце стадий сбора температура повышалась соответственно до 21,50 °C ± 0,34 °C и 21,93 °C ± 0,20 °C в процессоре без охлаждения и только до 10,9 °C ± 0,17 °C и 11,16 °C ± 0,35 °C в процессоре с охлаждаемыми ячейками (p <0,05). Охлаждаемый процессор ячеек привел как к улучшению восстановления (98%) фракции мононуклеарной ячейки, так и к жизнеспособности (100% ± 2%) постобработки. Новая система охлаждения эффективно снижает тепло, выделяемое процессором ячеек, не оказывая при этом воздействия твердых частиц на окружающую среду чистого помещения GMP. Описанный здесь процессор с охлаждаемыми элементами представляет собой недорогой (16 000 долларов США без учета налогов, таможенного оформления и транспортировки) и минимально инвазивный метод обеспечения надежного охлаждения. В настоящее время эта технология в центре клеточной терапии GMP применяется для выделения и трансплантации островковых клеток человека для клинической программы.

Введение

Трансплантация островков при тяжелом диабете 1 типа может восстановить эндогенную секрецию инсулина и стала стандартом лечения в ряде стран1. Выделение островков – это многоступенчатая процедура, которая включает в себя теплое ферментативное и механическое сбраживание поджелудочной железы с последующим охлаждением фаз для восстановления переваренной ткани и очищение островков с непрерывными или прерывистыми градиентами плотности на клеточном процессоре. Быстрое охлаждение замедляет фазу ферментативного переваривания и защищает островки от пищеварительных ферментов, высвобождаемых в результате загрязнения ацинарных клеток. Клеточный процессор изначально был разработан для разделения компонентов клеточной крови при температуре окружающей среды2. Он был перепрофилирован для очистки островков поджелудочной железы человека в 1989 году3. В течение трех десятилетий островки человека очищались для клинических испытаний и, в последнее время, стандарта лечения, либо в клеточном процессоре с прерывистыми градиентами4, либо в непрерывных градиентах плотности1 сделанных с помощью градиентного maker1 или эквивалентного компьютерного миксера5,6,7. Другие группы сообщали об очистке островков от крупных млекопитающих и людей с использованием больших цилиндрических пластиковых бутылок8,7,9, что значительно улучшило эффективность очистки и качество островков.

Действительно, учитывая золотой стандарт очистки островков человека для клинической трансплантации10,11, изготовленный клеточный процессор был без охлаждения. Прямым следствием отсутствия охлаждения стало то, что островки подвергались воздействию повышенных температур на этапе очистки. Во время центрифугирования происходит неконтролируемое повышение температуры из-за механического трения ротора12,13. Клеточные процессоры были адаптированы с помощью системы охлаждения в центрах изоляции островков, которая статистически увеличивала индуцированную глюкозой секрецию инсулина и жизнеспособность клеток, подтверждая преимущество сохранения островков поджелудочной железы при низких температурах во время процедуры очисткиsup class="xref">15.

Следует отметить, что в конце 1980-х годов было построено 10 рефрижераторных прототипов для уменьшения повреждения островков во время градиентной очистки плотности, но они больше не привлекли внимания. Прототипы процессоров ячеек были основаны на шпиндельном и барабанном охлаждении охлажденным полиэтиленгликолем. В частности, растворы для очистки островков, включая растворы для сохранения органов и градиенты плотности полисахаридов, могут быть вредны для жизнеспособности островков при использовании при комнатной температуре или выше 16,17,18. Проведено сравнение различных стратегий охлаждения процессора ячеек для очистки островковых клеток с оригинальным неохлаждаемым процессором ячеек для борьбы с неконтролируемым повышением температуры, возникающим из-за трения ротора. Было предпринято несколько попыток охладить клеточный процессор во время очистки островков человека. Процессор ячейки может быть временно или постоянно размещен в специально спроектированном холодном помещении для поддержания температуры 0-8 °C19 во время градиентного центрифугирования, которое в настоящее время используется в центрах изоляции островков в Университете Иллинойса в Чикаго19, Университет Майами14, Оксфордский университет facilities15, и Университет Сан-Франциско (специальный блок охлаждения заключает в себя процессор ячейки). Другая модификация включает в себя охлаждение ядра шпинделя процессора с системой охлаждения с использованием жидкого азота с электронным управлением в Женеве, Швеции и Чешской Республике15,19. Другой альтернативой в середине 2000 года было охлаждение ядра процессора с помощью кондиционера12 или жидкостное охлаждение шахты в Университете Лилля.

Модификации системы охлаждения процессора ячеек недоступны и сопряжены с рисками (влажность, накопление конденсата) в чистых помещениях GMP, включая потерю гарантии и отказ производителя обслуживать машину. Следовательно, некоторые островные центры, включая Милан (Италия), Осло (Норвегия) и Эдинбург (Шотландия), не используют систему охлаждения для процессоров ячеек во время процесса очистки островков15.

Данное исследование было разработано для проверки эффективности недавно разработанного легкодоступного кулера в сочетании с минимально модифицированной системой процессора ячеек. Вкратце, описанный здесь воздухоохладитель представляет собой теплообменник с механическим охлаждением, контролирующий температуру сухого газа в диапазоне от -40 °C до -100 °C в минуту на уровне 1 стандартного кубического фута в минуту (SCFM). Эта система охлаждения требует подачи сухого медицинского воздуха. Воздух будет проходить через трубопровод и теплообменник и выходить через сопло (7,9 мм). Нагреватель, расположенный внутри сопла, подает тепло для контроля температуры воздушного потока. Была приобретена запасная цельнопластиковая крышка центрифуги, а также произведены минимальные доработки. В крышке просверливалось отверстие диаметром 13,3 мм, и охлажденный воздух подавался из сопла охладителя к процессору ячейки через отверстие в крышке центрифуги. Охлажденный медицинский воздух впрыскивался внутрь центрифугирующей чаши клеточного процессора при постоянном контроле температуры жидкостей или градиентов плотности.

Мы оценили технические характеристики охлаждаемого процессора и влияние охлаждающего элемента на среду чистого помещения GMP. Основное внимание уделялось достижению устойчиво низкой (<10 °C) температуры во время очистки островков человека для сохранения жизнеспособности. Используя разделение по плотности охристой оболочки в качестве прокси для выделения островков, мы определили эффективность этого протокола охлаждения на жизнеспособность клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В данном протоколе использовалась утилизированная цельная кровь, непригодная для использования согласно правилам утилизации учреждения. Одобрение IRB и информированное согласие не требуются.

1. Настройка охлаждаемого процессора клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в условиях чистого помещения; персонал обязан соблюдать правила ношения одежды для чистых помещений.

  1. Приобретение оборудования
    1. Приобретите запасную крышку из плексигласа. Приобретите систему охлаждения, охладитель с контроллером температуры газового потока с механическим охлаждением, осушитель воздуха, регулятор давления и расхода, а также гарантию (опционально). См. Таблицу материалов для справок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая стоимость составляет 16 13 долларов США без учета расходов на транспортировку или таможенных пошлин.
    2. Закажите медицинский сухой воздух — сжатый медицинский газ, соответствующий стандартному классу (ссылка на Европейскую фармакопею 1238), у местного поставщика медицинских газов. Приобретите 2 цилиндра объемом 6,8 m3 (47 л: 23 см x 153 см; диаметр x длина).
  2. Установка оборудования (Рисунок 1 и Рисунок 2)
    1. Поместите оборудование в чистое помещение стандарта GMP (перед входом в чистое помещение проведите дезинфекцию в соответствии с процедурами GMP).
    2. Для сжатого воздуха медицинского класса установите газопровод вместо размещения газового цилиндра непосредственно в чистом помещении.
  3. Модификация процессора клеток для охлаждения
    1. Сначала снимите крышку из плексигласа. Сохраните оригинальную крышку на случай возникновения проблем с гарантией. Просверлите в запасной крышке процессора клеток отверстие диаметром, соответствующим внешнему диаметру наконечника охлаждающего устройства, чтобы предотвратить растрескивание крышки центрифуги (рекомендуемый диаметр 13,3 мм).
    2. Закрепите кронштейны с помощью круглого куска пенопласта. Это делается для предотвращения поломки и/или появления царапин на крышке, для фиксации сопла охладителя над процессором клеток, для защиты крышки от чрезмерного изгиба из-за высокого давления впрыскиваемого воздуха, для поддержки веса сопла и, наконец, для обеспечения максимальной безопасности оператора, предоставляя свободный и безопасный доступ ко всем необходимым функциям процессора клеток во время экспериментальной процедуры.
    3. Подключите систему охлаждения к процессору клеток, прикрепив охлаждающее сопло к отверстию в плексигласе. Закрепите его кронштейнами и пенопластовыми прокладками.
    4. Разместите холодильный блок на расстоянии до 8 футов (2,4 м) от сопла. Разместите контроллер температуры в отдельном шкафу на расстоянии не более 6 футов (1,83 м) от холодильного блока.
    5. Установите заданную точку охладителя на -40 °C для охлаждения воздушного потока. Температура воздуха на выходе постоянно отображается на цифровом индикаторе с разрешением 0,1 °C. Установите температуру на выходе цифровым способом с точностью до 0,1 °C с помощью контроллера температуры.
    6. Контролируйте давление и скорость потока подаваемого воздуха на модуле регулятора давления и расхода (Рисунок 2) перед подачей в охладитель. Установите их на 5 psi и 4 SCFM соответственно, чтобы достичь оптимальных условий при охлаждении воздушного потока до -30 °C ± 2 °C.
    7. Убедитесь, что подача медицинского газа регулируется при выходном давлении 5 бар и может длиться не менее 90 мин, так как это необходимо для достижения температуры сжатого воздуха -30 °C.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Медицинский сухой воздух представляет собой сжатый медицинский газ, и полностью сжатый сухой воздух соответствует стандартному классу.
    8. Подайте давление 5 бар из сопла охладителя, подключенного к крышке процессора клеток через отверстие, просверленное в крышке центрифуги. Впрыскивайте охлажденный медицинский воздух внутрь центрифужной чаши процессора клеток (Рисунок 2). Выберите положение впрыска воздуха таким образом, чтобы охлажденный воздух был направлен перпендикулярно алюминиевому ободу ротора центрифуги.
    9. При подготовке процессора клеток убедитесь, что ротор находится при комнатной температуре (18 °C). Установите автоматический терморегулятор системы охлаждения на -30 °C и направьте впрыск холодного воздуха на ротор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были протестированы различные условия испытаний для достижения оптимального температурного градиента +4 °C, который необходим для преодоления термосопротивления системы сепарации клеток процессора и нагрева ротора во время центрифугирования. Запрограммированный терморегулятор будет поддерживать оптимальную целевую температуру внутри аппарата для обработки клеток во время процедуры, особенно при центрифугировании, при температуре в чистом помещении +18 °C.
      1. Настройте процессор клеток с первой фазой предварительного охлаждения для охлаждения процессора (без комплекта процессора клеток) до +3 °C в течение 30–45 мин, а вторая фаза предварительного охлаждения при запуске процессора клеток должна осуществляться с комплектом, предварительно охлажденным до +4 °C при 134 x g в течение 5 мин.

2. Подсчет концентрации взвешенных частиц в воздухе

  1. Оцените соответствие охлаждающего устройства требованиям GMP к чистым помещениям согласно стандарту ISO 14644-1 для анализа влияния тепловыделяющих устройств во время рабочего режима.
  2. Используйте мониторинг концентрации частиц для подтверждения достижения требуемого уровня чистоты в критических контрольных точках в состоянии покоя и в рабочем режиме.
    1. Минимальное количество точек отбора проб зависит от измеряемой площади. Рассчитайте его по формуле:
      figure-protocol-1
      ​где A — площадь чистого помещения или зоны с контролируемым чистым воздухом в м2, а NL — количество точек отбора проб, округленное в большую сторону до целого числа.
    2. Объем отбора проб воздуха представляет собой минимальный объем в каждой точке. Убедитесь, что объем воздуха достаточно велик для подсчета 20 частиц максимально допустимого размера. Рассчитайте объем отбора проб воздуха по формуле:
      V= 20/C x 100
      где V — минимальный объем единичной пробы на одну точку, выраженный в L, а C — предельное значение для данного класса (количество частиц/м3).
    3. Для каждой точки, в зависимости от площади, используйте одну или несколько проб. Убедитесь, что минимальный объем пробы в каждой точке составляет 2 L, а минимальное время отбора составляет не менее 1 min.
  3. Перед отбором проб продуйте счетчик частиц через фильтр продувки. Снимите фильтр и установите изокинетический зонд для отбора проб.
  4. Разместите счетчик частиц в определенной точке отбора проб. Запустите сбор проб с главного экрана устройства.
  5. По завершении отбора проб переместите счетчик частиц к следующей точке. После завершения отбора проб во всех точках проанализируйте данные и распечатайте отчет.
  6. Если средняя концентрация частиц во всех точках отбора проб в данной зоне ниже предельного значения класса, указанного в Таблице 1, считайте, что помещение прошло проверку по допустимой концентрации частиц.

3. Приготовление градиента и процедура разделения клеток

  1. Перед началом эксперимента предварительно охладите градиенты низкой и высокой плотности, а также наборы для процессора клеток в течение ночи при +4 °C в холодильнике.
  2. Предварительно охладите процессор клеток в течение 45 мин в режиме покоя (т. е. включите процессор клеток перед использованием). Поддерживайте температуру в диапазоне от +2 °C до +5 °C. Установите предварительно охлажденный при +4 °C набор для процессора клеток.
  3. Для стандартного охладителя градиентов с двойной рубашкой и этиловым охлаждением (опционально; Рисунок 3) соедините две стеклянные камеры и поместите их на магнитную мешалку. Зафиксируйте трубку между двумя камерами зажимом. Охладите прибор для создания градиента с помощью чиллера с циркуляцией этанола при 0 °C.
  4. Сначала подготовьтесь к загрузке тяжелого слоя в нижнюю часть пакета, заполнив камеру 130 mL градиента высокой плотности (HD; 1.087 g/mL). Загрузку проводите при скорости насоса 150 mL/min.
  5. После того как градиент высокой плотности окажется в пакете, добавьте 130 mL градиента высокой плотности (HD) в передний стакан и 140 mL градиента низкой плотности (LD; 1.063 g/mL) в задний (зажим закрыт).
  6. Снимите гемостат/зажим между двумя камерами и создайте непрерывный градиент при скорости насоса 50 mL/min.
  7. Заранее подготовьте мононуклеарные клетки лейкоцитарного слоя человека для очистки из нескольких объединенных анонимных лейкоцитарных слоев, полученных из отходов цельной крови (40 mL — 60 mL цельной крови добавляли в 10 пакетов с лейкоцитарным слоем), в зависимости от наличия материала в банке крови.
    1. Выделение МНК
      1. Для изоляции мононуклеарных клеток человека низкой плотности используйте центрифугирование в градиенте плотности. Для этого выполните следующие шаги.
      2. Для подготовки клеток рассчитайте объем крови (антикоагулированной цельной крови или суспендированного лейкоцитарного слоя). Разбавьте кровь буферным раствором в соотношении 2x-4x путем перемешивания инверсией. Чем сильнее разведена кровь, тем выше чистота мононуклеарных клеток.
      3. Приготовьте буфер, смешав фосфатный буфер с антикоагулянтом. Рассчитайте количество необходимых пробирок, разделив объем крови на 35 mL, и налейте в каждую пробирку 15 mL раствора градиента плотности 1.073.
      4. Постепенно наслоите 35 mL разведенной суспензии крови на градиент плотности, аккуратно пуская ее по поверхности градиента с помощью шприца объемом 60 mL с иглой; для малых объемов используйте пипетку. Старайтесь не нарушать границу раздела фаз, так как это приведет к плохому формированию мононуклеарного слоя.
      5. Центрифугируйте при 400 x g в течение 20 мин при 20 °C без перерывов (ускорение 0, замедление 0). После центрифугирования аккуратно соберите пограничный слой мононуклеарных клеток с помощью стерильной переносной пипетки. Перенесите клетки в другую новую коническую пробирку объемом 50 mL.
      6. Промойте клетки 2 раза буфером (PBS с добавлением антикоагулянта). При первой промывке долейте буфер в пробирку с клетками до объема 50 mL. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин при 20 °C для осаждения клеток (ускорение 9, замедление 0). Аккуратно удалите весь супернатант.
      7. Выполните вторую промывку для удаления тромбоцитов. Ресуспендируйте осадок в буфере до объема 50 mL. Центрифугируйте при 20-30 x g в течение 10 мин при 20 °C (ускорение 9, замедление 0).
      8. Доведите клетки до конечного объема 5 mL; эти клетки должны иметь удельную плотность, соответствующую МНК низкой плотности <1.073. Измерьте удельную плотность градиента с помощью денситометра.
      9. Ресуспендируйте осадок до конечного объема 10 mL, используя 95 mL среды градиента высокой плотности (1.083 g/mL), в переносном пакете. Используйте этот продукт для очистки с помощью сепаратора клеток. Конечный объем 10 mL содержит клетки и среду градиента высокой плотности 1.083.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Лейкоцитарный слой можно хранить в холодильнике в течение ночи в PBS, содержащем 0.5% BSA или аутологичной плазме. Лейкоцитарный слой также можно промыть.
  8. Сверху загрузите в сформированные градиенты не более 30 mL МНК, выделенных из лейкоцитарного слоя и суспендированных в 10 mL концентрированной консервирующей среды, используя перистальтический насос при скорости 25 mL/min. Поддерживайте градиент при +4 °C.
  9. Постоянно измеряйте температуру внутри процессора клеток с помощью предварительно откалиброванного термозонда. С помощью цифрового термоэлемента, подключенного к стерильному термозонду, контролируйте температуру градиентов и клеток в процессе работы.

4. Оптимизация различных этапов градиентного наложения

  1. Установите комплект для обработки клеток, предварительно охлажденный до +4 °C. Загрузите градиент высокой плотности (130 mL) при температуре +4.5 °C. По завершении загрузки градиента установите центрифугу на относительно низкую скорость (537 x g), чтобы минимизировать тепловыделение ротора.
  2. Выключите процессор для обработки клеток, чтобы гидравлическая система вернулась к исходному уровню и вышел воздух.
  3. Снова запустите процессор при 537 x g и добавьте градиенты высокой (130 mL) и низкой (140 mL) плотности для создания непрерывного градиента плотности при температуре +4.3 °C и скорости потока 50 mL/min.
  4. Загрузите лейкоцитарный слой (buffy coat) (30 mL) с 10 mL холодного раствора для хранения при температуре +6 °C и скорости потока 25 mL/min. Добавьте 50 mL (25 mL x 2) промывочного раствора.
  5. Через 5 min при температуре +5 °C соберите центрифугированный градиент в 12 флаконов при скорости потока 100 mL/min.
  6. Наполните пробирки промывочной средой (M19 + 20% человеческого альбумина + 10% пенициллина-стрептомицина). В первую пробирку внесите 10 mL промывочной среды и 150 mL клеток, в пробирки 2-12 — 225 mL промывочной среды и 25 mL клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сначала было количественно оценено влияние охлаждаемого процессора клеток на помещение чистого типа GMP. Стандартизированные методы включали использование счетчика частиц для измерения загрязнения воздуха частицами в помещениях чистого типа классов C и B по стандартам GMP в критических точках вблизи процессора клеток и системы охлаждения сжатого воздуха. Результаты показали, что вокруг оборудования не возникло турбулентности. Зарегистрированные данные продемонстрировали отсутствие избытка частиц размером 0,5 µm и 5 µm в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изоляторы островков по всему миру в течение десятилетий применяли очистку островков человека в перепрофилированном клеточном процессоре. Несмотря на то, что некоторые предприятия по производству островков продолжают перерабатывать островки в неохлажденном процессоре ячеек, большинство центров используют охлаждаемую версию процессора 10,11,15. Центры либо размещают процессор в холодном помещении, основным недостатком которого явл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Европейскому геномному институту диабета (ANR-10- LABEX-0046 to FP) и Катарскому институту метаболизма - Медицинской корпорации Хамад, Катар. Авторы также благодарят Медицинский исследовательский центр при Медицинской корпорации Хамад за поддержку сборов за обработку статей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Оборудование
Счетчик частиц воздухаLasair III 
AirJet XR40 Система SP ScientificFTS XR40
Шкаф биобезопасностиThermo ScientificEQ-1301
Циркуляционный охлаждающий чиллерJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Конический охлаждающий поддонBiorepCCT-01
Градиентный генератор с двойной оболочкой индивидуальный в доме
KJT-термопара ТермометрHanna InstrumentsHI93551NДля измерения температуры жидкостей
Магнитная мешалка Thermo Scientific88880014
Перистальтический насос Термометр MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430Для температуры COBE
Безводная ванна с шарикамиCole-Parmer10122-00
Материалы и реагенты
BD набор для перечисления стволовых клетокBD Biosciences 
COBE 2911 Набор трубокTerumo BCT90819
Конические трубки 250 млCorning430776
Градиентная плотность 1.1Biochrom L6155
Флаконы одноразовые градуированныетермофишеры382019-1000
Альбумин человеческий 20% Кедрион Биофарма 8091600
M199 моющий раствор Corning 99-784-CM 
Трубки Masterflex96400-6
Медицинский сухой воздухLinde HealthcareMedi On 22
Карандашлин-стрептомицин Gibco 
ТермозондBiorepTC-02Термосенсор
Trypan blue Сигма Олдрич15250061
Висконсинский университет в Белзере (UW) Мост Жизни RM/N 4055Среда для консервации
34456315140122

Ссылки

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Охлаждаемый процессор для клетокочистка методом градиента плотностижизнеспособность островков человекаоборудование для клеточной терапиистандарты GMP для чистых помещенийфракция мононуклеарных клетокэтап центрифугированияоценка содержания взвешенных частицизмерение жизнеспособности клеток
Оценка влияния новой процессорной системы охлаждающей ячейки на изоляцию островковых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.