Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание смешанных культур нейрональных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модели центральной нервной системы (ЦНС) должны повторять сложную сеть взаимосвязанных клеток, обнаруженных in vivo. ЦНС состоит в основном из нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии. В связи с растущими усилиями по замене и сокращению использования животных были разработаны различные системы культивирования клеток in vitro для изучения свойств врожденных клеток, которые позволяют разрабатывать терапевтические средства для инфекций и патологий ЦНС. В то время как некоторые исследовательские вопросы могут быть решены с помощью систем культивирования клеток человека, таких как (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки, работа с клетками человека имеет свои собственные ограничения в отношении доступности, затрат и этики. Здесь мы описываем уникальный протокол выделения и культивирования клеток из эмбрионального мозга мыши. Полученные смешанные культуры нервных клеток имитируют несколько клеточных популяций и взаимодействий, обнаруженных в мозге in vivo. По сравнению с текущими эквивалентными методами, этот протокол более точно имитирует характеристики мозга, а также собирает больше клеток, что позволяет исследовать больше экспериментальных условий на одной беременной мыши. Кроме того, протокол относительно прост и легко воспроизводим. Эти культуры были оптимизированы для использования в различных масштабах, включая высокопроизводительные экраны на 96 лунок, 24-луночный микроскопический анализ и 6-луночные культуры для проточной цитометрии и количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Этот метод культивирования является мощным инструментом для исследования инфекции и иммунитета в контексте некоторой сложности ЦНС с удобством методов in vitro .
Введение
Улучшение нашего понимания центральной нервной системы (ЦНС) имеет решающее значение для улучшения терапевтических возможностей для многих нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. ЦНС, сложная сеть взаимосвязанных клеток в головном, спинном мозге и зрительных нервах, включает нейроны, олигодендроциты, астроциты и их врожденные иммунные клетки, микроглию1. Подход in vitro часто может резко сократить количество мышей, необходимых для проведения значимых исследований; однако сложная природа ЦНС делает невозможным повторение ситуации in vivo с использованием клеточных линий. Смешанные культуры нервных клеток представ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных соответствовали местным законам и рекомендациям по использованию животных и были одобрены местным комитетом по этической экспертизе в Университете Глазго. Животные были размещены в особых условиях, свободных от патогенов, в соответствии с Законом Великобритании о научных процедурах животных 1986 года под эгидой лицензии на проект Министерства внутренних дел Великобритании. Для этого исследования были использованы взрослые мыши C57BL/6J, выведенные собственными силами. Использование молодым женщинам (8-12 недель) рекомендуется из-за более высокой успешности беременности; Самцов можно повторно использовать для нескольких раундов разведения. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Микроскопия
Культуры, выращенные на стеклянных покровных стеклах, идеально подходят для анализа с помощью микроскопии. Чтобы визуализировать развитие культур, покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в нескольких временных точках от DIV0 (после присоединения клеток) до DIV28. Культуры окрашивали для иммунофлуоресцентной визуализации, как описаноранее 5 , с использованием трех различных комбинаций окрашивания: NG2 (незрелые олигодендроциты) и нестин (нейрональны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ЦНС представляет собой сложную сеть, которая простирается от головного мозга до спинного мозга и состоит из многих типов клеток, преимущественно нейронов, олигодендроцитов, астроцитов и микроглии1. Поскольку каждая клетка играет важную роль в поддержании гомеостаза и выработке соответствующих ответов на вызовы в ЦНС 9,10,11, культуральная система, содержащая все эти типы клеток, является полезным и универсальным инструментом для исследования того,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эдгара и Линингтона, в частности профессора Криса Линингтона, доктора Диану Арсени и доктора Катю Мюклиш, за их советы, полезные комментарии и помощь в кормлении культур, пока мы создавали эти культуры. Особая благодарность д-ру Мюклишу (Dr. Muecklisch) за то, что он предоставил отправные точки для конвейеров Cell Profiler. Работа выполнена при поддержке Общества рассеянного склероза (грант 122) и Фонда Юрия и Лорны Чернайовских при МП; Университет Глазго финансирует JC и MP; и Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) и Совет по медицинским исследованиям (MRV0109721) в GJG.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x Трипсин | Sigma | T4549-100ML | Для переваривания тканей |
| 140 мм TC Dish | Fisher | 11339283 | Положите 8 посуды 35 мм на 1 чашку 140 мм |
| 15 мл Falcon | Sarstedt | 62554502 | Для сбора клеток в гранулы для ресуспензии в гальванических средах |
| 18 G игла | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Для растирания образца |
| 21 Г игла | BD | 304432 | Для растирания образца |
| 23 G игла | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Для растирания образца |
| 35 мм TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 покрытых PLL покровных стекла на 1 чашку 35 мм |
| Шприц 5 мл | Fisher | 15869152 | Для растирания образца |
| 6 лунок планшет | Corning | 3516 | Для разминирования ячеек для RT-qPCR, и поток цитометрия |
| 7 мл Bijoux | Fisher | DIS080010R | Для постановки мозгов intp |
| 96 луночный планшет | Corning | 3596 | Для выделения клеток для высокопроизводительного тестирования |
| ACSA-2 Антитело, антимышиное, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Для проточной цитометрии окрашивание астроцитов |
| Угловые щипцы | Dumont | 0108-5/45-PO | Для диссекции |
| Biotin | Sigma | B4501 | Для DM+/- |
| борной кислоты | Sigma | B6768-500G | Для буфера борной кислоты |
| Brilliant Violet 421 антимышиный CD24 Антитело, клон M1-69 | Biolegend | 101825 | Для проточной цитометрии окрашивания нейронов и астроцитов |
| Brilliant Violet 605 антимышиный CD45 Антитело, клон 30-F11 | Biolegend | 103139 | Для проточной цитометрии окрашивания микроглии |
| Brilliant Violet 785 антимышиный/человеческий CD11b Антитело, клон M1/70 | Biolegend | 101243 | Для проточной цитометрии окрашивание микроглии |
| BSA Фракция V | Sigma | A3059-10G | Для ингибитора SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Зрелые олигодендроциты |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | Для выделения клеток для микроскопии |
| Диссекционные ножницы | Sigma | S3146-1EA | Для рассечения |
| DMEM Высокий уровень глюкозы, пируват натрия, L-глутамин | Gibco | 21969-035 | Для DM+/-, а также для покрытия сред |
| DNаза I | Thermofisher | 18047019 | Для ингибитора SD, можно использовать эту или другую Dnase из сигма |
| DNase I | Sigma | D4263 | Для ингибитора SD, можно использовать эту или другую Dnase от Thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Живое / мертвое пятно |
| Тонкие щипцы | Dumont | 0102-SS135-PO | Для диссекции |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Астроциты |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Для гальванических сред |
| HBSS без Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Для добавления мозгов в |
| Лошадиную сыворотку | Gibco | 26050-070 | Для гальванических сред |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | Для DM+/ |
| -Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | микроглии |
| Sigma | I1882 | Для DM+ | |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Для ингибитора SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | миелина |
| Мышь CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA Kit для количественного определения концентрации CCL5 в надосадочной жидкости 96 лунок |
| N1 медиа добавка | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Нейрональные стволовые/прогениторные клетки |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Тело нейрональной клетки |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Антитела к незрелым олигодендроцитам |
| O4, антитела к человеку/мыши/крысе, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Для проточной цитометрии окрашивания олигодендроцитов |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Для DM+/-, и для гальванических сред |
| Poly-L-лизингидробромид | Sigma | P1274 | Для раствора борной кислоты/поли-L-лизина для покрытия покровных листов |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Аксоны |
| Тетраборат натрия | Sigma | 221732-100G | Для буфера борной кислоты |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Для лизирования клеток для ОТ-кПЦР |
| Ингибитор трипсина из сои | Sigma | T9003-100MG | Для ингибитора SD |
Ссылки
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
