Методическая статья

Набор скрининговых методик для быстрого обзора функции нейтрофилов

DOI:

10.3791/65329

⸱

9 февраля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол включает в себя набор функциональных анализов нейтрофилов, которые будут использоваться в качестве метода скрининга для охвата функций различных сигнальных путей. Протокол включает в себя первичную и простую оценку жизнеспособности, чистоты, продукции активных форм кислорода, миграцию в реальном времени, фагоцитоз и предварительное предложение внеклеточных ловушек нейтрофилов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы известны как одна из первых линий защиты в врожденном иммунном ответе и могут выполнять многие специфические клеточные функции, такие как хемотаксис, обратная миграция, фагоцитоз, дегрануляция цитотоксических ферментов и метаболитов и высвобождение ДНК в виде внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ). Нейтрофилы не только жестко регулируют сигнализацию, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы. Поскольку свежие нейтрофилы терминально дифференцированы, недолговечны и сильно изменчивы у разных людей, важно максимально использовать собранные образцы. Исследователям часто необходимо проводить скрининговые анализы, чтобы оценить обзор многих функций нейтрофилов, на которые могут влиять конкретные оцениваемые условия. Для удовлетворения этой потребности был разработан набор тестов, следующих за единым процессом выделения нейтрофилов нормальной плотности, в поисках баланса между скоростью, полнотой, стоимостью и точностью. Полученные результаты могут быть использованы для обоснования и руководства последующими углубленными исследованиями. Эта процедура может быть проведена в среднем за 4 часа и включает в себя оценку жизнеспособности клеток, продукцию активных форм кислорода (АФК), миграцию в реальном времени и фагоцитоз дрожжей на предметных стеклах, оставляя достаточное количество клеток для более детальных подходов, таких как омиксные исследования. Кроме того, процедура включает в себя способ легко наблюдать предварительное предположение НВЛ после быстрого паноптического окрашивания, наблюдаемого с помощью световой микроскопии, при отсутствии специфических маркеров, хотя и достаточных, чтобы указать, стоит ли прилагать дальнейшие усилия в этом направлении. Разнообразие тестируемых функций объединяет общие моменты между тестами, сокращая время и затраты на анализ. Процедура получила название NeutroFun Screen, и хотя у нее есть ограничения, она уравновешивает вышеупомянутые факторы. Кроме того, целью этой работы является не определенный набор тестов, а скорее руководство, которое может быть легко адаптировано к ресурсам и потребностям каждой лаборатории.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками врожденного иммунитета в крови человека и, как известно, играют важную роль в инфекции и воспалении, являясь первыми реагирующими наместо повреждения тканей. В последние годы растет признание решающей роли, которую нейтрофилы играют при различных заболеваниях и в поддержании гомеостаза2. Нейтрофилы не только обладают жестко регулируемой сигнализацией, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы 3,4,5. Таким образом, изучение нейтрофилов и их многочисленных необычных клеточных функций, таких как хемотаксис, обратная миграция6, фагоцитоз7, респираторный взрыв8 и высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ)7, является обязательным в многочисленных исследовательских контекстах, где необходимо оценить потенциальные функциональные, морфологические или молекулярные изменения нейтрофилов, вызванные конкретными анализируемыми условиями.

Свежевыделенные нейтрофилы терминально дифференцированы, недолговечны, высокодинамичны и легко активируются9. Тем не менее, эффективный метод хранения, который не влияет на реакцию нейтрофилов, еще не достигнут, что затрудняет выполнение нескольких анализов, которые должны быть непрерывными. Кроме того, ранее описанные функциональные анализы10,11, основанные на анализах, требующих цитометрии и/или флуоресцентного окрашивания, могут быть нежизнеспособным выбором, когда необходима широкая и первоначальная оценка нейтрофила.

Для решения этих проблем в данном протоколе описан набор тестов, которые могут быть проведены после одного процесса выделения, включая оценку жизнеспособности клеток, продукцию активных форм кислорода (АФК), миграцию в реальном времени и фагоцитоз Saccharomyces cerevisiae, результаты которых могут быть использованы для обоснования углубленных последующих исследований. Эта процедура, получившая название NeutroFun Screen, была разработана для того, чтобы охватить основные эффекторные активности, за исключением дегрануляции, и может быть завершена в среднем за 4 часа, включая 1 час активации. Кроме того, оставшиеся клетки могут быть использованы для более детальных подходов, таких как омиксные исследования. Преимущество этого метода заключается в его балансе между скоростью, комплексностью, стоимостью и точностью.

Кроме того, существует способ легко наблюдать за предварительным предложением НЭО, без конкретных маркеров, но достаточных для того, чтобы указать, стоит ли предпринимать дальнейшие усилия в этом направлении. Разнообразие тестируемых функций направлено на то, чтобы объединить общие моменты между тестами, сокращая время и затраты на анализ. Основная цель этого метода состоит в том, чтобы обеспечить сбалансированный, функциональный анализ скорости, полноты, стоимости и точности, который позволяет получить обзор реакции нейтрофилов, что делает его полезным начальным шагом в исследовании влияния новых стимулов на нейтрофилы нормальной плотности.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты строго следовали этическим принципам, установленным институциональным наблюдательным советом Университета Бразилиа (процесс 13364819.0.0000.5558), а образцы были идентифицированы кодами для обеспечения анонимности доноров. Клетки были получены от нормальных здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-35 лет, которые подписали информированное согласие и соответствовали следующим критериям приемлемости: некурящие/вейперы, отсутствие хронических заболеваний и отсутствие воспалительных состояний в анамнезе в течение последних 14 дней.

1. Забор крови

  1. Асептически помещают 0,3 мл гепарина 5 000 МЕ/мл (см. таблицу материалов) в стерильный шприц объемом 20 мл для его гепаринизации.
  2. Наложите венозный жгут примерно на 4 дюйма выше места прокола и определите срединную кубитальную или головную вену для венепункции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы общее время наложения жгута не превышало 1 минуты.
  3. Очистите место прокола 70% спиртом и выполните венепункцию.
  4. Осторожно переверните шприц три или четыре раза после сбора крови, чтобы правильно смешать кровь и гепарин.

2. Выделение нейтрофилов

ПРИМЕЧАНИЕ: Полиморфноядерные лейкоциты (ПМН) выделяют с помощью центрифугирования с градиентом плотности с последующим гипотоническим лизисом оставшихся эритроцитов (эритроцитов), как описано ранее11 с некоторыми изменениями. Этот метод не является обязательным для проведения скрининговых анализов и может быть заменен до тех пор, пока выбранный метод приводит к жизнеспособности >97%, праймингу или активации <3% PMN и дает достаточное количество клеток для всех анализов, репликаций и условий. Выполнение этих этапов в асептических условиях и использование растворов, не содержащих эндотоксинов, является обязательным, чтобы избежать активации клеток.

  1. Изготовьте 12 мл разбавлений 60% и 70% разделительной среды (коммерчески доступны; см. таблицу материалов) в конических пробирках по 50 мл.
  2. Подготовьте градиент снизу вверх, добавляя 4 мл за раз 60%-ного разведения над 70%-ным разведением, используя пипетку объемом 5 мл. Делайте это аккуратно, чтобы не допустить смешивания интерфейса.
  3. Аккуратно нанесите 12 мл гепаринизированной крови поверх градиента плотности. Центрифуга при 200 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа и до активации PMN, все используемые реагенты и пробирки должны храниться в охладителе, наполненном льдом.
  4. Выбросьте слой плазмы/мононуклеарной клетки, затем аккуратно перенесите слой над гранулой эритроцита в две конические пробирки по 15 мл примерно по 7,5 мл в каждой. Восполните объем пробирки сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS; см. Таблицу материалов).
  5. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 19 °C.
  6. Промойте гранулу ячейки HBSS.
    1. Выбросьте надосадочную жидкость, вылив пробирку и осторожно повторно суспендировав гранулу в 7 мл HBSS.
    2. Центрифуга при 300 x g в течение 5 минут при 19 °C, чтобы удалить всю разделительную среду.
  7. Проводят гипотонический лизис оставшихся эритроцитов.
    1. Выбросьте надосадочную жидкость и смешайте гранулы в одном тюбике.
    2. Ресуспендант гранулы RBC/PMN в 3 мл стерильногоH2Oи добавьте 3 мл HBSS (2x) в течение 25 с для восстановления осмолярности. Затем центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при 19 °C.
    3. Повторите шаги 2.8.1 и 2.8.2 для белой гранулы без эритроцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочную жидкость необходимо удалить как можно скорее, чтобы свести к минимуму контакт нейтрофилов с продуктами распада эритроцитов. В качестве альтернативы второй гипотонический лизис можно заменить, осторожно ресуспендировав остаточный слой эритроцитов и удалив всю надосадочную жидкость, так как оставшиеся эритроциты будут осаждаться над гранулой PMN.
  8. Выбросьте надосадочную жидкость, налив пробирку, осторожно ресуспендируйте PMN в оставшемся буфере и перенесите их в ледяную микропробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно аннотируйте объем при переносе ресуспендированных клеток с помощью микропипетки.
  9. Переносят 3 x 1 мкл клеточной суспензии на чистое предметное стекло (три лунки по 1 мкл каждая) и окрашивают быстрым паноптиком (см. таблицу материалов) для оценки морфологии и чистоты12.
    1. Для окрашивания быстрым паноптическим средством предметное стекло пять раз погружают в паноптический фиксатор No 1, шесть раз — в эозин No 2 и дважды — в гематоксилин No 3, при этом каждое погружение длится 1 с.
    2. Аккуратно промойте предметное стекло дистиллированной водой.
    3. Дайте стечь и высохнуть на воздухе.
  10. Наблюдают под микроскопом и подсчитывают 300 случайных клеток в каждой лунке, таким образом дифференцируя нейтрофилы от других гранулоцитов.
  11. Перенесите 1 мкл клеточной суспензии в 49 мкл 0,2% трипанового синего красителя13 и подсчитайте клетки с помощью камеры Нойбауэра, различая мертвые и жизнеспособные клетки.
  12. Доведите концентрацию клеток до 6 667 клеток/мкл, используя раствор из 50% аутологичной плазмы и 50% HBSS с добавлением кальция и магния. Распределите суспензию 6 667 клеток/мкл равномерно между микропробирками, соответствующими испытуемым условиям, включая отрицательный контроль.
    Примечание: Можно использовать любую концентрацию клеток, аналогичную циркулирующим нейтрофилам в модельном организме, но важно использовать одну и ту же концентрацию клеток во всех экспериментах для воспроизводимости.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Протокол выделения нейтрофилов. Две концентрации разделительной среды (перколл) (А) укладываются друг на друга (В), затем кровь наслаивается поверх градиента разделения (С). После центрифугирования ПМН находится в центральном слое (D), который разделен на две пробирки по 15 мл (E). Клеточную суспензию дважды промывают в HBSS и центрифугируют (G-I) для удаления среды, затем клетки ресуспендируют, а остаточные эритроциты подвергают двум раундам гипотонического лизиса (J-M). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка к активации нейтрофилов

  1. В микропробирках объемом 1,5 мл подготовьте систему активации для каждого состояния, чтобы конечная концентрация клеток составляла 6 600 клеток/мкл. Например, для проверки эффектов 100 нМ fMLP (N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; см. таблицу материалов) добавьте 5 мкл 10 мкМ fMLP к 495 мкл суспензии 6667 клеток/мкл. Для отрицательного (нестимулированного) контроля добавляют HBSS, содержащий Ca2+ иMg2+.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрации этой методологии были использованы следующие конечные концентрации стимулов: 100 нМ fMLP, 16 мкМ фаллаксина, природного антимикробного пептида14, и 100 нМ PMA (форбол-12-миристат-13-ацетат) (см. таблицу материалов).
  2. Инкубировать при 37 °C без вращения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все аликвоты для функциональных анализов берутся из этой клеточной суспензии, далее именуемой системой активации.

4. Анализ на нитротетразолий синий хлорид (NBT) для оценки производства АФК

  1. Приготовление рабочего раствора НБТ: Для каждого экспериментального условия приготовьте рабочий раствор НБТ (см. Таблицу материалов) 6 мМ, выполнив следующие действия:
    1. Растворите 0,0005 г NBT в 10 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и взбуривайте не менее 15 мин.
    2. Добавьте 90 мкл HBSS Ca2+Mg2+ и встряхивайте до 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, связанные с NBT, должны выполняться в темноте.
  2. Выполните тест слайдов NBT.
    1. Через 20 минут после активации клетки осторожно перемешайте клеточную суспензию и осторожно перенесите 2 мкл PMN на чистое предметное стекло. Инкубируют 20 мин в увлажненной камере при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не растекайте клеточную суспензию слишком сильно по затвору; В противном случае она может высохнуть до инкубации.
    2. Добавьте 1 мкл рабочего раствора NBT на клетки и продолжайте инкубировать в течение 20 мин в защищенном от света месте.
    3. Высушите горку горячим воздухом и зафиксируйте ее каплей метанола в каждой лунке на 1 мин. Окрашивают 0,03% сафранином (см. таблицу материалов) в течение 1 мин.
    4. Аккуратно промойте предметное стекло дистиллированной водой.
    5. Дайте предметному стеколу высохнуть на воздухе и понаблюдайте под микроскопом.
    6. Подсчитайте 100 случайных клеток в каждой лунке, дифференцируя нейтрофилы с формазановыми отложениями и без них.
  3. Выполните спектрофотометрический анализ NBT.
    1. Через 40 минут после активации клетки осторожно перемешайте клеточную суспензию и перенесите 90 мкл PMN из системы активации в чистую микропробирку. Затем осторожно добавьте 20 мкл 6 мМ раствора NBT. Инкубируют в темноте 20 мин при температуре 37 °C.
    2. Добавьте 100 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS; см. таблицу материалов) и встряхните.
    3. Ультразвуковая обработка с помощью наконечника-ультразвукатора с амплитудой 60%, пять циклов по 15 с каждый с интервалом 15 с. Центрифуга при 12 000 x g в течение 5 мин.
    4. Перенесите 60 мкл надосадочной жидкости на 96-луночную планшет с прозрачным дном и измерьте абсорбцию продукта формазана при 570 нм.

5. Анализ на фагоцитоз

  1. Приготовьте суспензию 33 000 дрожжей/мкл для каждого состояния, как описано ниже:
    1. Добавьте приблизительно 0,75 мг сухих дрожжей (Saccharomyces cerevisiae; см. таблицу материалов) к 200 мкл HBSS Ca2+ Mg2+ и инкубируйте в термомиксере при 100 °C при 500 об/мин не менее 15 мин.
    2. Гомогенизируют смесь путем вихря и переносят 5 мкл дрожжевой суспензии в 45 мкл 0,2% красителя трипанового синего. Подсчитайте количество дрожжей в камере Нойбауэра.
    3. Доведите концентрацию исходной суспензии до 33 000 дрожжевых клеток/мкл, используя HBSS Ca2+Mg2+. Держите суспензию на льду до использования.
  2. Через 20 минут после активации клетки осторожно перемешайте клеточную суспензию и перенесите 5 мкл системы активации в 5 мкл 33 000 дрожжей/мкл суспензии Saccharomyces cerevisiae в новой стерильной микропробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение нейтрофилов и дрожжей составляет 1:5 (PMN:дрожжи).
  3. Немедленно переносят 6 мкл суспензии ПМН/дрожжей в три лунки чистого предметного стекла (по 2 мкл каждая) и инкубируют предметное стекло в увлажненной камере в течение 40 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не растекайте клеточную суспензию слишком сильно по затвору; В противном случае она может засохнуть до инкубации.
  4. Высушите предметное стекло под горячим воздухом и прокрасьте быстрым паноптиком, как описано в шаге 2.9 выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Третий этап быстрого паноптического окрашивания имеет решающее значение для микроскопического анализа предметного стекла. Окрашивание предметного стекла в течение ≥3 с на этом этапе может сделать его непригодным для анализа, так как будет трудно отличить дрожжи от ядерных лепестков нейтрофилов.
  5. Наблюдайте за предметными стеклами под микроскопом, подсчитывая 100 случайных нейтрофилов каждой лунки и различая положительные и отрицательные ПМН на фагоцитоз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, одна дрожжевая частица внутри или в прямом контакте с клеточной мембраной PMN указывает на PMN-положительный результат на фагоцитоз. Если вас интересует соотношение дрожжей и нейтрофилов, подсчитайте также количество поглощенных частиц дрожжей.

6. Анализ хемотаксиса PMN в режиме реального времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Миграционный анализ выполняется аналогично протоколу, описанному в предыдущемпункте 15, со следующими изменениями:

  1. Подготовьте хемотаксический градиент, добавив 160 мкл хемоаттрактанта (например, fMLP, IL-8, C5 или LTB4; см. таблицу материалов) в нижнюю камеру планшета анализатора клеток в реальном времени (RTCA) на основе импеданса. Для отрицательного контроля и заготовок добавьте 160 мкл HBSS Ca2 + Mg2+.
  2. Присоедините верхнюю камеру и добавьте 25 мкл HBSS Ca2+Mg2+. Выдерживают при комнатной температуре не менее 1 ч до образования хемотаксического градиента.
  3. Через 60 минут после активации клеток осторожно перемешайте клеточную суспензию и поместите 60 мкл клеточной суспензии в верхнюю камеру. Добавьте в заготовку 60 мкл HBSS Ca2+Mg2+ .
  4. Поместите пластину RTCA и запрограммируйте программное обеспечение RTCA на измерение индекса клеток (CI) каждые 60 с в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины RTCA можно мыть для повторного использования, как описано ранее16. Таким образом, промойте камеры и электроды RTCA фосфатно-солевым раствором (PBS) три раза, а затем дважды сверхчистой водой типа I. Инкубируют нижнюю и верхнюю камеру с 0,25% трипсином 0,53 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 40 мин. Умыться сверхчистой водой три раза.

7. НЭТ-суггестивный анализ

  1. Через 10 мин после активации клеток осторожно перемешайте клеточную суспензию и перенесите 4 мкл ПМН из каждой оцениваемой системы активации, разделенной на две лунки чистого предметного стекла. Инкубируют в увлажненной камере при температуре 37 °C в течение 30 мин.
  2. Добавьте 1 мкл ДНКазы I в одну из лунок и инкубируйте в течение 20 минут при 37 °C (во влажной камере).
  3. Высушите предметное стекло и окрасьте быстрым паноптическим средством, как описано ранее в шаге 2.9 раздела «Выделение нейтрофилов».
  4. Оцените предметные стекла под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите любые признаки выпуска NET, характеризующиеся наличием веб-подобных структур. После идентификации подтвердите, что лечение ДНК-азой I способно удалять такие структуры. Этот анализ позволяет предположить образование НВЛ, так как для подтверждения их наличия требуются дополнительные тесты.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод изоляции по плотности, использованный в данном исследовании (рис. 1), соответствовал критериям предложенных экспериментов. Параметры нейтрофилов, полученные с помощью этого метода, включали жизнеспособность ≥98%, чистоту ≥94%) и выход клеток ≥1,5 x 107, при этом активация не была обнаружена скрининговыми тестами. Двумя важными этапами выделения ПМН являются антикоагулянтная терапия и удаление эритроцитов. Осторожное покачивание пробирки или шприца с антикоагулянтной пробиркой перед нанесением на градиент плотности и выбор метода удаления эритроцитов для предотвращения как активации, так и загрязнения могут повлиять на продуктивность и воспроизводимость эксперимента.

Для оценки функционального обзора функции нейтрофилов был разработан рабочий процесс, который позволил проводить предложенные скрининговые анализы по крайней мере с двумя исследователями в среднем за 4 часа, с 1 часом активации и 2 часами мониторинга миграции в режиме реального времени, как показано на рисунке 2.

figure-results-1
Рисунок 2: Рабочий процесс NeutroFun Screen. Для оценки панели функциональных реакций, вызванных конкретными оцениваемыми условиями, рабочий процесс NeutroFun Screen включает в себя участие, по крайней мере, двух исследователей. Исследователь 1 (R1) начинает процесс выделения PMN, за которым следует корректировка концентрации клеток и инкубация системы активации, в то время как параллельно исследователь 2 (R2) готовит материалы для проведения следующих анализов, которые разделены между ними: R1 выполняет фагоцитоз, НЭТ и спектрофотометрический анализ NBT; R2 выполняет миграцию в режиме реального времени и тесты слайдов NBT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Классический анализ NBT17 был оптимизирован как для слайдовой, так и для спектрофотометрической оценки формазанового образования, образующегося в результате реакции NBT с АФК, генерируемым PMNs. Спектрофотометрический анализ позволял проводить относительную количественную оценку в разных условиях, в то время как микроскопический анализ был полезен для описательного и полуколичественного анализа, оценивая закономерность распределения кристаллов, морфологию и количество клеток, содержащих формазан. Результаты спектрофотометрического анализа показаны на рисунке 3А, свидетельствующие о том, что 100 нМ PMA индуцировали повышенную продукцию АФК (в среднем 3:2:1) по сравнению с fMLP и контрольными группами. Результаты теста на предметных стеклах NBT (Рисунок 3B) подтвердили результаты спектрофотометрических данных, а также показали, что PMA является наиболее интенсивным стимулом, индуцирующим продукцию АФК, по сравнению с fMLP (Рисунок 3C), что было продемонстрировано ранее прямым измерением АФК с помощью цитометрии18. Что касается подсчета клеток, то количество нейтрофилов, содержащих кристаллы формазана, показало соотношение 7:4:1 в условиях PMA:fMLP:контроль, что также выявило различные закономерности распределения формазана между fMLP и PMA-активированными PMN; Обработка fMLP приводила к интенсивной активации отдельных клеток, в то время как PMA индуцировала образование кристаллов формазана, рассеянных по всей цитоплазме в большинстве PMN. Кроме того, наблюдалось несколько морфологических характеристик, которые дифференцировали состояния, такие как экспрессивная агрегация клеток после лечения PMA. Отсутствие таких типичных характеристик активации и низкий уровень формазана в контрольной группе свидетельствовали о том, что состояние покоя существенно не нарушено. Таким образом, анализ NBT оказался простым, недорогим и надежным тестом на продукцию нейтрофилов АФК, который может быть использован для анализа способности и интенсивности данного стимула индуцировать продукцию АФК.

figure-results-2
Рисунок 3: Тест NBT. (A) Спектрофотометрическая оценка дыхательного всплеска нейтрофилов в различных условиях (отрицательный контроль: 100 нМ фМЛП и 100 нМ ПМА) по абсорбции формазана (490-630 нм). Данные четырех доноров представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). * = все группы отличаются друг от друга (p≤ 0,05); £ = Сравнения CTRL с PMA и fMLP с PMA показывают существенные различия (p≤ 0,05). (Б) Слайд-тест может быть качественно проанализирован, характеризуя интенсивность отложений формазана, его расположение в клетке и агрегацию клеток. Черные стрелки указывают на кристаллы формазана. Масштабные линейки: 20 мкм. (C) Количество ПМН, содержащих формазан, подсчитанное с помощью оптической микроскопии. Данные восьми доноров представлены в виде среднего ± SD. *** p < 0,0001, t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Слайды фагоцитоза использовали для определения скорости фагоцитоза в процентах от нейтрофилов, осуществляющих фагоцитоз, как показано на рисунке 4. Несмотря на то, что и 100 нМ fMLP, и 16 мкМ антимикробный пептид индуцировали явно повышенное поглощение дрожжей, разница не была статистически значимой до двойной стимуляции, которая значительно усиливала фагоцитоз по сравнению с контрольной группой и могла предполагать реакцию на двойную стимуляцию.

figure-results-3
Рисунок 4: Тест на фагоцитоз. Нейтрофилы оценивали по их фагоцитозной способности (подсчет нейтрофилов, содержащих дрожжи). Несмотря на то, что воздействие 100 нМ фМЛП или 16 мкМ антимикробного пептида перед инкубацией дрожжей усиливало фагоцитоз по сравнению с контрольной группой, (А) увеличение не было статистически значимым. Интересно, что первоначальная инкубация с fMLP с последующим добавлением антимикробного пептида приводила к значительному усилению фагоцитоза в нейтрофилах человека (звездочка между CTRL и антимикробным пептидом fMLP+). (B) Черные стрелки показывают дрожжевые клетки, зеленые стрелки показывают только нейтрофилы, а красные стрелки указывают на фагоцитозирующие нейтрофилы. Данные пяти доноров представлены в виде среднего ± SD. Масштабные линейки: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 5 показан пример результатов миграции клеток в реальном времени, демонстрирующий хорошо известный хемотаксический эффект 100 нМ fMLP на нейтрофилы. Кинетика клеточной миграции была приведена в соответствие с моделью Гомперца, что позволило сравнить ее параметры.

figure-results-4
Рисунок 5: Миграция клеток в режиме реального времени. Индекс ячейки отражает электрический импеданс, возникающий в результате миграции клеток. В этом анализе fMLP использовали в качестве положительного контроля миграции нейтрофилов путем добавления 100 нМ fMLP в нижнюю камеру. Отрицательный контроль (CTRL) содержал только HBSS в нижней камере. Наложенные кривые представляют собой кривую, подходящую к модели Гомперца, модифицированную для наилучшего соответствия восходящим и нисходящим склонам. Данные трех доноров, представленные в виде среднего ± SD.* p < 0,05, t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Наконец, представлен простой тест оптической микроскопии, предполагающий наличие НВЛ, в котором ПМН окрашиваются быстрым паноптиком. Можно наблюдать, что для некоторых специфических НВЛ-индуцирующих стимулов, таких как PMA или некоторые антимикробные пептиды, даже после короткого времени активации (1 ч) можно наблюдать нитевидные паутинчатые структуры вблизи клеток, в то время как в других условиях, таких как отрицательный контроль и fMLP, это невозможно (рис. 6). Чтобы лучше подтвердить это утверждение, ДНКаза I была добавлена через 40 минут активации клетки с помощью 100 нм PMA или антимикробного пептида, удаляя NET-подобные структуры (рис. 6). Несмотря на то, что этот метод не подходит для определения характеристик НВЛ и может быть подвержен влиянию артефактов, он является дешевой, простой и интересной отправной точкой для оправдания дальнейших инвестиций в анализ НВЛ, особенно в контекстах, в которых эффекты стимулов неизвестны или плохо описаны.

figure-results-5
Рисунок 6: Анализ образования НВЛ. Качественный анализ окрашенных паноптически окрашенных нейтрофилов через 1 ч активации на предметном стекле может указывать на высвобождение НВЛ. Группы CTRL (A,B) и fMLP (C,D) не показали каких-либо признаков высвобождения NET, в то время как активация PMA (E-H) индуцировала образование NET-подобных структур, которые деградировали при обработке ДНКазой I (I-L). Исследование влияния антимикробного пептида на нейтрофилы показало, что такой стимул может вызывать высвобождение НВЛ, поскольку на предметных стеклах были представлены НВЛ-подобные структуры (М-), которые были разрушены ДНКазой I (Q-T). Красные стрелки указывают на NET-подобные структуры. Масштабные линейки: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы являются очень динамичными и чувствительными клетками, которые недолговечны и еще не могут быть криоконсервированы, что затрудняет изучение их биологии. Поэтому необходимо соблюдать осторожные шаги для получения жизнеспособных, обогащенных и покоящихся нейтрофилов11,20. В этом исследовании использовалась техника изоляции на основе плотности, которая подчеркивает мягкие и минимальные манипуляции, а также использование низких температур до стадии активации. Кроме того, обработка крови должна происходить в течение 30 минут после венепункции и храниться при комнатной температуре. В настоящей работе представлен вариант уменьшения манипулятивного стресса и времени эксперимента. Чтобы еще больше упростить процесс, мы ввели новый шаг (как опцию) в протоколе, который включает в себя удаление эритроцитов путем мягкой ресуспензии и аспирации слоя эритроцитов после однократной процедуры гемолиза. Этот этап снижает манипуляционный стресс и время эксперимента, так как удаляет большинство эритроцитов с помощью всего одного шага гипотонического гемолиза. Однако следует отметить, что навыки оператора сильно влияют на эффективность этого шага, и он не всегда может полностью удалить эритроциты. Кроме того, аспирация эритрофилов может привести к потере нейтрофилов, но это не влияет на выход, так как при сборе ближе к слою эритрофилов из градиента изначально извлекалось больше нейтрофилов. Таким образом, аспирация эритроцитов рекомендуется, если анализы не требуют максимально возможной чистоты, или если оператор получил стабильно хорошие результаты. Для скрининговых тестов, представленных здесь, небольшое количество загрязняющих эритроцитов (<3%) не повлияет на результаты.

Для своевременного выполнения всех процедур, включая подготовку реагентов, представлен рабочий процесс (рис. 2), в котором подробно описаны сроки и распределение задач между двумя исследователями. После завершения всех функциональных анализов оставшиеся клетки могут быть подготовлены к дальнейшим молекулярным исследованиям, таким как омиксные исследования путем лизиса клеток с надлежащим лизисным буфером и хранением.

Производство АФК
Дыхательный взрыв является отличительной чертой прайминга и активации нейтрофилов18,21, а оценка продукции АФК является распространенным методом, используемым для оценки статуса активации нейтрофилов. В этом исследовании оценивали продукцию АФК с использованием двух подходов: оптической микроскопии и спектрофотометрии.

Тест NBT является хорошо известным подходом к оценке дыхательного взрыва в нейтрофилах22,23. Двумя наиболее часто используемыми методами являются анализы, основанные на оптической микроскопии (или предметном тесте) и спектрофотометрические анализы 24,25,26. Несмотря на то, что оптическая микроскопия позволяет визуализировать детали на клеточном уровне, она подвержена предвзятости пользователя. Таким образом, НБТ-тест служит качественным дополнением к спектрофотометрическому анализу в отношении фенотипических особенностей, таких как характер образования формазанов, интенсивность и агрегация клеток.

Критическими этапами как для НБТ, так и для спектрофотометрических тестов являются НБТ и формазан полная солюбилизация. Вопреки рекомендациям производителя, NBT плохо растворяется в воде. Тем не менее, гомогенизация НБТ в ДМСО в течение не менее 15 мин с последующим добавлением воды/HBSS и вихрянием в течение 2 мин обеспечивает полную солюбилизацию. Кроме того, для анализа абсорбции формазана необходимо выполнить два критических этапа: (1) высвобождение кристаллов формазана из клеток путем лизиса PMN и (2) полная солюбилизация кристаллов формазана. Оба этапа были достигнуты путем обработки клеточной гранулы 10% SDS, как недавно было предложено27, с последующим ультразвуковым анализом и анализом абсорбции надосадочной жидкости при 570 нм.

Кроме того, результаты НБТ в контрольных группах с отрицательным и положительным результатами являются первым этапом скрининга, который необходимо оценить. Этот шаг должен показать существенную разницу, поскольку оценка продукции АФК с помощью формазана показывает, мог ли процесс выделения быть ответственным за нежелательные изменения в состоянии покоя клеток путем стимуляции или ингибирования.

Для обнаружения АФК часто используются другие методы, такие как восстановление цитохрома с28 или анализ проточной цитометрии29; Однако, учитывая скрининговый подход, их применение требует более длительного времени эксперимента, использования специфических маркеров и дорогостоящих инструментов. Хемилюминесценция люминола/изолюминола является быстрым и экономически эффективным методом обнаружения АФК, а также позволяет дифференцировать внутри- и внеклеточные АФК. Однако для этого метода необходим люминометр30,31. Несмотря на то, что стоимость прибора может быть снижена за счет использования оборудования, он все равно будет непригоден для скринингового анализа, выполняемого одновременно с другими анализами.

Фагоцитоз
Инкубация ПМН/дрожжей дает обзор способности и эффективности фагоцитоза нейтрофилов путем подсчета числа нейтрофилов, осуществляющих фагоцитоз, и количества поглощенных дрожжей на одного нейтрофила. Однако, поскольку дрожжевая частица сама по себе является сигналом активации, сравнение контрольной группы с предварительно обработанной ПМН представляет собой двойную систему стимуляции, которая может не отображать существенных изменений, как показано в CTRL по сравнению с ПМН, обработанным fMLP (рис. 4). Тем не менее, этот анализ полезен для определения того, будет ли потенциальный модулятор оказывать какое-либо влияние на фагоцитоз. С помощью этого анализа был протестирован новый антимикробный пептид, и результаты указывают на интересную потенциальную реакцию на эту комбинацию стимулов, которая недавно обсуждалась как необходимая дляэффективной активации.

Критическим этапом для этого анализа является окрашивание, так как анализ становится недостоверным, если предметное стекло держать на паноптическом No 3 (гематоксилин) в течение ≥3 с. Это связано с тем, что дрожжевые клетки и ядерные доли нейтрофилов невозможно отличить друг от друга. Кроме того, такой подход позволяет проводить морфологический анализ нейтрофилов после воздействия модуляторов. Проточная цитометрия является еще одним эффективным методом анализа фагоцитоза33, хотя она имеет ограничения, связанные с трудностью различения мембранных и поглощенных частиц и других факторов, связанных с предлагаемым скрининговым набором, как обсуждалось в предыдущей теме. Такое же ограничение наблюдается и в методе, описанном в настоящем документе, хотя его следует рассматривать как первоначальный скрининг для руководства последующими исследованиями.

Миграция в режиме реального времени
Протокол скрининга в режиме реального времени был оптимизирован для оценки миграционных возможностей PMN. Несмотря на то, что предыдущее исследование показало, что покрытие нижней стороны пластины RTCA было необходимо для того, чтобы анализ миграции показал разницу между отрицательным контролем и обработкой IL-815, это исследование показало высокие значения доверительного интервала (CI) для клеток, обработанных fMLP, без добавления покрывающих агентов. Результаты показали высокую воспроизводимость со значительной миграцией, начиная с 12 мин. Кроме того, аппроксимация кривой полученных данных о миграции может выявить такие параметры, как максимум индекса ячейки, а также увеличение и уменьшение наклона, которые полезны для понимания динамики миграции и могут зависеть от концентрации или различаться между условиями. Кривые миграции нейтрофилов (рис. 5) лучше всего подходят к скорректированной функцииГомперца 34, показывающей, что fMLP увеличивает максимальный клеточный индекс и увеличивает наклон.

Особое внимание необходимо уделять предотвращению образования пузырьков в системе RTCA, так как они могут блокировать клетки, проходящие через электроды, что ставит под угрозу эксперимент. Ограничивающим фактором является высокая стоимость плит. Несмотря на то, что более дешевые методы анализируют миграцию клеток, они не обладают хорошей воспроизводимостью или являются сложными и трудоемкими, как, например, камера Бойдена35. Таким образом, RTCA является надежным миграционным анализом, совместимым с другими скрининговыми тестами, представленными здесь.

Сети
Наконец, с помощью оптической микроскопии был разработан многообещающий, простой и недорогой анализ для предварительной оценки образования НВЛ. Он был получен в результате наблюдения за слайдами фагоцитоза, в которых PMA, специфический НВЛ-индуцирующий стимул, протестированный на предмет его влияния на способность фагоцитоза, также индуцировал образование паутинообразной структуры по сравнению с группами CTRL и fMLP. В этой работе была выдвинута гипотеза о том, что эти структуры могут указывать на выпуск NET. Такая гипотеза была проверена путем обработки образцов ДНКазой I после активации, где нитевидных структур в нейтрофилах, активированных ПМА, обнаружено не было. Предположение о том, что такие структуры, вероятно, являются НВЛ, основано на том факте, что ПМА упоминается в качестве хорошо известного индуктора образования НВЛ36,37, обнаружении подобных структур методом флуоресцентной микроскопии с использованием специфических маркеров для НВЛ38,39 и деградации НВЛ, катализируемой ДНКазой I40,41. Важно подчеркнуть, что это не метод подтверждения образования НВЛ, а всего лишь предварительный скрининг, предполагающий наличие НВЛ. Несмотря на то, что этот тест имеет ограничения, поскольку НВЛ можно спутать с артефактами окрашивания, он служит важной цели, предлагая образование НВЛ при быстром и недорогом скрининге, который можно проводить вместе с другими функциональными тестами. После того, как НЭО могут быть обнаружены как имеющие отношение к проводимому скринингу исследованию, они могут быть дополнительно оценены с помощью конфокальной или электронной микроскопии42, как обсуждается ниже.

В нашей лаборатории новые антимикробные пептиды, также обладающие иммуномодулирующей активностью, часто оцениваются с помощью этого набора скрининговых анализов, чтобы лучше направлять дальнейший анализ влияния некоторых пептидов на нейтрофилы человека, поскольку некоторые из них демонстрируют интересные свойстваАФК-43, фагоцитоза, миграции и/или НВЛ-модуляции.

В заключение, NeutroFun Screen предлагает ценный инструмент для идентификации потенциальных модуляторов активности нейтрофилов нормальной плотности из большого количества непроверенных соединений. Однако важно отметить, что этот метод служит только предварительным скринингом. После этого первоначального скрининга более дорогие, продвинутые и трудоемкие методики могут быть направлены на конкретные функции или пути, предложенные этими первыми результатами, для проверки данных. Для продукции АФК, фагоцитоза и образования НВЛ существуют альтернативные методы валидации данных и получения дальнейших количественных результатов. Визуализация и количественная оценка НВЛ могут быть выполнены с помощью иммунофлуоресцентного микроскопического анализа, который определяет наличие и перекрытие внеклеточной ДНК и гранулярных белков, таких как миелопероксидаза и нейтрофильная эластаза, как подробно описано недавно42. АФК играют различную важнейшую роль во многих биологических процессах, и поэтому их изучение весьма широко и разнообразно. К числу наиболее устоявшихся методологий относятся методы, использующие антитела, такие как иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблоттинг люминесценции, или флуоресцентное детектирование, например, проточная цитометрия клеток при различном мечении, с помощью DCFDA, ЭПР-спектроскопии и измерений ферментативной активности44. Аналогичным образом, надежная оценка фагоцитоза также проводится несколькими способами; Альтернативные методы включают только проточную цитометрию45,46 или комбинированную с флуоресцентной микроскопией47. Описанная миграция клеток в режиме реального времени является надежным и достаточным анализом, который не требует дальнейшей проверки и предоставляет параметры, которые не могут быть учтены другими методологиями. Другие комбинации таких методов могут лучше подходить для конкретных сценариев, но в целом это представляет собой быструю и доступную комбинацию, которая охватывает множество активностей нейтрофилов.

Таким образом, это исследование направлено на предоставление набора анализов, состоящего из простых, быстрых и недорогих методологий для оценки множественных реакций нейтрофилов на новые молекулы и условия, чтобы лучше направлять усилия на передовые методологии. В качестве основных ограничений результаты анализов АФК, НЭО и фагоцитоза следует считать предварительными и нуждаются в дальнейшей валидации с помощью более специфичных и сложных анализов, а те, которые полагаются на неавтоматизированный подсчет клеток под микроскопией, склонны к неосознанной предвзятости.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность следующим финансирующим организациям: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP и FINATEC.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CIM-плита 16Agilent 
Считыватель пластин CLARIOstar BMG LABTECHПатент США No 9,733,124
Информация о продукте: Программное обеспечение для анализа данных MARS
ДиметилсульфоксидDinâ слюда1582
DNAse ISigma - AldrichDN 25
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дигидратSigma - AldrichE5134
Быстрая паноптическая краскаLaborclin620529
Предметное стеклоExacta7102
Hank' s Сбалансированный солевой раствор с кальцием, с магнием, без фенола красного.Сигма - Олдрич55037C
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор без хлорида кальция, сульфата магния и бикарбоната натрия.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 
Ламинарный проточный шкафVecoVLFS-12
МикроскопZeiss415501-0101-002Информация о товаре: Смесительный блок Primostar 1
BIOERMB-102
Neubauer улучшенный светлый подкладкаNew Optik1110000
N-формил-метионил-лейцил-фенилаланинSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101разделительная среда
Phorbol 12-миристат 13-ацетатSigma - AldrichP8139
Фосфатная буферизованная таблетка с солевым растворомSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Додецилсульфат натрияCytiva17-1313-01
СоникQsonicaQ125
Трипановый синий растворVetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Анализ клеток в реальном времени (RTCA) DP (двойного назначения)Agilent 380601050Подробная информация о продукте: система RTCA, состоящая из аппаратного обеспечения обнаружения, сотовых пластин и программного обеспечения
56658250017896014655229

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NBT

Похожие статьи