Method Article

Оценка влияния новой процессорной системы охлаждающей ячейки на изоляцию островковых клеток

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол здесь описывает пользовательскую систему процессора охлаждающей ячейки, совместимую с чистой комнатой надлежащей производственной практики (GMP) для улучшения жизнеспособности ячейки после обработки.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартное оборудование для клеточной терапии, включая золотой стандартный клеточный процессор для очистки островков человека для клинической трансплантации, редко охлаждается, потенциально подвергая клетки воздействию повышенных температур на этапе центрифугирования. Индивидуальные системы охлаждения имеют прямое преимущество для жизнеспособности и функционирования островков человека. Данное исследование было разработано с целью проверки эффективности недавно разработанной, легкодоступной системы охлаждения процессора ячеек, требующей минимальных модификаций, а также для оценки ее влияния на жизнеспособность клеток человека и окружающую среду в чистых помещениях GMP. Система охлаждения, представляющая собой механически охлаждаемый теплообменник с температурой -30 °C, использовалась для подачи охлажденного медицинского сухого воздуха в чашу процессора ячеек через отверстие, просверленное в крышке центрифуги. В связи с ограниченным количеством доноров поджелудочной железы в Катаре, валидация системы проводилась с непрерывной очисткой с градиентом плотности объединенной охристой оболочки костного мозга человека. Стерильность, турбулентность и количество частиц измерялись в чистых помещениях классов C и B. Турбулентность вокруг охлаждаемого процессора ячеек не возникала, а также не образовывались избыточные частицы размером 0,5 мкм и 5 мкм в воздухе в соответствии со стандартами GMP для чистых помещений. В начале и в конце стадий сбора температура повышалась соответственно до 21,50 °C ± 0,34 °C и 21,93 °C ± 0,20 °C в процессоре без охлаждения и только до 10,9 °C ± 0,17 °C и 11,16 °C ± 0,35 °C в процессоре с охлаждаемыми ячейками (p <0,05). Охлаждаемый процессор ячеек привел как к улучшению восстановления (98%) фракции мононуклеарной ячейки, так и к жизнеспособности (100% ± 2%) постобработки. Новая система охлаждения эффективно снижает тепло, выделяемое процессором ячеек, не оказывая при этом воздействия твердых частиц на окружающую среду чистого помещения GMP. Описанный здесь процессор с охлаждаемыми элементами представляет собой недорогой (16 000 долларов США без учета налогов, таможенного оформления и транспортировки) и минимально инвазивный метод обеспечения надежного охлаждения. В настоящее время эта технология в центре клеточной терапии GMP применяется для выделения и трансплантации островковых клеток человека для клинической программы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация островков при тяжелом диабете 1 типа может восстановить эндогенную секрецию инсулина и стала стандартом лечения в ряде стран1. Выделение островков – это многоступенчатая процедура, которая включает в себя теплое ферментативное и механическое сбраживание поджелудочной железы с последующим охлаждением фаз для восстановления переваренной ткани и очищение островков с непрерывными или прерывистыми градиентами плотности на клеточном процессоре. Быстрое охлаждение замедляет фазу ферментативного переваривания и защищает островки от пищеварительных ферментов, высвобождаемых в результате загрязнения ацинарных клеток. Клеточный процессор изначально был разработан для разделения компонентов клеточной крови при температуре окружающей среды2. Он был перепрофилирован для очистки островков поджелудочной железы человека в 1989 году3. В течение трех десятилетий островки человека очищались для клинических испытаний и, в последнее время, стандарта лечения, либо в клеточном процессоре с прерывистыми градиентами4, либо в непрерывных градиентах плотности1 сделанных с помощью градиентного maker1 или эквивалентного компьютерного миксера5,6,7. Другие группы сообщали об очистке островков от крупных млекопитающих и людей с использованием больших цилиндрических пластиковых бутылок8,7,9, что значительно улучшило эффективность очистки и качество островков.

Действительно, учитывая золотой стандарт очистки островков человека для клинической трансплантации10,11, изготовленный клеточный процессор был без охлаждения. Прямым следствием отсутствия охлаждения стало то, что островки подвергались воздействию повышенных температур на этапе очистки. Во время центрифугирования происходит неконтролируемое повышение температуры из-за механического трения ротора12,13. Клеточные процессоры были адаптированы с помощью системы охлаждения в центрах изоляции островков, которая статистически увеличивала индуцированную глюкозой секрецию инсулина и жизнеспособность клеток, подтверждая преимущество сохранения островков поджелудочной железы при низких температурах во время процедуры очисткиsup class="xref">15.

Следует отметить, что в конце 1980-х годов было построено 10 рефрижераторных прототипов для уменьшения повреждения островков во время градиентной очистки плотности, но они больше не привлекли внимания. Прототипы процессоров ячеек были основаны на шпиндельном и барабанном охлаждении охлажденным полиэтиленгликолем. В частности, растворы для очистки островков, включая растворы для сохранения органов и градиенты плотности полисахаридов, могут быть вредны для жизнеспособности островков при использовании при комнатной температуре или выше 16,17,18. Проведено сравнение различных стратегий охлаждения процессора ячеек для очистки островковых клеток с оригинальным неохлаждаемым процессором ячеек для борьбы с неконтролируемым повышением температуры, возникающим из-за трения ротора. Было предпринято несколько попыток охладить клеточный процессор во время очистки островков человека. Процессор ячейки может быть временно или постоянно размещен в специально спроектированном холодном помещении для поддержания температуры 0-8 °C19 во время градиентного центрифугирования, которое в настоящее время используется в центрах изоляции островков в Университете Иллинойса в Чикаго19, Университет Майами14, Оксфордский университет facilities15, и Университет Сан-Франциско (специальный блок охлаждения заключает в себя процессор ячейки). Другая модификация включает в себя охлаждение ядра шпинделя процессора с системой охлаждения с использованием жидкого азота с электронным управлением в Женеве, Швеции и Чешской Республике15,19. Другой альтернативой в середине 2000 года было охлаждение ядра процессора с помощью кондиционера12 или жидкостное охлаждение шахты в Университете Лилля.

Модификации системы охлаждения процессора ячеек недоступны и сопряжены с рисками (влажность, накопление конденсата) в чистых помещениях GMP, включая потерю гарантии и отказ производителя обслуживать машину. Следовательно, некоторые островные центры, включая Милан (Италия), Осло (Норвегия) и Эдинбург (Шотландия), не используют систему охлаждения для процессоров ячеек во время процесса очистки островков15.

Данное исследование было разработано для проверки эффективности недавно разработанного легкодоступного кулера в сочетании с минимально модифицированной системой процессора ячеек. Вкратце, описанный здесь воздухоохладитель представляет собой теплообменник с механическим охлаждением, контролирующий температуру сухого газа в диапазоне от -40 °C до -100 °C в минуту на уровне 1 стандартного кубического фута в минуту (SCFM). Эта система охлаждения требует подачи сухого медицинского воздуха. Воздух будет проходить через трубопровод и теплообменник и выходить через сопло (7,9 мм). Нагреватель, расположенный внутри сопла, подает тепло для контроля температуры воздушного потока. Была приобретена запасная цельнопластиковая крышка центрифуги, а также произведены минимальные доработки. В крышке просверливалось отверстие диаметром 13,3 мм, и охлажденный воздух подавался из сопла охладителя к процессору ячейки через отверстие в крышке центрифуги. Охлажденный медицинский воздух впрыскивался внутрь центрифугирующей чаши клеточного процессора при постоянном контроле температуры жидкостей или градиентов плотности.

Мы оценили технические характеристики охлаждаемого процессора и влияние охлаждающего элемента на среду чистого помещения GMP. Основное внимание уделялось достижению устойчиво низкой (<10 °C) температуры во время очистки островков человека для сохранения жизнеспособности. Используя разделение по плотности охристой оболочки в качестве прокси для выделения островков, мы определили эффективность этого протокола охлаждения на жизнеспособность клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе использовалась выброшенная цельная кровь, не пригодная для использования в соответствии с рекомендациями учреждения по утилизации. Одобрение и информированное согласие IRB не применяются.

1. Настройка процессора с охлаждаемой ячейкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в чистых помещениях, и персонал должен соблюдать правила ношения одежды в чистых помещениях.

  1. Покупка оборудования
    1. Приобретите запасную крышку из плексигласа. Приобретайте систему охлаждающего оборудования, охладитель с механически охлаждаемым регулятором потока газа, осушитель воздуха, регулятор давления и расхода, а также гарантию (опционально). Ссылки см. в Таблице материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая стоимость составляет $16,133 без учета транспортных и таможенных сборов.
    2. Закажите медицинский сухой воздух, сжатый медицинский газ, соответствующий стандартному классу (номер Европейской фармакопеи 1238) у местного поставщика медицинских газов. Приобретите 2 баллона по 6,8м3 (47 л: 23 см x 153 см; диаметр x длина).
  2. Настройка оборудования (Рисунок 1 и Рисунок 2)
    1. Войдите в оборудование в чистом помещении GMP (продезинфицируйте перед входом в чистое помещение в соответствии с процедурами GMP.
    2. Для подачи сжатого воздуха медицинского назначения установите газопровод вместо того, чтобы размещать газовый баллон непосредственно в чистом помещении.
  3. Модификация процессора ячейки для охлаждения
    1. Сначала снимите крышку из плексигласа. Сохраните оригинальную крышку из плексигласа на случай возникновения проблем с гарантией. Просверлите отверстие в запасной крышке процессора ячеек с диаметром, совпадающим и подходящим по наружному диаметру наконечника сопла охлаждающего устройства, чтобы предотвратить растрескивание крышки центрифуги (рекомендуется 13,3 мм).
    2. Закрепите скобы вместе с помощью круглого куска пенопласта. Это делается для предотвращения поломки и/или царапин крышки, для удержания сопла охладителя на месте над процессором ячейки, для защиты крышки от чрезмерного изгиба из-за высокого давления впрыскиваемого воздуха, для поддержки веса сопла и, наконец, для обеспечения максимальной безопасности оператора, чтобы иметь свободный и безопасный доступ ко всем необходимым функциям процессора ячейки во время экспериментальной процедуры.
    3. Подключите систему охлаждения к процессору ячейки, прикрепив охлаждающую форсунку к отверстию в оргстекле. Закрепите его скобами и поролоновыми подушками.
    4. Разместите корпус холодильника на расстоянии до 8 футов (2,44 м) от форсунки. Разместите регулятор температуры в отдельном шкафу и разместите его в пределах 6 футов (1,83 м) от холодильного корпуса.
    5. Установите уставку охладителя на -40 °C для охлаждения воздушного потока на охладителе. Температура воздуха на выходе постоянно отображается на цифровом индикаторе с точностью до 0,1 °C. Установите температуру на выходе в цифровом виде на 0,1 °C с помощью терморегулятора.
    6. Контролируйте давление и расход подаваемого воздуха на модуле регулятора давления и расхода (Рисунок 2) перед подачей в охладитель. Установите их на 55 фунтов на квадратный дюйм и 4 скорости потока SCFM соответственно, чтобы достичь оптимальных условий на воздушном потоке, охлажденном до -30 °C ± 2 °C.
    7. Убедитесь, что подача медицинского газа регулируется на выходе 5 бар и может длиться не менее 90 минут, так как это необходимо для того, чтобы сжатый воздух достиг -30 °C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Медицинский сухой воздух - это сжатый медицинский газ, а сухой воздух под полным давлением соответствует стандартному классу.
    8. Подайте давление 5 бар от сопла охладителя, соединенного с крышкой процессора ячейки, через отверстие, просверленное в крышке центрифуги. Введите охлажденный медицинский воздух внутрь центрифугирующей чаши клеточного процессора (Рисунок 2). Выберите положение впрыска воздуха таким образом, чтобы охлажденный воздух был направлен перпендикулярно алюминиевому ободу ротора центрифуги.
    9. При подготовке процессора элемента убедитесь, что ротор имеет комнатную температуру (18 °C). Установите автоматический терморегулятор системы охлаждения на -30 °C и направьте нагнетание холодного воздуха на ротор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные условия испытаний были протестированы для достижения оптимального температурного градиента +4 °C, что необходимо для преодоления термостойкости системы сепаратора ячеек и нагрева ротора во время центрифугирования. Запрограммированный терморегулятор будет поддерживать оптимальную целевую температуру внутри машины для обработки клеток во время процедуры, особенно во время центрифугирования, при температуре чистого помещения +18 °C.
      1. Настройте процессор ячейки с первой фазой предварительного охлаждения для охлаждения процессора (без комплекта процессора ячейки) при температуре +3 °C в течение 30-45 минут, а вторая фаза предварительного охлаждения процессора должна быть с комплектом, предварительно охлажденным при +4 °C при 134 x g, в течение 5 минут.

2. Количество твердых частиц в воздухе

  1. Оценка соответствия охлаждающего устройства условиям чистых помещений GMP в соответствии со стандартом ISO 14644-1 для оценки воздействия тепловых приборов на этапе эксплуатации.
  2. Используйте мониторинг количества частиц, чтобы получить доказательства того, что требуемый уровень чистоты достигнут в критических контрольных точках в состоянии покоя и во время работы.
    1. Минимальное количество мест отбора проб зависит от измеряемой площади. Рассчитайте это с помощью формулы
      figure-protocol-1
      где A — площадь чистой комнаты или пространства с контролем чистого воздуха вм2, а NL — количество мест отбора проб, округленное до целого числа.
    2. Объем отбора проб в воздухе — это минимальный объем в каждом месте. Убедитесь, что объем воздуха достаточен для подсчета 20 частиц с наибольшим размером частиц. Рассчитайте объем отбора проб в воздухе с помощью уравнения
      V= 20/C x 1000
      где V — минимальный объем одной пробы на место, выраженный в L, а C — предел класса (количество частиц/м3).
    3. Для каждого местоположения, в зависимости от местности, используйте один или несколько образцов. Убедитесь, что минимальный объем отбора проб в каждом месте составляет 2 л, а минимальное время отбора проб составляет не менее 1 минуты.
  3. Перед отбором проб продуйте устройство счетчика частиц с помощью продувочного фильтра. Снимите фильтр и установите его с помощью изокинетического зонда для отбора проб.
  4. Поместите прибор для измерения частиц в указанное место отбора проб. Начните отбор проб с главного экрана устройства подсчета частиц.
  5. После завершения отбора проб отнесите устройство для подсчета частиц к следующему месту. Когда все местоположения для выборки будут готовы, просмотрите данные и распечатайте отчет.
  6. Когда средняя концентрация частиц для всех точек отбора проб в данной зоне опускается ниже предельного значения, указанного в таблице 1, учитывайте, в каком помещении установлена допустимая концентрация частиц.

3. Подготовка градиента и обработка разделения клеток

  1. Перед экспериментом предварительно охладите легкий и тяжелый градиенты плотности и комплекты процессоров ячеек в течение ночи при температуре +4 °C в холодильнике.
  2. Предварительно охладите процессор элемента в течение 45 минут в состоянии покоя (т. е. включите процессор элемента перед использованием). Поддерживайте температуру в диапазоне от +2 °C до +5 °C. Вставьте комплект процессора в предварительно охлажденный до +4 °C.
  3. Для стандартного охлаждаемого этанолом градиентного генератора с двойной рубашкой (опционально; Рисунок 3) Соедините 2 стеклянные камеры и поместите их на магнитную мешалку. Зажмите трубку между 2 камерами. Охладите градиентную машину с помощью охлаждающего охладителя с циркуляцией этанола до 0 °C.
  4. Во-первых, подготовьтесь к загрузке тяжелого слоя на дно мешка, заполнив камеру 130 мл градиента большой плотности (HD; 1,087 г/мл). Загрузка при скорости насоса 150 мл/мин.
  5. Когда тяжелый градиент будет в пакете, добавьте 130 мл градиента высокой плотности (HD) в переднюю мензурку и 140 мл градиента низкой плотности (LD; 1,063 г/мл) в заднюю часть (зажим закрыт).
  6. Снимите зажим с гемостата/зажима между 2 камерами и создайте непрерывный градиент со скоростью насоса 50 мл/мин.
  7. Заранее подготовьте человеческие мононуклеарные клетки оболочки для очистки от множественных объединенных анонимных оболочков баффи, собранных из продуктов жизнедеятельности цельной крови (на 10 пакетиков с оболочкой было добавлено от 40 мл до 60 мл цельной крови) в зависимости от наличия в банке крови.
    1. Разделение МНК
      1. Используйте центрифугирование с градиентом плотности для выделения мононуклеарных клеток человека низкой плотности. Для этого выполните действия, описанные ниже.
      2. Для клеточного препарата рассчитайте объем крови (антикоагулированная цельная кровь или суспензия охристой шерсти). Разбавьте кровь буферным раствором 2х-4х путем смешивания инверсии. Чем больше разбавлена кровь, тем лучше чистота мононуклеарных клеток.
      3. Приготовьте буфер, смешав фосфатный буфер с антикоагулянтом. Рассчитайте необходимое количество пробирок, разделив объем крови на 35 мл и налив в каждую пробирку 15 мл градиентного раствора плотности 1,073
        4. .
      4. Постепенно нанесите 35 мл разбавленной кровяной суспензии на градиент плотности, осторожно проводя по поверхности градиента плотности с помощью шприца объемом 60 мл, соединенного с иглой; для небольших объемов используйте пипетку. Старайтесь не нарушать интерфейс интерфейса, так как это приведет к плохому мононуклеарному слою.
      5. Центрифуга при 400 x g в течение 20 мин при 20 °C без перерывов (ускорение 0, замедление 0). После центрифугирования аккуратно соберите приземный слой мононуклеаров с помощью стерильной трансферной пипетки. Переложите клетки в другую новую коническую пробирку объемом 50 мл.
      6. Промойте клетки 2 раза буфером (PBS с добавлением антикоагулянта). Для первого промывки заполните пробирку, содержащую клетки, буфером до 50 мл. Центрифугируйте при 300 х g в течение 10 мин при 20 °C к пеллетным ячейкам (ускорение 9, замедление 0). Аккуратно удалите всю надосадочную жидкость осторожно.
      7. Проведите второе промывание для удаления тромбоцитов. Суспендируйте гранулу до объема 50 мл с буфером. Центрифугируйте при 200-300 x g в течение 10 мин при 20 °C (ускорение 9, ускорение 0).
      8. Восстановите клетки до конечного объема 5 мл, эти элементы должны иметь удельный вес, напоминающий MNC низкой плотности <1,073. Измерьте удельную плотность градиента с помощью денсиометра.
      9. Ресуспендируйте гранулу до конечного объема 100 мл с 95 мл градиентной среды высокой плотности (1,083 г/мл) в пакете для переноса. Используйте этот продукт для очистки с помощью сепаратора клеток. Конечный объем в 100 мл содержит клетки и 1,083 градиентной среды высокой плотности.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Охристую шерсть можно хранить в холодильнике в течение ночи в PBS, содержащей 0,5% BSA или аутологичной плазмы. Охристую шерсть также можно стирать.
  8. Сверху загрузите предварительно сформированные градиенты максимум 30 мл MNC, выделенных из охристого слоя, взвешенного в 100 мл концентрированной консервационной среды с помощью перистальтического насоса со скоростью 25 мл/мин. Поддерживайте градиент на уровне +4 °C. Поддерживайте градиент на уровне +4 °C.
  9. Непрерывно измеряйте температуру внутри процессора ячейки с помощью предварительно откалиброванного термозонда. С помощью цифровой термопары, подключенной к стерильному термозонду, контролируйте температуру градиентов и клеток во время процесса.

4. Оптимизация различных ступеней градиентной загрузки

  1. Вставьте комплект процессора ячейки, предварительно охлажденный до +4 °C. Загрузите тяжелый градиент (130 мл) при температуре +4,5 °C. В конце градиентной загрузки установите центрифугу на относительно низкую скорость (537 x g), чтобы свести к минимуму тепло, выделяемое ротором.
  2. Выключите процессор ячеек, чтобы гидравлическая система вернулась к предварительному уровню и выпустила воздух.
  3. Перезагрузите процессор при 537 x g и добавьте большой (130 мл) и низкий (140 мл) градиенты плотности, чтобы создать непрерывный градиент плотности при +4,3 °C и скорости потока 50 мл/мин.
  4. Загрузите в buffy coat (30 мл) 100 мл охлаждающей среды при температуре +6 °C и расходе 25 мл/мин. Добавьте 50 мл (25 мл x 2) моющего раствора.
  5. Через 5 мин при +5 °C соберите градиент прядения в 12 флаконов со скоростью потока 100 мл/мин.
  6. Наполните пробирки промывочным материалом (M199 + 20% человеческий альбумин + 10% пенициллин стрептомицин). Заполните пробирку 1 100 мл промывочного средства и 150 мл ячеек 2-12, а пробирки 2-12 - 225 мл промывочного средства и 25 мл клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сначала было количественно оценено влияние охлаждаемого процессора на чистое помещение GMP. В стандартизированных методах использовался счетчик частиц, измеряющий загрязнение воздуха частицами в чистых помещениях класса C и класса B класса GMP в критических точках в непосредственной близости от процессора ячейки и системы охлаждения сжатого воздуха. Результаты показали, что турбулентность вокруг оборудования не развивалась. Зарегистрированные данные показали, что не было превышения частиц в воздухе в размере 0,5 мкм и 5 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляторы островков по всему миру в течение десятилетий применяли очистку островков человека в перепрофилированном клеточном процессоре. Несмотря на то, что некоторые предприятия по производству островков продолжают перерабатывать островки в неохлажденном процессоре ячеек, большинство центров используют охлаждаемую версию процессора 10,11,15. Центры либо размещают процессор в холодном помещении, основным недостатком которого явл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность Европейскому геномному институту диабета (ANR-10- LABEX-0046 to FP) и Катарскому институту метаболизма - Медицинской корпорации Хамад, Катар. Авторы также благодарят Медицинский исследовательский центр при Медицинской корпорации Хамад за поддержку сборов за обработку статей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>Оборудование
Счетчик частиц воздухаLasair III 
AirJet XR40 Система SP ScientificFTS XR40
Шкаф биобезопасностиThermo ScientificEQ-1301
Циркуляционный охлаждающий чиллерJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Конический охлаждающий поддонBiorepCCT-01
Градиентный генератор с двойной оболочкой индивидуальный в доме
KJT-термопара ТермометрHanna InstrumentsHI93551NДля измерения температуры жидкостей
Магнитная мешалка Thermo Scientific88880014
Перистальтический насос Термометр MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430Для температуры COBE
Безводная ванна с шарикамиCole-Parmer10122-00
Материалы и реагенты
BD набор для перечисления стволовых клетокBD Biosciences 
COBE 2911 Набор трубокTerumo BCT90819
Конические трубки 250 млCorning430776
Градиентная плотность 1.1Biochrom L6155
Флаконы одноразовые градуированныетермофишеры382019-1000
Альбумин человеческий 20% Кедрион Биофарма 8091600
M199 моющий раствор Corning 99-784-CM 
Трубки Masterflex96400-6
Медицинский сухой воздухLinde HealthcareMedi On 22
Карандашлин-стрептомицин Gibco 
ТермозондBiorepTC-02Термосенсор
Trypan blue Сигма Олдрич15250061
Висконсинский университет в Белзере (UW) Мост Жизни RM/N 4055Среда для консервации
34456315140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles