Method Article

Одновременное обнаружение различных классов антител в мультиплексном серологическом тесте

DOI:

10.3791/65323

⸱

July 14th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехканальная двухрепортерная система флуоресцентного анализа потока была использована для разработки мультиплексного иммуноанализа на основе шариков, который одновременно оценивает образцы сыворотки крови на IgG и IgM, выявленные против нескольких антигенов различных видов боррелий , вызывающих боррелиоз Лайма в Европе и Северной Америке.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для мониторинга прогрессирования инфекционных заболеваний полезно оценивать иммунореактивность в отношении различных антигенных детерминант и измерять различные изотипы антител, поскольку они появляются на разных стадиях иммунного ответа хозяина. При боррелиозе Лайма возбудителем может быть один из многочисленных представителей вида Borrelia . Поэтому для правильной классификации образцов необходимо оценить иммунореактивность к различным антигенам разных видов Borrelia . Кроме того, антипатогенные ответы IgG и IgM могут иметь различную продолжительность эликции во время прогрессирования заболевания. В данной работе мы демонстрируем разработку двухрепортерного мультиплексного иммуноанализа, который может быть полезен для выявления боррелий-специфического иммунного ответа в образцах сыворотки крови человека путем одновременной оценки иммунореактивности IgG и IgM против различных бактериальных антигенов в одной и той же реакционной яме. Этот подход с двумя репортерами сохраняет аналитическую производительность методов с одним репортером, экономя при этом время и ресурсы и снижая требования к размеру выборки. Этот анализ позволяет практически удвоить серологическую информацию, полученную из образца крови, в два раза быстрее.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Боррелиоз Лайма является наиболее распространенным инфекционным заболеванием, переносимым клещами, в умеренном климате северного полушария1. Он вызывается бактериями-спирохетами рода Borrelia, с пятью известными патогенами человека, которые различаются по географическому распространению2. Основными патогенными видами Borrelia в Европе являются B. afzelii и B. garinii, реже встречаются B. burgdorferi s.s., B. spielmanii и B. bavariensis. В Северной Америке B. burgdorferi s.s. является единственным возбудителем боррелиоза Лайма 2,3. Возбудители боррелий передаются представителями рода клещей Ixodes, причем передача может произойти в течение 24 часов после укуса клеща4.

Диагноз боррелиоза Лайма, как правило, ставится по клиническим симптомам и впоследствии подтверждается серологическим исследованием. Как в Европе, так и в Северной Америке диагностические руководства рекомендуют двухэтапную серию тестов, состоящую из иммуноферментного анализа (ИФА) с рефлекторным иммуноблоттингом для оценки ответа антител против специфических антигенов Borrelia 1,5,6,7,8,9 . Однако этот подход недостаточно чувствителен и является неоптимальным, особенно на ранней стадии инфекции, когда сероконверсия может быть неполной, а титры антиборрелийных IgG и IgMслишком низкими.

Мультиплексные иммуноанализы улучшают традиционные иммунологические анализы, которые измеряют только одну мишень за раз, и могут одновременно оценивать множественные ответы изотипа антител против одного или нескольких антигенов 10,11,12. Такие анализы, как ИФА, ограничиваются идентификацией и количественным определением одного аналита за одну реакцию, в данном случае либо циркулирующий IgG, либо IgM, индуцированный против одного бактериального антигена после инфицирования боррелиями. В этом отчете показано использование технологии профилирования аналитов на основе шариков для разработки мультиплексного иммуноферментного анализа, который одновременно обнаруживает антитела IgG и IgM к любому из выбранных здесь антигенов Borrelia в образцах сыворотки крови человека. Мы отобрали четыре антигена, которые в совокупности охватывают наиболее распространенные патогенные виды Borrelia, произрастающие в Европе (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) и Северная Америка (B. burgdorferi s.s.) (Таблица 1) 2,3. Это позволяет проводить решающую идентификацию патогенов и различать раннюю иммунореактивность IgM и более поздние, более стойкие, иммунореактивность IgG в образцах пациентов.

Целевой изотипКанал «Репортер»АнтигенВиды боррелийНапряжениеКонцентрация антигенной связи
IgMПЭОспКБ. garinii200475,0 мкг/106 бусин
IgGБВ421ВлсЭB. burgdorferi s.sВ311,25 мкг/106 бусин
IgGБВ421DbpAB. burgdorferi s.s.ЗС710,0 мкг/106 бусин
IgGБВ421DbpAБ. afzeliiPKo5,0 мкг/106 бусин

Таблица 1: Репрезентативные антигены боррелий, используемые для разработки мультиплексного анализа.

Первоначально мы разработали однорепортерный иммуноанализ, который выявлял антитела IgG или IgM к анти-боррелиям в двух отдельных реакциях, а затем объединили эти анализы в двухрепортерный мультиплексный анализ, который измеряет оба изотипа антител в одной и той же реакционной смеси. Магнитные шарики соединяют с интересующим антигеном-мишенью патогена, а затем инкубируют с образцами сыворотки крови пациента. Антиген, связанный с шариками, распознается и захватывает как циркулирующие IgG, так и IgM в сыворотке крови, которая образуется в результате иммунного ответа против этого патогенного антигена. Специфичность анализа IgG по сравнению с IgM определяется выбором вторичного антитела, которое связывается либо с IgG, либо с IgM, каждое из которых имеет отдельный флуорофорный сигнал, связанный с двумя вторичными антителами. Каждый флуоресцентный сигнал регистрируется в одном из двух репортерных каналов прибора (т.е. двойном репортере), который имеет разный возбуждающий лазер и захват излучения, специфичный для одного флуорофора, используемого для обнаружения IgG или IgM (в данном случае Brilliant Violet 421 или фикоэритрина, соответственно). Канал классификации прибора определяет краситель с цветовой кодировкой, присущий различным наборам валиков. Таким образом, несколько антигенов-мишеней могут быть соединены с по-разному окрашенными шариками, а наборы гранул смешиваются вместе и используются для комплексной оценки различных антипатогенных иммунореактивных веществ в образцах сыворотки. Классификационный канал идентифицирует каждый отдельный набор гранул (т.е. специфический антиген) и измеряет флуоресценцию, связанную с IgG или IgM по отношению к этому антигену. Полученный мультиплексный анализ экономит время и ресурсы по сравнению с менее комплексным классическим тестированием и точно каталогизирует иммунореактивность Лайма в ограниченных объемах образцов. В то время как аналогичный подход с двумя репортерами ранее использовался для категоризации иммунных ответов при других патологиях, таких как инфекция SARS-CoV-213, в этом отчете подробно описывается применение технологии мультиплексного флуоресцентного анализа для характеристики иммунореактивности при боррелиозе Лайма.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было получено соответствующее одобрение Институционального наблюдательного совета/Комитета по этике на использование образцов сыворотки крови человека в этой экспериментальной серии. Образцы представляли собой обезличенные остаточные материалы из немецкого национального исследования серопревалентности SARS-CoV-214. Разрешение на использование образцов на людях было выдано Комитетом по этике Высшей медицинской школы Ганновера, Германия (9086_BO_S_2020). Всего в данном исследовании был использован 21 образец сыворотки крови человека.

1. Этическое одобрение использования образцов на людях

  1. Получить соответствующие этические разрешения на использование образцов на людях.

2. Реактивы и оборудование

  1. Образцы сыворотки крови человека: Провести валидацию технического анализа и контроль качества с использованием образцов сыворотки крови лиц, у которых ранее был диагностирован боррелиоз Лайма, или у лиц с доказанным боррелиоотрицательным иммунным статусом12,14.
  2. Однорепортерное оборудование. Используйте двухканальный однорепортерный прибор (таблица материалов) для первоначальной разработки анализа и технической валидации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одноотчетная система имеет два лазера: 1) идентифицирует и количественно определяет флуоресценцию, специфичную для набора шариков, для различения различных наборов шариков, если она используется (канал классификации), и 2) обнаруживает и количественно определяет флуоресценцию специфичного для гранул фикоэритрина (ПЭ), связанную с гранулами, (канал репортера; возбуждение 532 нм, «оранжевое» излучение 565-585 нм). Таким образом, только один класс изотипов антител (например, IgG или IgM) может быть проанализирован за один раз с использованием одного репортерного канала.
    1. Проведение первичных валидационных исследований для оценки анти-боррелийных IgG и IgM по отдельности в однорепортерном 96-луночном формате, в котором используются реагенты для обнаружения ПЭ для обоих классов антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий анализ оценивает циркулирующие IgG, специфичные для антигена Borrelia VlsE и двух вариантов DbpA, а также циркулирующие IgM, специфичные для антигена OspC, в качестве репрезентативных примеров. Анализ может быть расширен для оценки иммунореактивности сыворотки по отношению к другим анти-боррелиям по желанию12.
  3. Приборы с двумя репортерами. Используйте трехканальный двухрепортерный прибор (таблица материалов), который позволяет проводить параллельный анализ IgG/IgM в одной и той же реакции, для разработки и технической валидации двойного анализа IgM/IgG (подробно описанного ниже). Этот прибор имеет 3 канала для обнаружения флуоресценции, из которых 2 являются репортерными каналами, которые оценивают целевые сигналы, связанные с Ig.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система с двумя репортерами имеет три лазера: 1) идентифицирует и количественно определяет флуоресценцию, специфичную для набора шариков (канал классификации); 2) обнаруживает и количественно оценивает целевую флуоресценцию фикоэритрина (ПЭ) (канал Reporter 1; возбуждение 532 нм, излучение «оранжевого» 565-585 нм) и 3) оценивает целевую флуоресценцию Brilliant Violet 421 (BV421) второго аналита-мишени (Reporter Channel 2; возбуждение 405 нм, «синее» излучение 421-441 нм). Система с двумя репортерами совместима как с 96-луночными, так и с 384-луночными микротитровыми планшетами (полуавтоматическая обработка). Общая схема анализа приведена на рисунке 1. Этапы протокола подробно описаны ниже.

3. Связывание антигенов

  1. Связывают антигены Borrelia с магнитными, карбоксилированными и флуоресцентными микросферами размером 6,5 мкм с цветовой кодировкой (шарики; Содержание материалов) с использованием химии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC)/сульфо-N-гидроксизукцинимида (sNHS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание можно найти в ссылках11и12. Концентрацию связывания каждого антигена найдите в таблице 1. Парные шарики следует хранить в темноте при температуре 4 °C до использования. Все буферы, используемые в реакциях связывания и обнаружения, подробно описаны в Дополнительных материалах.

4. Процедура анализа: серологический анализ IgG или IgM с одним репортером: 96-луночный формат

  1. Разбавляют образец в 2 этапа (2 этапа, оба в 96-луночных планшетах; 200-кратное разведение образца сыворотки в буфере для анализа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера для анализа представляет собой смесь 1:4 Low Cross Buffer: PBS, содержащую 1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина. Твин-20 добавляют в смесь до конечной концентрации 0,05 % (v/v).
    1. Этап разведения образца 1: Смешайте 5 мкл образца сыворотки со 120 мкл буфера для анализа (25-кратное разведение).
    2. Этап разведения образца 2: Разбавьте 25-кратное разведение образца дополнительно в 8 раз, смешав 10 мкл разведения с 70 мкл буфера для анализа, чтобы получить окончательное разведение образца в 200 раз.
  2. Магнитное разбавление шариковой смеси
    1. Приготовьте смесь для гранул, содержащую 1,0 × 106 гранул/мл на популяцию гранул (т.е. на один уникальный целевой антиген).
    2. Разбавьте приготовленную смесь гранул в 25 раз в пробирном буфере, чтобы окончательная концентрация гранул в этой разбавленной суспензии теперь составляла 4 × 104 шариков/мл на популяцию гранул (т.е. на уникальный целевой антиген).
  3. Инкубация образца сыворотки с шариками
    1. Пипетку 25 мкл разведенной связанной мультиплексной шариковой суспензии (содержащей 4,0 × 104 шариков/набор/мл) в назначенные лунки 96-луночной полуплощадной микротитровой пластины (таблица материалов).
    2. Добавьте 25 мкл 200-кратно разбавленного образца сыворотки (из шага 4.1 выше) в соответствующие лунки, содержащие 25 мкл суспензии связанных шариков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к дополнительному 2-кратному разведению, поэтому окончательное разведение образца сыворотки в лунке составляет 400 раз, а окончательное количество шариков составляет 1000 шариков / набор гранул / реакция 50 мкл.
    3. Накройте 96-луночную реакционную пластину микропланшетным уплотнением (клейкая пленка или пластиковые крышки планшетов).
    4. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при 20 °C при 750 об/мин на шейкере.
  4. Промывка бисера
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и осторожно снимите уплотнение клейкой пластины.
    2. Поместите 96-луночную реакционную пластину в пластинчатую шайбу.
    3. Промыть шарики три раза с помощью промывочного буфера объемом 100 мкл (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) с помощью автоматической промывочной машины с магнитными пластинами.
  5. Повторно суспендируйте вымытые шарики в 100 мкл буфера для промывки, накройте пластину клейкой пленкой или пластиковой крышкой пластины и встряхните пластину на шейкере в течение 1 минуты при 20 °C при 1000 об/мин.
  6. Разделите вымытые бусины
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и осторожно снимите уплотнение клейкой пластины.
    2. Смешайте реакции, пипетируя вверх и вниз пять раз, и перенесите 50 мкл из каждого реакционного объема 100 мкл на каждую из двух новых 96-луночных реакционных пластин, одну для обнаружения IgG и одну для обнаружения IgM.
  7. Инкубация антител/реагентов для обнаружения
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гранулы, связанные с целевым антигеном, были инкубированы с образцами сыворотки для извлечения циркулирующих антител в сыворотке (если они присутствуют), которые реагируют с антигеном (антигенами). Прореагировавшие шарики со связанным иммуноглобулином были разделены на две пластины, и IgG и IgM теперь обнаруживаются и количественно определяются в их отдельных планшетах с использованием изотип-специфических вторичных антител с меткой PE. Перемещение пластин в шахматном порядке на 20 минут.
    1. Отсасывайте надосадочную жидкость из лунок, содержащих магнитные шарики, с помощью магнитной пластинчатой шайбы.
    2. Для каждой пробирки приготовьте соответствующую смесь реагентов для обнаружения Ig (анти-IgG или анти-IgM), содержащую в буфере для анализа ПЭ-конъюгированный козий античеловеческий IgG (3 мкг/мл) или ПЭ-конъюгированный ослиный античеловеческий IgM (5 мкг/мл). Для каждой скважины, содержащей шарики, используется 30 мкл реагента для детектирования. Подготовьте достаточные объемы реагентов для обнаружения IgG и IgM для реакционных скважин с достаточным запасом для компенсации потерь при пипетировании.
    3. Пипетку 30 мкл реагента для детектирования IgG в каждую лунку, содержащую прореагировавшие шарики на пластине IgG, и накройте 96-луночную реакционную пластину уплотнением микропланшета.
    4. Пипетку 30 мкл реагента для обнаружения IgM в каждую лунку, содержащую прореагировавшие шарики на пластине IgM, и накройте 96-луночную реакционную пластину уплотнением из микропланшета.
    5. Инкубировать в течение 45 мин при 20 °C при встряхивании при 750 об/мин на шейкере.
  8. Промывка бисера
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и осторожно снимите уплотнение клейкой пластины.
    2. Поместите 96-луночную реакционную пластину в магнитную пластинчатую шайбу.
    3. Промойте шарики три раза с помощью промывочного буфера на 100 мкл с помощью шайбы с магнитной пластиной.
  9. Повторно суспендируйте гранулы в 100 мкл промывочного буфера.
  10. Проанализируйте результаты на одном репортерном инструменте.
    1. Накройте 96-луночную реакционную пластину микропланшетным уплотнением.
    2. Встряхните 96-луночную реакционную пластину в течение 3 минут при 20 °C при 1000 об/мин на шейкере.
    3. Переместите 96-луночную реакционную пластину из шейкера и поместите в однорепортерный анализатор потока (таблица материалов).
    4. Для каждого образца проанализируйте медианную интенсивность флуоресценции (MFI), используя следующие настройки прибора: Объем поглощения = 80 мкл, Количество = 50 на популяцию шариков, Тайм-аут = 60 с, Стробирование = 7 500-15 000)12,13.

5. Процедура анализа: серологический анализ IgG и IgM с двойным репортером: 96-луночный формат

  1. Разведение образца (2 этапа, оба в 96-луночных планшетах; 200-кратное разведение образца сыворотки в буфере для анализа)
    1. Этап разведения образца 1: Смешайте образец сыворотки 5 мкл с буфером для анализа 120 мкл (25-кратное разведение).
    2. Этап разведения образца 2: Разбавьте 25-кратное разведение образца еще в 8 раз, смешав 10 мкл первого разведения (25-кратное разбавление образца из раздела 5.1.1) с 70 мкл буфера для анализа (8-кратное разведение), чтобы получить окончательное разведение образца в 200 раз.
  2. Магнитное разбавление шариковой смеси
    1. Приготовьте смесь для гранул, содержащую 1,0 × 106 целевых антиген-связанных гранул/мл на популяцию шариков (т.е. на уникальный целевой антиген).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой экспериментальной серии мы оценили иммунореактивность IgG и IgM против четырех уникальных антигенов Borrelia в каждой реакции.
    2. Приготовленную смесь для шариков разбавить в 50 раз в пробирном буфере. Концентрация гранул в этой разбавленной суспензии в настоящее время составляет 2,0 ×10,4 гранул/мл на популяцию гранул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество шариков в реакции дуплексного анализа уменьшается вдвое по сравнению с количеством, используемым в реакции с одним репортером, чтобы обеспечить прямую сопоставимость между двумя анализами и сэкономить ресурсы, после того, как предварительные исследования подтвердили, что сигнал флуоресценции поддерживался в пределах линейного диапазона количественного определения при использовании половины количества шариков.
  3. Инкубация образца сыворотки с шариками
    1. Пипетку 25 мкл разбавленной суспензии, связанной с целевым антигеном, (содержащей 2,0 ×10 4 шариков/набор/мл) в предварительно назначенные лунки 96-луночной микротитровой пластины с половинной площадью. Точное количество реакционных лунок и их размещение на планшете зависит от общего количества исследуемых образцов, определяемого оператором, а также от того, будут ли использоваться одиночные или реплицирующие лунки для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные шарики, связанные с целевым антигеном, будут взаимодействовать с образцами сыворотки крови человека. Иммунореактивные IgG и IgM, если они присутствуют в образцах, связываются и иммобилизуются на одних и тех же антиген-связанных шариках. Затем количественное определение вторичных антител связанных IgG и IgM будет выполнено на одних и тех же шариках в одних и тех же реакциях с использованием разных флуорофоров для идентификации IgG и IgM, что позволит их дифференцировать.
    2. Добавьте 25 мкл 200-кратно разбавленной сыворотки (из шага 5.1 выше) в каждую лунку, содержащую 25 мкл смешанной суспензии гранул, связанных с целевым антигеном (этап 5.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к дополнительному 2-кратному разведению, поэтому окончательное разведение образца сыворотки в лунке составляет 400 раз, а окончательное количество шариков составляет 500 шариков / набор гранул / реакция 50 мкл.
    3. Накройте 96-луночную реакционную пластину уплотнением из микропланшета (клейкая фольга или пластиковая крышка планшета).
    4. Инкубируйте пластину с шариками в течение 2 ч при 20 °C, при 750 об/мин на шейкере.
  4. Промывание шариков (для удаления излишков образца сыворотки)
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и снимите клейкое уплотнение пластины.
    2. Поместите 96-луночную реакционную пластину в магнитную пластинчатую шайбу.
    3. Промойте шарики три раза с помощью промывочного буфера на 100 мкл с помощью шайбы с магнитной пластиной.
  5. Отсасывайте окончательный объем промывки из гранул после последнего этапа стирки.
  6. Обнаружение антител (Инкубация - Часть I)
    1. Изготовьте свежий реагент IgG и IgM с двойным обнаружением, содержащий биотинилированный козий античеловеческий IgG (1 мкг/мл) вместе с ПЭ-конъюгированным ослиным античеловеческим IgM (5 мкг/мл) в буфере для анализа. Для каждой скважины, содержащей шарики, используется 30 мкл реагента двойного обнаружения. Подготовьте достаточные объемы реагентов двойного обнаружения IgG и IgM для реакционных скважин с достаточным количеством дополнительных для компенсации потерь при пипетировании.
    2. Пипетку 30 мкл реагента IgG и IgM с двойным детектированием в каждую назначенную лунку и накройте 96-луночную реакционную пластину микропланшетным уплотнением.
    3. Инкубируйте планшет в течение 45 минут при 20 °C, встряхивая при 750 об/мин на шейкере.
  7. Промывка шариков (для удаления избыточных антител к обнаружению)
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и осторожно снимите уплотнение клейкой пластины.
    2. Поместите 96-луночную реакционную пластину в автоматическую магнитную промывочную машину.
    3. Промойте шарики три раза с помощью промывочного буфера объемом 100 мкл с помощью автоматической мойки магнитных пластин.
  8. Отсасывайте окончательный объем промывки из гранул после последнего этапа стирки.
  9. Стрептавидин-конъюгированный репортер (Инкубация - Часть II)
    1. Разбавьте свежий стрептавидин, меченный BV421, в буфере для анализа до концентрации 0,2 мкг/мл. Для каждой лунки, содержащей шарики, используется 30 мкл меченого BV421 стрептавидина. Подготовьте достаточный объем меченого BV421 стрептавидина для реакционных скважин с достаточным запасом для компенсации потерь при пипетировании.
    2. Пипетку 30 мкл разбавленного BV421-стрептавидина в каждую реакционную лунку и накройте реакционную пластину 96 лунок микропланшетным уплотнением.
    3. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при температуре 20 °C, встряхивая при 750 об/мин на шейкере.
  10. Промывка шариков (для удаления излишков BV421-Streptavidin)
    1. Извлеките 96-луночную реакционную пластину из шейкера и осторожно снимите уплотнение клейкой пластины.
    2. Поместите 96-луночную реакционную пластину в магнитную шайбу.
    3. Промойте шарики три раза с помощью промывочного буфера объемом 100 мкл с помощью автоматической мойки магнитных пластин.
  11. Ресуспендируйте шарики в лунках до конечного объема 100 мкл в буфере для промывки.
  12. Анализ результатов с помощью прибора с двумя репортерами
    1. Накройте 96-луночную реакционную пластину микропланшетным уплотнением.
    2. Инкубируйте 96-луночный реакционный планшет в течение 3 мин при 20 °C при 1000 об/мин на шейкере.
    3. Перенесите 96-луночную реакционную пластину из шейкера в двухрепортерный анализатор потока (таблица материалов).
    4. Оцените медианную интенсивность флуоресценции образца (MFI) в соответствии с инструкциями производителя (настройки прибора: режим двойного репортера, объем поглощения = 80 мкл, количество = 50 на количество шариков, тайм-аут = 60 с, стробирование = 7 500–15 000).

6. Двойной репортерный серологический анализ IgG и IgM: 384-луночный полуавтоматический формат

  1. Выполняйте двухотчетный анализ в формате 384-луночного планшета, используя этапы анализа, описанные в разделе 5, но обрабатывайте образцы с помощью робота-пипетчика и автоматической магнитной промывки пластин (таблица материалов). В 384-луночном формате встряхивайте планшеты во время инкубации и промывки при 1450 об/мин, а перед измерением флуоресценции встряхивайте планшет в течение 5 мин при 21 °C и 1800 об/мин.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор эксперимента
На рисунке 1 показаны общие схемы для однорепортерных и двухрепортерных анализов Borrelia на основе шариков. Для мишеней с одиночными антителами (т.е. IgG или IgM), генерируемых против данного антигена Borrelia, оба класса антител были независимо оценены в образцах сыворотки крови человека с использованием ПЭ-конъюгированных антиизотипных антител для отчетности. Для двухрепортерного анализа с одновременным анализом иммунореактивности IgG и IgM для выявления антиген-специфического IgG Borrelia использовали биотинилированный античеловеческий IgG + BV421-меченый стрептавидин (синяя флуоресценция) репортерную систему, сохраняя при этом ПЭ-конъюгированный репортер (оранжевая флуоресценция) для обнаружения IgM. Рабочий процесс двухрепортерного анализа аналогичен однорепортерному анализу, за исключением дополнительной 30-минутной инкубации системой детектирования с реагентом флуоресцентного детектирования второго канала BV421-Streptavidin.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема однорепортерных и двухрепортерных анализов Borrelia на основе шариков. (A) Однорепортерный прибор был использован для разработки и первоначальной валидации анализа на основе шариков, который характеризовал либо анти-боррелийные IgG, либо IgM по отдельности, с использованием флуоресцентной репортерной метки фикоэритритина (ПЭ), которая излучает сигнал в «оранжевом» спектре. Любой желаемый антиген боррелий может быть соединен с шариками и использован для захвата и количественного определения IgG или IgM, присутствующих в образцах сыворотки. Для оценки реактивности IgG и IgM по отношению к определенному антигену необходимы два отдельных иммунологических анализа. (B) Система с двумя репортерами позволяла проводить одновременный анализ образцов сыворотки крови на наличие антител IgG и IgM к любому отдельному антигену Borrelia в одной и той же скважине. Этот подход использует те же ПЭ-конъюгированные детектирующие антитела для нацеливания на анти-боррелии IgM, но заменяет обнаружение IgG из системы на основе ПЭ на использование биотинилированного первичного детектирующего антитела и меченого BV421 стрептавидина («синий» излучатель), для которого требуется дополнительный инкубационный этап системы обнаружения продолжительностью 30 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Точность внутрипробного анализа
Корреляционный анализ Спирмена для трех репрезентативных антигенов Borrelia (рис. 2) продемонстрировал равномерную воспроизводимость значений MFI при обнаружении антител к Borrelia, присутствующих в сыворотках крови человека.

figure-results-2
Иллюстрация 2: Точность внутрипробного анализа на основе Borrelia с двумя репортерными шариками. Корреляционный анализ, проведенный Спирменом, показал высокую внутрианалитическую точность двойного репортерного анализа, когда для обнаружения боррелий-специфических антител IgM (А) использовалась система детектирования ПЭ, а для обнаружения специфических антител IgG (В, С) — система детектирования BV421. В общей сложности 21 образец сыворотки был проанализирован в двух экземплярах с использованием полуавтоматической процедуры. На каждом графике сигналы MFI были построены относительно друг друга и проанализированы с помощью линейной регрессии. Линейная кривая (x=y), показанная красной пунктирной линией, указывает на идентичные сигналы MFI для систем обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Межпробирная точность
Хорошая воспроизводимость от анализа к анализу наблюдалась при использовании двухрепортерного анализа. Диаграммы Леви-Дженнингса (рис. 3) со значениями MFI контрольного образца, измеренного в течение семи независимых прогонов, продемонстрировали высокую межпробирную точность для всех репрезентативных антигенов. Средний процентный коэффициент вариации (CV% = стандартное отклонение/среднее × 100) четырех репрезентативных антигенов Borrelia составил 5,3%.

Линейность разбавления
Поскольку в оригинальном однорепортерном анализе и новом двухрепортерном анализе используются разные платформы проточной цитометрии, мы сравнили медиану флуоресцентных выходов одного и того же иммуноферментного анализа на антиген между двумя приборами для проточной цитометрии (рис. 4). Серии разведений образцов обеспечивали линейные кривые разведения для оценки как IgM, так и IgG с хорошим параллелизмом зависимости дозы-отклика между приборами во всем оцениваемом диапазоне разведения (1:100-1:12 800).

figure-results-3
Рисунок 3: Межпромежуточная точность анализа Borrelia на основе двухрепортерных шариков. Для оценки межаналитической точности боррелий-специфический ответ антител IgM (A) и IgG (B-D) образца контроля качества анализировался в течение семи независимых прогонов, каждый раз в дублирующих лунках. Анализы проводили вручную. Значения MFI были отображены на графике Леви-Дженнингса. Зеленая линия показывает среднее значение всех значений. Две красные пунктирные линии обозначают диапазон допусков межпробирной точности. Это значение было рассчитано из среднего значения± умноженного на 2,5 стандартное отклонение (2,5 S.D.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Линейность разведения двухрепортерного анализа Borrelia на основе шариков . При разведении образца от 100 до 12 800 раз кривые разведения для обнаружения IgM (A) и обнаружения IgG (B) были одинаковыми при выполнении вручную с помощью однорепортерного и двухрепортерного приборов. На всех протестированных разведениях значения MFI были немного выше при использовании инструмента с одним репортером (красные символы), чем при использовании инструмента с двумя репортерами (синие символы). Показаны кривые разведения для 2 репрезентативных антигенов, где каждая точка разведения представляет собой среднее измерение тройных лунок со стандартным отклонением (SD*), обозначенным полосками погрешности. Примечание: В этом масштабе малые SD не видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем отчете рассказывается о разработке иммуноферментного анализа Borrelia на основе двух репортерных шариков, который воспроизводимо и чувствительно определяет иммунореактивность против Borrelia в образцах сыворотки12. Различные патогенные виды боррелий, вызывающие боррелиоз Лайма, могут быть дифференцированы по гетерогенности вариант-специфического антигена 6,7,8,9. Мультиплексный анализ одновременно оценивает иммунореактивность антиборрелий, опосредованную IgG и IgM, в пределах одной и той же реакционной скважины, тем самым экономя реагенты, трудозатраты и материал образца, необходимые для выполнения двух одиночных анализов по отдельности. Сравнение ответов IgM и IgG с течением времени может позволить лучше отслеживать прогрессирование заболевания, поскольку сероконверсия IgM в IgG происходит после инфекции6.

Система с двумя репортерами использует две различные системы обнаружения антител 13,15. Связанные эксперименты не показали значимой обнаруживаемой перекрестной реактивности между системами обнаружения Borrelia anti-IgM и Anti-IgG, когда оба класса антител анализировались вместе в одной и той же реакционной лунке12. Учитывая более низкое сродство связывания IgM по сравнению с антителами IgG16,17, мы выбрали конъюгированное антитело для обнаружения IgM (первый репортерный канал двухрепортерного инструмента), поскольку ПЭ является одним из самых сильных флуорофоров, обычно используемых в иммунологических анализах18. Для оценки IgG мы использовали биотинилированное детектирующее антитело, которое затем освещали BV421-конъюгированным стрептавидином (второй репортерный канал прибора)19. Несмотря на дополнительный 30-минутный шаг инкубации по сравнению с однорепортерной системой, двухрепортерная система дает в два раза больше информации на реакцию. В целом, двухрепортерный мультиплексный анализ требует меньше совокупного времени и материальных затрат, чем проведение двух однорепортерных анализов.

Высокая производительность и стабильность мультиплексного анализа на боррелии была продемонстрирована высокой воспроизводимостью в внутри- и межтестовых прецизионных исследованиях, а также демонстрацией линейности разведения и параллелизма разведения в широком диапазоне концентраций образцов для оценки как IgG, так и IgM. Мы наблюдали более высокие уровни абсолютного флуоресцентного излучения для одних и тех же флуорофоров, использующих одноканальный прибор по сравнению с двухканальной системой (≈на 1,7× выше с ПЭ), что связано с различиями в оптике и настройках калибровки между двумя приборами (рис. 4). Тем не менее, кривые флуоресцентного излучения с обоими флуорофорами оставались в линейном диапазоне обоих приборов при высоких и низких предельных значениях разведения образца, и любое расхождение в измеренной абсолютной флуоресценции не влияло на классификацию статуса экспозиции боррелий. 12 См.

Основным преимуществом этого мультиплексного анализа Borrelia на основе шариков является легкость, с которой анализ может быть модифицирован или расширен для оценки различных или дополнительных аналитов, например, для обнаружения антител против антигенов других видов Borrelia . Наборы магнитных шариков xMAP содержат различные комбинации красителей, которые могут быть различимы в канале классификации прибора и теоретически могут быть реализованы в мультиплексных анализах, которые могут одновременно оценивать до 500 уникальных аналитов в одном образце. В то время как в настоящем исследовании выделяются четыре репрезентативных антигена Borrelia для демонстрации функциональности и стабильности анализа, а также для сравнения одно- и двухрепортерной системы, окончательный анализ исследует восемь антигенов, которые вместе могут идентифицировать все пять клинически значимых патогенов Borrelia , циркулирующих в Европе и Северной Америке12.

Высокая производительность возможна при использовании стандартных 384-луночных планшетов для микротитрования в полуавтоматическом формате. Совместимость анализов и приборов как с 96-, так и с 384-луночными планшетами позволяет использовать мультиплексный анализ Borrelia в качестве эффективного скринингового инструмента для быстрого анализа больших наборов образцов, таких как национальные исследования20. Ручное выполнение анализа остается возможным для небольших наборов образцов с использованием меньших 96-луночных планшетов.

Ограничения исследования включают сравнительную оценку только нескольких мишеней иммунореактивности Borrelia в небольшом количестве образцов сыворотки крови человека. Тем не менее, первоначальное исследование подтвердило, что эффективность анализа как на IgG, так и на IgM сохранялась при анализе восьми антигенов всех пяти известных видов Borrelia в более крупном выборочном наборе12. Кроме того, прибор с двумя репортерами может одновременно оценивать только два изотипа антител в рамках каждой реакции, поэтому полное профилирование изотипов потребовало бы проведения дополнительных реакций анализа13.

В заключение, в этом отчете подробно описывается успешное слияние и преобразование однорепортерных иммуноанализов на основе шариков в двухотчетные анализы, которые могут одновременно оценивать патогенные специфические антитела IgG и IgM к боррелиям в образцах сыворотки крови человека. Такой комбинированный подход экономит время, материалы и трудозатраты для получения того же объема данных, что и два независимых однорепортерных анализа. Мультиплексный анализ может быть масштабирован от 96-луночного до 384-луночного формата микротитровой пластины и может быть полуавтоматизирован с использованием роботизированных планшетов и приборов для работы с жидкостями, что делает его подходящим для высокопроизводительных приложений, таких как обследования большого количества населения. Системы двойного репортерного анализа на основе шариков ранее продемонстрировали свою полезность для оценки, например, иммунного ответа на другие вирусные и бактериальные патогены13,21, оценки ответов аллогенных антител против эпитопов HLA при трансплантации органов22 и изучения механизмов аутоиммунных заболеваний23. В настоящем докладе подробно описано использование мультиплексной технологии для выявления воздействия патогенов боррелий, вызывающих болезнь Лайма, в качестве примера того, как лаборатории могут адаптировать этот подход для изучения сложных иммунных механизмов при различных патологиях.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет был профинансирован компанией Luminex (Остин, штат Техас). Авторы благодарят Мэтью Сильвермана (Matthew Silverman), PhD (Biomedical Publishing Solutions, Панама-Сити, Флорида; mattsilver@yahoo.com) за аналитическую и научную помощь в редактировании. Авторы также благодарят Харальда Кляйна (Harald Klein) и Кристофа фон Айхель-Штрайбера (Christoph von Eichel-Streiber) из tgcBIOMICS GmbH (Бинген, Германия) за предоставление антигенов Borrelia , использованных в исследовании. Образцы сыворотки крови человека для технической валидации и контроля качества были получены из: 1) Исследования мультилокальной и серийной распространенности антител против SARS-CoV-2 в Германии через Департамент эпидемиологии Центра инфекционных исследований им. Гельмгольца, Брауншвейг, Германия; 2)отделение неврологии Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (г. Родевиш, Германия). Разрешение на использование образцов на людях было выдано Комитетом по этике Высшей медицинской школы Ганновера, Германия (9086_BO_S_2020).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильные>антитела и реагенты обнаруженияисточникаКаталожный номер
биотинилированной козы против человека IgGJackson ImmunoResearch (Dianova)109-066-098 
Brilliant Violet 421-стрептавидинBD Biosciences563259
Donkey Anti-Human IgM Jackson ImmunoResearch (Dianova)709-116-073
Borrelia AntigenstgcBIOMICS (Bingen, Германия)
Coupling Reagents
1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид (EDC)Thermo Scientific Pierce77149 ProteoChem (100 мг)
10x PBSFisher ScientificBP399-4
BSACarl RothT844.3
MES (2-этансульфоновая кислота; цвиттерионный буфер)Carl Roth4256.2
Na2HPO4Carl Roth4984.1
ProClin300Sigma48914-U
Sulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)Thermo Scientific Pierce24510 (500 мг)
Triton X-100Thermo Scientific85111
Instrumentation and Вспомогательные лабораторные принадлежностиSource
384-луночная пластинаCorning, Cat# 3570
96-луночная глубокоскважинная пластинаThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-луночные полуплоские пластины Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Шайба для пластинBioTek Instruments/Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния
Шайба для пластин BioTek MultiFlo FXBioTek Instruments/Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния
DynaMag Spin Magnet (для выделения шариков в микроцентрифужных пробирках)ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (двухканальный, однорепортерный прибор)Luminex Corp., Остин, Техас
Магнитный процессор частиц KingFisher (для изоляции шариков в 96-луночных планшетах) ThermoFisher, Cat# A31508
Микросферы MagPlex (магнитные, флуоресцентные, 6,5-&микро; m-диаметр шариков)Luminex Corp., Остин, Техас
SmartBlock PlatesEppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer CEppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTopEppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (трехканальный, двухрепортерный прибор)Luminex Corp., Остин, Техас

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906(2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859(2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355(2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241(2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385(2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 8/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Tags

Multiplex ImmunoassayDual Reporter AssayAntibody Class DetectionIgG IgM DetectionBorrelia SpeciesLyme BorreliosisSerological TestImmunoreactivity AssessmentHuman Serum SamplesInfectious Disease Monitoring

Related Articles