Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание смешанных культур нейрональных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модели центральной нервной системы (ЦНС) должны повторять сложную сеть взаимосвязанных клеток, обнаруженных in vivo. ЦНС состоит в основном из нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии. В связи с растущими усилиями по замене и сокращению использования животных были разработаны различные системы культивирования клеток in vitro для изучения свойств врожденных клеток, которые позволяют разрабатывать терапевтические средства для инфекций и патологий ЦНС. В то время как некоторые исследовательские вопросы могут быть решены с помощью систем культивирования клеток человека, таких как (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки, работа с клетками человека имеет свои собственные ограничения в отношении доступности, затрат и этики. Здесь мы описываем уникальный протокол выделения и культивирования клеток из эмбрионального мозга мыши. Полученные смешанные культуры нервных клеток имитируют несколько клеточных популяций и взаимодействий, обнаруженных в мозге in vivo. По сравнению с текущими эквивалентными методами, этот протокол более точно имитирует характеристики мозга, а также собирает больше клеток, что позволяет исследовать больше экспериментальных условий на одной беременной мыши. Кроме того, протокол относительно прост и легко воспроизводим. Эти культуры были оптимизированы для использования в различных масштабах, включая высокопроизводительные экраны на 96 лунок, 24-луночный микроскопический анализ и 6-луночные культуры для проточной цитометрии и количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Этот метод культивирования является мощным инструментом для исследования инфекции и иммунитета в контексте некоторой сложности ЦНС с удобством методов in vitro .
Введение
Улучшение нашего понимания центральной нервной системы (ЦНС) имеет решающее значение для улучшения терапевтических возможностей для многих нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. ЦНС, сложная сеть взаимосвязанных клеток в головном, спинном мозге и зрительных нервах, включает нейроны, олигодендроциты, астроциты и их врожденные иммунные клетки, микроглию1. Подход in vitro часто может резко сократить количество мышей, необходимых для проведения значимых исследований; однако сложная природа ЦНС делает невозможным повторение ситуации in vivo с использованием клеточных линий. Смешанные культуры нервных клеток представляют собой чрезвычайно ценный исследовательский инструмент для изучения вопросов нейро(иммуно)логии в соответствующей модели в соответствии с принципами замены, сокращения и уточнения (3R) 2,3.
Thomson et al. описали метод культивирования клеток с использованием пренатальных клеток спинного мозга, которые дифференцируются во все вышеупомянутые основные типы клеток ЦНС4. Эта система также имеет образование синапсов, миелинизированные аксоны и узлы Ранвье. Основным ограничением этого метода культивирования является то, что, будучи спинным мозгом, он не может с пользой моделировать головной мозг, и клетки, полученные на 13-й день эмбриона (E13), сжимают спинной мозг. Таким образом, это ограничивает количество экспериментальных условий, которые могут быть исследованы. Таким образом, это исследование было направлено на разработку новой системы клеточных культур, которая повторяет характеристики мозга с повышенным выходом клеток, чтобы снизить требования к животным.
Используя Thomson et al. в качестве отправной точки, мы разработали модель клеточной культуры, полученную исключительно из пренатального мозга мыши. Эти культуры имеют те же клеточные популяции, взаимосвязь и варианты лечения, что и культуры спинного мозга, за исключением того, что по сравнению с ними миелинизация меньше. Однако наличие модели ЦНС in vitro с примерно в три раза более высоким выходом клеток является более эффективным, требуя меньшего количества мышей и меньшего времени на обработку эмбрионов. Мы оптимизировали эту уникальную систему культивирования для различных последующих применений и масштабов, в том числе с использованием стеклянных покровных стекол для микроскопического анализа и пластиковых луночных пластин различных размеров, включая 96-луночные планшеты для высокопроизводительных исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных соответствовали местным законам и рекомендациям по использованию животных и были одобрены местным комитетом по этической экспертизе в Университете Глазго. Животные были размещены в особых условиях, свободных от патогенов, в соответствии с Законом Великобритании о научных процедурах животных 1986 года под эгидой лицензии на проект Министерства внутренних дел Великобритании. Для этого исследования были использованы взрослые мыши C57BL/6J, выведенные собственными силами. Использование молодым женщинам (8-12 недель) рекомендуется из-за более высокой успешности беременности; Самцов можно повторно использовать для нескольких раундов разведения. На фиг.1 представлен схематический обзор описанного способа получения смешанных культур нейронов и глии.
1. Подготовка расходных материалов для тканевых культур
- Подготовьте пластины и/или посуду, содержащие покровные стекла для микроскопии, в шкафу безопасности класса 2. Стерилизуйте все реагенты или автоклав, чтобы обеспечить стерильность в период культивирования.
- Добавьте соответствующий объем БА-ФАПЧ (13,2 мкг/мл поли-L-лизинегидробромида [ФАПЧ] в буфере борной кислоты [БА] [50 мМ борной кислоты, 12,5 мМ тетрабората натрия, рН 8,5]; см. Таблицу материалов) в каждую лунку (1000 мкл / лунка в 6-луночном планшете, 100 мкл / лунка в 96-луночном планшете; объемы обобщены в таблице 1). Для микроскопических покровных стекол добавьте 20 мл BA-PLL в чашку для культивирования тканей диаметром 9 см, содержащую 200 стерильных покровных стекол, и перемешайте для равномерного распределения.
- Инкубировать при 37 °C в течение 1-2 часов.
- Удалите раствор BA-PLL из каждой лунки или чашки, содержащей покровные стекла для микроскопии, и промойте, добавив 20 мл стерильной воды, взбалтывая покровные стекла, а затем удаляя воду. Повторите этот шаг стирки три раза. Для посуды, содержащей покровные стекла, оставьте стерильную воду в чашке для культивирования тканей при окончательной стирке, чтобы легко удалить покровные стекла.
- Удалите как можно больше жидкости стерильной пипеткой и дайте высохнуть не менее 2 часов на ночь.
- Храните пластины с покрытием при температуре 4 °C до 2 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленную борную кислоту с раствором поли-l-лизина (BA-PLL) можно использовать повторно до трех раз, каждый раз добавляя новый ФАПЧ. Хранить BA-PLL при температуре 4 °C. Чашки обрабатываются BA-PLL, так как PLL позволяет клеткам прилипать и расти. Без этого лечения клетки поднимутся примерно через 1 неделю культивирования и больше не смогут дифференцироваться.
2. Вскрытие эмбрионального мозга Е17
- Разместите одну или несколько самок мышей вместе с мышью-самцом. Ежедневно проверяйте самок на наличие слизистой пробки, указывающей на то, что спаривание состоялось.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые «заткнутые» самки мышей должны быть отделены от самца, чтобы обеспечить правильную дату начала беременности. Мышей можно взвешивать для подтверждения беременности или контролировать визуально. - Выбраковка беременной мыши на E17 с использованием соответствующих методов в соответствии с местными рекомендациями и законами о защите животных, например, путем повышения концентрации углекислого газа (CO2), передозировки смертельного анестетика или вывиха шеи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный метод не должен нарушать эмбрионы. Для этого исследования воздействие растущей концентрации углекислого газа с последующим подтверждением смерти путем разрыва бедренной артерии использовалось для отбраковки беременных маток. - Положите выбракованную беременную мышь на спину на доску для вскрытия; Хотя закрепление его не требуется, это может облегчить задачу неопытным исследователям. Ущипните среднюю линию живота с помощью щипцов. С помощью острых ножниц разрежьте живот через кожу и брюшину по средней линии от гениталий до грудной клетки, стараясь не проколоть матку.
- Матка мыши имеет два рога, каждый из которых обычно содержит от одного до пяти эмбрионов. Извлеките матку, содержащую эмбрионы, из матери и сразу же поместите ее на лед.
- Разрежьте желточный мешок сбоку от плаценты, стараясь не повредить эмбрионы, и извлеките эмбрионы из желточного мешка.
- Немедленно обезглавливают эмбрионы. Добавьте обезглавленные головы в чашку со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) без кальция (Ca 2+) и магния (Mg2+) (HBSS-/-) на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется генотипирование, на этом этапе можно удалить хвост для генетического анализа. Когда ожидается несколько генотипов, головки каждого эмбриона следует хранить отдельно для культивирования. - Используя угловые щипцы, расположите голову на боку, обращенном влево.
- Проткните глаз одним краем щипцов, крепко придерживая подбородок другим.
- Начиная с затылка, аккуратно разорвите кожу кожи головы по средней линии к кончику морды.
- Войдя через спинной мозг, заметный как белый овал, используйте угловые щипцы, чтобы расколоть череп по средней линии, обнажив мозг.
- Аккуратно снимите череп со стороны, обращенной вверх, обнажая мозг.
- Извлеките мозг из черепа, избавившись от черепа, как только мозг будет полностью удален.
- С помощью щипцов удаляют мозговые оболочки, которые заметны как тонкая мембрана с плотными кровеносными сосудами.
- Поместите мозг в бижутерию (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл HBSS-/- на льду.
- Повторите шаги с 2.6 по 2.13 с оставшимися мозгами, добавив до четырех мозгов на бижутерию.
- Добавьте 250 мкл 10-кратного трипсина в бижутерию и тритуируйте мозг, встряхивая бижутерию. Выдерживать 15 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, начиная с этого момента, должны выполняться в стерильном капюшоне для культивирования тканей. - Разморозьте 2 мл ингибитора трипсина (SD) сои (Leibovitz L-15, 0,52 мг/мл ингибитора трипсина из сои, 40 мкг/мл ДНКазы I, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [BSA] фракции V; см. Таблицу материалов) от -20 °C, поместив его при 37 °C.
- Добавьте 2 мл ингибитора SD к каждому бижутерии, содержащему мозг (на бижутерию, содержащую до четырех мозгов), снова встряхивая бижутерию, чтобы равномерно распределить ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор SD снижает активность трипсина, предотвращая ненужное переваривание образцов и сохраняя жизнеспособность клеток. - Без центрифугирования удалите 2 мл надосадочной жидкости из каждого бижутерии и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не переносить клеточные сгустки.
- Тритуируйте оставшиеся клетки в бижутерии иглой 19 г, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, путем двойной аспирации суспензии. Это создаст густую слизеобразную смесь.
- Повторите еще дважды, используя иглу 21 G. Если остались комки, тритуируйте еще раз иглой 21 G.
- Перенесите клетки из бижутерии в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл (из шага 2.18) с помощью иглы 23 G.
- Центрифуга при 200 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Удалите всю надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и перенесите ее в другую центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не нарушить рыхлую гранулу на дне, содержащую необходимые клетки.
- Снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 200 x g при RT в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является существенным, но если требуется много клеток или мало эмбрионов, можно выполнить этот шаг, чтобы извлечь как можно больше клеток из надосадочной жидкости. - Используя 10 мл гальванических сред (PM) (49% модифицированной орлиной среды Дульбекко [DMEM], 1% пенициллина/стрептомицина [Pen/Strep], 25% лошадиной сыворотки, 25% HBSS с Ca 2+ и Mg2 + [HBSS+ /+]; см. Таблицу материалов), объедините и ресуспендируйте две гранулы вместе, чтобы создать целую клеточную суспензию.
- Подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра или цифрового счетчика клеток и разбавьте клеточную суспензию PM до концентрации 1,8 x 106 клеток / мл.
3. Покрытие ячеек
- Добавьте требуемый объем суспензии ячейки к требуемому формату, как указано в таблице 1: 1000 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 100 мкл на покровное стекло.
- Инкубировать в течение 2-4 ч при 37 °C с 5%-7%CO2. Проверьте прилипание клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Удалите среду и долейте ее новой дифференцировочной средой (СД+: СД, включая инсулин 10 мкг/мл. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 нМ гидрокортизон, 10 нг/мл биотина, 2,5 мл 100x N1 добавки среды; см. Таблицу материалов). Объемы приведены в таблице 1. Прижмите все плавающие покровные стекла стерильным наконечником пипетки.
4. Уход за культурами
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры требуют подкормки три раза в неделю для поддержания оптимального роста и дифференциации. Культуры достигнут оптимального здоровья и зрелости для экспериментов на DIV (дни in vitro) 21. Клетки могут храниться в культуре до 28 дней, после чего культуры быстро вырождаются.
- Три раза в неделю до DIV12 заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM+, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на посуду, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).
- Три раза в неделю, начиная с DIV13, заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM-, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на чашку, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Микроскопия
Культуры, выращенные на стеклянных покровных стеклах, идеально подходят для анализа с помощью микроскопии. Чтобы визуализировать развитие культур, покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в нескольких временных точках от DIV0 (после присоединения клеток) до DIV28. Культуры окрашивали для иммунофлуоресцентной визуализации, как описаноранее 5 , с использованием трех различных комбинаций окрашивания: NG2 (незрелые олигодендроциты) и нестин (нейрональны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ЦНС представляет собой сложную сеть, которая простирается от головного мозга до спинного мозга и состоит из многих типов клеток, преимущественно нейронов, олигодендроцитов, астроцитов и микроглии1. Поскольку каждая клетка играет важную роль в поддержании гомеостаза и выработке соответствующих ответов на вызовы в ЦНС 9,10,11, культуральная система, содержащая все эти типы клеток, является полезным и универсальным инструментом для исследования того,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эдгара и Линингтона, в частности профессора Криса Линингтона, доктора Диану Арсени и доктора Катю Мюклиш, за их советы, полезные комментарии и помощь в кормлении культур, пока мы создавали эти культуры. Особая благодарность д-ру Мюклишу (Dr. Muecklisch) за то, что он предоставил отправные точки для конвейеров Cell Profiler. Работа выполнена при поддержке Общества рассеянного склероза (грант 122) и Фонда Юрия и Лорны Чернайовских при МП; Университет Глазго финансирует JC и MP; и Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) и Совет по медицинским исследованиям (MRV0109721) в GJG.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x Трипсин | Sigma | T4549-100ML | Для переваривания тканей |
| 140 мм TC Dish | Fisher | 11339283 | Положите 8 посуды 35 мм на 1 чашку 140 мм |
| 15 мл Falcon | Sarstedt | 62554502 | Для сбора клеток в гранулы для ресуспензии в гальванических средах |
| 18 G игла | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Для растирания образца |
| 21 Г игла | BD | 304432 | Для растирания образца |
| 23 G игла | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Для растирания образца |
| 35 мм TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 покрытых PLL покровных стекла на 1 чашку 35 мм |
| Шприц 5 мл | Fisher | 15869152 | Для растирания образца |
| 6 лунок планшет | Corning | 3516 | Для разминирования ячеек для RT-qPCR, и поток цитометрия |
| 7 мл Bijoux | Fisher | DIS080010R | Для постановки мозгов intp |
| 96 луночный планшет | Corning | 3596 | Для выделения клеток для высокопроизводительного тестирования |
| ACSA-2 Антитело, антимышиное, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Для проточной цитометрии окрашивание астроцитов |
| Угловые щипцы | Dumont | 0108-5/45-PO | Для диссекции |
| Biotin | Sigma | B4501 | Для DM+/- |
| борной кислоты | Sigma | B6768-500G | Для буфера борной кислоты |
| Brilliant Violet 421 антимышиный CD24 Антитело, клон M1-69 | Biolegend | 101825 | Для проточной цитометрии окрашивания нейронов и астроцитов |
| Brilliant Violet 605 антимышиный CD45 Антитело, клон 30-F11 | Biolegend | 103139 | Для проточной цитометрии окрашивания микроглии |
| Brilliant Violet 785 антимышиный/человеческий CD11b Антитело, клон M1/70 | Biolegend | 101243 | Для проточной цитометрии окрашивание микроглии |
| BSA Фракция V | Sigma | A3059-10G | Для ингибитора SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Зрелые олигодендроциты |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | Для выделения клеток для микроскопии |
| Диссекционные ножницы | Sigma | S3146-1EA | Для рассечения |
| DMEM Высокий уровень глюкозы, пируват натрия, L-глутамин | Gibco | 21969-035 | Для DM+/-, а также для покрытия сред |
| DNаза I | Thermofisher | 18047019 | Для ингибитора SD, можно использовать эту или другую Dnase из сигма |
| DNase I | Sigma | D4263 | Для ингибитора SD, можно использовать эту или другую Dnase от Thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Живое / мертвое пятно |
| Тонкие щипцы | Dumont | 0102-SS135-PO | Для диссекции |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Астроциты |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Для гальванических сред |
| HBSS без Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Для добавления мозгов в |
| Лошадиную сыворотку | Gibco | 26050-070 | Для гальванических сред |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | Для DM+/ |
| -Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | микроглии |
| Sigma | I1882 | Для DM+ | |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Для ингибитора SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | миелина |
| Мышь CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA Kit для количественного определения концентрации CCL5 в надосадочной жидкости 96 лунок |
| N1 медиа добавка | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Нейрональные стволовые/прогениторные клетки |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Тело нейрональной клетки |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Антитела к незрелым олигодендроцитам |
| O4, антитела к человеку/мыши/крысе, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Для проточной цитометрии окрашивания олигодендроцитов |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Для DM+/-, и для гальванических сред |
| Poly-L-лизингидробромид | Sigma | P1274 | Для раствора борной кислоты/поли-L-лизина для покрытия покровных листов |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Аксоны |
| Тетраборат натрия | Sigma | 221732-100G | Для буфера борной кислоты |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Для лизирования клеток для ОТ-кПЦР |
| Ингибитор трипсина из сои | Sigma | T9003-100MG | Для ингибитора SD |
Ссылки
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117(2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
