Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Свиная нормотермная изолированная перфузия печени

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65336

⸱

9 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

В этой статье

Краткое содержание

Описанная здесь модель нормотермической машинной перфузии печени (НМП) у свиней может быть успешно использована для изучения НМП в качестве стратегии сохранения, инструмента для оценки жизнеспособности и платформы для восстановления органов. Он имеет высокую трансляционную ценность, однако является технически сложным и трудоемким.

Аннотация

Модели печени ex situ с помощью нормотермической машинной перфузии (NMP) на свиньях все чаще используются в исследованиях в области трансплантации. В отличие от грызунов, печень свиней анатомически и физиологически близка к человеку, имеет схожий размер органов и состав желчи. NMP сохраняет трансплантат печени в условиях, близких к физиологическим, путем рециркуляции теплого, насыщенного кислородом и обогащенного питательными веществами перфузата на основе эритроцитов через сосудистую сеть печени. NMP может быть использован для изучения ишемии-реперфузионного повреждения, сохранения печени ex situ до трансплантации, оценки функции печени до имплантации, а также обеспечения платформы для восстановления и регенерации органов. В качестве альтернативы можно использовать NMP с перфузатом на основе цельной крови для имитации трансплантации. Тем не менее, эта модель трудоемка, технически сложна и сопряжена с большими финансовыми затратами.

В этой модели NMP свиней мы используем теплую ишемически поврежденную печень (соответствующую донорству после смерти от кровообращения). Сначала инициируется общая анестезия с искусственной вентиляцией легких, за которой следует индукция теплой ишемии путем пережатия грудной аорты в течение 60 минут. Канюли, вставленные в брюшную аорту и воротную вену, позволяют промывать печень раствором для консервации холода. Вымытую кровь промывают с помощью клеточного сейвера для получения концентрированных эритроцитов. После гепатэктомии канюли вставляются в воротную вену, печеночную артерию и инфрапеченочную полую вену и подключаются к замкнутому контуру перфузии, заполненному плазменным экспандером и эритроцитами. В контур включен оксигенатор из полых волокон, соединенный с теплообменником для поддержания pO2 70-100 мм рт.ст. при 38 °C. NMP достигается непрерывным потоком непосредственно через артерию и через венозный резервуар через воротную вену. Потоки, давление и показатели газов в крови постоянно контролируются. Для оценки повреждения печени перфузат и ткань отбираются в заранее определенные моменты времени; Желчь собирается через канюлю в общем желчном протоке.

Введение

Трансплантация печени является единственным окончательным методом лечения терминальной стадии печеночной недостаточности; Однако его успех ограничен устойчивым дисбалансом между пациентами, находящимися в листе ожидания, и наличием потенциальных донорских органов1. Для увеличения пула доноров в последнее десятилетие критерии донорства постепенно расширялись, включая более высокий возраст донора, стеатоз печени и донорство после смерти от кровообращения (DCD)2,3. Во время процедуры DCD печень неизменно страдает от периода теплой ишемии между отменой жизнеподдерживающей терапии, констатацией смерти, а также охлаждением и сохранением in situ, усугубляющим ишемическое реперфузионное повреждение (IRI)4. В результате ДКД печени ассоциированы с повышенной частотой ранней дисфункции аллотрансплантата и билиарных осложнений 5,6.

Для этих донорских печени с высоким риском традиционная консервация со статическим хранением в холодильнике не обеспечивает достаточной защиты от ИРИ. К настоящему времени значительное распространение получили альтернативные стратегии консервации, такие как нормотермическая машинная перфузия (NMP). Во время нормотермной аппаратной перфузии печень подключается ex situ к изолированной цепи и перфузируется насыщенным кислородом и обогащенным питательными веществами перфузатом при температуре тела. Клинические испытания показывают, что NMP снижает гепатоцеллюлярное повреждение, что отражается в снижении пикового высвобождения трансаминаз и ранней дисфункции аллотрансплантата7. Тем не менее, мало что известно о биологии клеток печени во время NMP8.

Животные модели сыграли ключевую роль в эволюции трансплантации печени. В отличие от моделей грызунов, считается, что свинья имеет более высокую трансляционную ценность, так как печень свиньи анатомически и физиологически близка к человеку, имеет схожий размер органов и состав желчи. Тем не менее, модели трансплантации печени свиней трудоемки, их трудно стандартизировать и они требуют значительно более высоких финансовых затрат.

Свиная печень NMP может использоваться для различных целей. Он может быть применен для имитации трансплантации ex situ при использовании перфузата на основе цельной крови, для сохранения донорской печени в защитной среде с помощью перфузата на основе эритроцитов, обедненного лейкоцитами, для оценки потенциальных биомаркеров, предсказывающих функцию печени ex situ до трансплантации, или в качестве платформы для исследования регенеративной терапии 9,10,11.

Внедрение моделей NMP печени свиньи является сложной задачей, в то время как технические аспекты, связанные с хирургией и перфузией, практически не описаны. В нашей исследовательской лаборатории мы приняли установку NMP, первоначально описанную Butler et al.12 , для разработки и валидации 24-часовой модели изолированной перфузии печени свиней ex situ, которая может быть использована как для сохранения трансплантата печени для трансплантации, так и для имитации трансплантата. Здесь мы опишем пошаговый протокол; Методологическая основа и потенциальные подводные камни опубликованы в других документах9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились после одобрения комитета по уходу за животными Лёвенского католического университета и в соответствии с европейскими рекомендациями.

1. Информация о животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного протокола исследования используются самцы свиней TOPIGS TN70 в возрасте 3 месяцев, с массой тела около 30 кг и массой печени 600-700 г.

  1. Содержите животных в 12-часовом дневном и ночном ритме в одиночных загонах со свободным доступом к пище и водопроводной воде и визуальным, обонятельным и слуховым контактом между ними.
  2. Убедитесь, что животные прибывают как минимум за 2 дня до операции, чтобы привыкнуть к окружающей среде. Голодайте свиней в течение 12 часов до операции со свободным доступом к воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия поддерживается изофлураном и анальгезия фентанилом. На протяжении всей анестезии постоянно контролируются электрокардиограмма, пульсоксиметрия, капнография и артериальное давление. Эксперименты неизлечимы; Свиней усыпляют путем обескровливания во время извлечения печени под непрерывной общей анестезией и обезболиванием.

2. Подготовка перфузионной установки

  1. Установка одноразового перфузионного набора
    1. Закрепите резервуар на фиксированной высоте примерно на 15 см выше печеночного сосуда.
    2. Подсоедините головку насоса к специальному слоту на центробежном насосе. Подсоедините кислородную трубку к оксигенатору. Подсоедините входную и выходную трубки нагревателя/охладителя к специальным прорезям на оксигенаторе.
    3. Установите один пережимной клапан на выпускную трубку под резервуаром. Установите второй пережимной клапан на входной трубке к резервуару после Y-образного соединения, где другая трубка будет питать печеночную артерию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый пережимной клапан будет контролировать приток в воротную вену. Закрытие второго пережимательного клапана увеличит кровоток, а значит, и давление в печеночной артерии.
    4. Установите датчик расхода дистальнее первого пережимательного клапана на выпускную трубку резервуара. Установите второй датчик расхода на впускную трубку к головке насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый датчик потока будет измерять поток в воротную вену. Второй датчик расхода будет измерять отток из полой вены.
    5. Отрежьте отводящую трубку от оксигенатора и вставьте артериальный фильтр в правильном направлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте трубку не длиннее 2 см после оксигенатора; Если его оставить слишком длинным, он перевернется, когда трубка станет мягче при перфузации перфузатом при температуре 37 °C. Если он все еще перегибается, поддержите артериальный фильтр, привязав его к опоре резервуара.
  2. Установка трубки рециркуляции утечек
    1. Перфузионный набор содержит две трубки с одним концом 3/16 и одним концом 1/16. Соедините две трубки друг с другом, вставив конец 1/16 в конец 3/16. Подсоедините конец 3/16 к резервуару.
    2. Установите трубку в роликовый насос, учитывая направление вращения. Установите правильный диаметр трубки и установите скорость на 15-18 оборотов в минуту (об/мин). Поместите конец 1/16 в печеночный сосуд и при необходимости зафиксируйте.
  3. Непрерывная калибровка поточного анализа газов крови
    1. Включите газоанализатор и выберите Калибровка.
    2. Проверьте правильность серийного номера на упаковке датчика и нажмите OK.
    3. Извлеките держатель артериального датчика из кассеты и подключите к нему датчик с синим колпачком сверху и белым фильтром снизу.
    4. Открутите и снимите белый колпачок под фильтром; Не откручивайте сам фильтр. Ослабьте синюю вентиляционную крышку сверху, не снимайте ее. Плотно вставьте датчик и держатель датчика в калибровочную кассету.
    5. Начните калибровку. После завершения калибровки извлеките датчик и держатель датчика из калибровочной кассеты. Снимите белый фильтр снизу и затяните синий вентиляционный колпачок сверху.
    6. Вставьте датчик в линию отбора проб перфузионного комплекта. Не приступайте к анализу газов до тех пор, пока контур перфузии не будет загрунтован.
  4. Грунтовка цепи
    1. Вставьте инфузионную линию в мешок с плазменным экспандером объемом 500 мл и прикрепите его к резервуару. Поместите зажим для трубки на линию истечения резервуара и заполните резервуар 300 мл плазменного расширителя.
    2. Снимите зажим трубки и дайте плазменному расширителю заполнить контур
    3. Обеспылите воздух из головки насоса и оксигенатора. Теперь цепь заправлена. Включите обогреватель/охладитель и установите его на 38 °C
  5. Подготовка инфузионных линий
    1. Наберите 5 мл (25 000 ЕД) раствора гепарина 5 ЕД/мл в шприц объемом 50 мл. Внесите дополнительно 25 мл 0,9% раствора NaCl, чтобы получить общий объем 30 мл раствора гепарина (скорость инфузии: 1 мл/ч).
    2. Растворите 5 г таурохолата натрия в 50 мл 0,9% NaCl и наберите его в 450 мл 0,9% NaCl до достижения концентрации 1%. Необходим общий объем 168 мл (скорость инфузии: 7 мл/ч).
    3. Наберите 2 мл (200 ЕД) раствора инсулина в концентрации 100 ЕД/мл в шприц объемом 50 мл. Наберите дополнительно 28 мл 0,9% раствора NaCl, чтобы получить общий объем 30 мл раствора инсулина (скорость инфузии: 1 мл/ч).
    4. Наберите 10 мл глицинового буфера (разбавителя) и добавьте его во флакон 0,5 мг эпопростенола. С помощью микробного фильтра, входящего в комплект эпопростенола, наберите 5 мл из флакона, содержащего эпопростенол, восстановленный с глициновым буфером, в шприце объемом 50 мл. Внесите еще 25 мл 0,9% раствора NaCl, чтобы получить общий объем 30 мл раствора эпопростенола (скорость инфузии: 1 мл/ч).

3. Индукция анестезии

  1. Успокоение
    1. Подготовьте шприц с 2 мг/кг ксилазина и 8 мг/кг Золетила (4 мг/кг тилетамина и 4 мг/кг золазепама), шприц с 10 мл 0,9% NaCl, трехходовой клапан, удлинительную катетерь и внутримышечную иглу 21 G.
    2. Поместите иглу в ягодичную мышцу, введите смесь ксилазина и тилетамина и промойте линию разгибания 0,9% NaCl. Через 15 мин свинью вводят седативные препараты.
    3. Взвесьте свинью и транспортируйте ее в операционную.
  2. Анестезия
    1. Включите аппарат искусственной вентиляции легких
    2. Поместите свинью в лежачем положении на операционный стол и зафиксируйте конечности.
    3. Предварительно насытите кислородом с помощью вентиляционной маски с 1,5 лО2, 1,5 л воздуха и 1% изофлурана.
    4. Прикрепите зонд насыщения к хвосту или уху. Подключите три отведения электрокардиограммы для непрерывного мониторинга.
    5. Вставьте катетер 22 G в ушную вену, подключите к трехходовому клапану и начните капельное введение внутривенных (IV) жидкостей (плазмалита) со скоростью 400 мл/ч.
    6. Поместите шприц объемом 60 мл с фентанилом 50 мкг/мл в автоматический драйвер шприца. Дайте болюс объемом 1 мл и начните непрерывную инфузию со скоростью 0,16 мл/кг/ч.
    7. Снимите вентиляционную маску и вставьте ларингоскоп, приподняв надгортанник. Вставьте эндотрахеальную трубку в трахею и надуйте баллон, чтобы предотвратить утечку воздуха. Зафиксируйте трубку скотчем к рылу свиньи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте изофлуран при снятии вентиляционной маски.
    8. Подсоедините эндотрахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки аппарата ИВЛ: дыхательный объем 0,4 л; 0,5 кПа среднее давление в дыхательных путях; давление в дыхательных путях 2,5 кПа; положительное давление в конце выдоха 0,5 кПа; частота 15/мин; 4,7-5,3 кПа в конце прилива CO2.
    9. Подсоедините капнограф к эндотрахеальной трубке.

4. Хирургия

  1. Глубокий венозный катетер и артериальная линия
    1. Продезинфицируйте операционное поле бетадином и поместите простыни по обе стороны от средней линии.
    2. Сделайте разрез длиной 7 см с левой стороны верхней части грудины латерально к грудино-ключично-сосцевидной мышце и установите ортостатический ретрактор.
    3. Рассеките подкожную клетчатку от мышцы в боковом направлении и определите наружную яремную вену. Рассеките жилку свободно, перевязывая боковые ветви, если таковые имеются.
    4. Наложите две лигатуры 2/0 вокруг наружной яремной вены и перевяжите краниальную лигатуру.
    5. Разрежьте каудальную вену от перевязанной лигатуры и вставьте 12 французский венозный катетер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением убедитесь, что венозный катетер промыт гепаринизированным физиологическим раствором.
    6. Зафиксируйте катетер второй лигатурой. Если венозный катетер в ушной вене хрупкий или слишком маленький, замените внутривенную жидкость и фентаниловые капельницы на глубокий венозный катетер. В противном случае не стоит употреблять его до тех пор, пока кровь не будет собрана в ячейку.
    7. Рассеките свободный медиальный край грудино-ключично-сосцевидной мышцы и замените ортостатический ретрактор, открывающий плоскость между грудино-ключично-сосцевидной мышцей на латеральной стороне и трахеей на медиальной стороне.
    8. Удалите тимус, чтобы обнажить сонную артерию. Повторите шаг 4.1.4 для артерии.
    9. Введите артериальную литерию в сонной артерии в каудальном направлении и зафиксируйте. Подсоедините артериальную магистраль к магистрали от манометра.
  2. Рассечение аорты и полой вены
    1. Выполните лапаротомию по средней линии от мечевидной кости к лобковой кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У самцов свиней, каудально от полового члена, разрез на 1 см латеральнее от средней линии, чтобы избежать повреждения подкожной уретры.
    2. Пересеките пупочную связку. Установите брюшной ретрактор. Потяните кишки влево латерально и краниально, чтобы визуализировать аорту и полую вену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свиная кишка не вращается; Таким образом, для получения доступа к забрюшинному пространству не требуется мобилизация толстой кишки.
    3. Рассеките на свободе примерно 3 см аорты только краниальной части подвздошной бифуркации и наложите две лигатуры вокруг аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рядом с аортой находится крупный лимфатический сосуд; Будьте осторожны, чтобы не повредить его, так как это приведет к размытию операционного поля и затруднит рассечение.
    4. Рассеките свободную полую вену на том же уровне, что и аорту, и поместите две лигатуры.
  3. Диссекция гастродуоденальной связки
    1. Начните диссекцию с латеральной стороны гастродуоденальной связки, рассеките свободный общий желчный проток и обведите сосудистой петлей.
    2. Втяните желчный проток в медиальную сторону, обнажив воротную вену. Удалить большой лимфатический узел на боковой стороне воротной вены
    3. Освободите воротную вену по направлению к поджелудочной железе; Часто есть ветвь от желудка и поджелудочной железы, которую необходимо перевязать и пересечь. Оберните воротную вену петлей сосуда со стороны печени и лигатурой со стороны поджелудочной железы. Втяните воротную вену сбоку, стараясь не закрывать ее.
    4. Определите общую печеночную артерию и обведите ее сосудистой петлей.
  4. Расслоение грудного отдела аорты
    1. Потяните печень каудально и вскройте центральную сухожильную часть диафрагмы вентрально от надпеченочной полой вены. Втяните пищевод в правую сторону, обнажив грудную аорту.
    2. Рассекайте отдельно от окружающих тканей и будьте осторожны, чтобы не повредить азиготную вену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости окружать грудную аорту; Расслоение должно быть достаточно удлиненным, чтобы установить сосудистый зажим.
  5. Подготовка сберегателя ячейки
    1. Повесьте резервуар в черное кольцо, снимите колпачок с единственной ножки адаптера и прикрепите трубку к выходному отверстию диаметром 3/8 дюйма на дне резервуара для сбора крови.
    2. Отсоедините отсасывающую/антикоагулянтную трубку и подсоедините ее к одному из 1/4-дюймовых отверстий для впуска крови на верхнем краю резервуара для сбора крови.
    3. Вставьте чашу стирального набора, повернув ее; Убедитесь, что слышен щелчок.
    4. Поместите трубку в роликовый насос и делитель трубки.
    5. Повесьте на столб мешок для сбора крови цитратфосфатдекстрозы (CPDA)-1 и убедитесь, что соединение плотно прилегает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав пакета с кровью CPDA-1 (63 мл): 2,99 г/л безводной лимонной кислоты; 26,3 г/л дигидрозного цитрата натрия; 2,22 г/л моногизрата натрия фосфата; 31,9 г/л моногидрата декстрозы; 0,275 г/л аденина.
    6. Повесьте мешок для мусора на боковую сторону машины (убедитесь, что он правильно закрыт) и подключите его к набору для стирки (желтый колпачок).
    7. Соедините обе Y-образные трубки (белые колпачки) с 3 л 0,9% NaCl.
    8. Прикрепите трубку с синим колпачком к переходной трубке на дне резервуара для сбора крови. Включите систему аутотрансфузии.
  6. Канюляция аорты и полой вены
    1. Введите 500 МЕ/кг гепарина и дайте ему циркулировать в течение 2 минут. Завяжите каудальную лигатуру вокруг аорты и вставьте 20 французской канюли в аорту и зафиксируйте. Та же процедура повторяется для полой вены.
  7. Чтобы имитировать процедуру DCD, теплая ишемия индуцируется путем пережатия грудной аорты на определенный период времени, в данном случае на 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время теплой ишемии открывается кавальный и яремный дренаж, и начинается забор крови в ячейку. Это приводит к обескровливанию свиньи.
  8. Промывание печени
    1. В конце теплой ишемии начните холодное промывание 2 л ледяного (4-6 °C) консервирующего раствора через аортальную канюлю и охладите брюшную полость с помощью местного применения слякотного льда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время холодного промывки вся оставшаяся кровь вымывается и собирается в камеру.
    2. Когда первые 2 л будут промыты, извлеките канюлю из аорты, перевяжите лигатуру на воротной вене и канюлируйте воротную вену. Затем зафиксируйте его с помощью петли сосуда.
    3. Промойте печень через воротную вену еще 2 л ледяного (4-6°C) консервационного раствора.
  9. Гепатэктомия
    1. Удалите лед с брюшной полости. Пересеките желчный проток близко к поджелудочной железе.
    2. Удалите портальную канюлю и разделите воротную вену. Втяните кишечник влево, чтобы обнажить подпеченочную полую вену.
    3. Рассеките полую вену, свободную от забрюшинного пространства, и отделите только краниальную от почечных вен. Рассеките общую печеночную артерию до чревной артерии и начало от аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка правой диафрагмы может улучшить экспозицию.
    4. Разделите гастродуоденальную артерию и вырежьте чревную артерию с заплаткой аорты. Пересечь малый сальник близко к желудку краниально до пищевода
    5. Мобилизуйте левую печень, разрезав левую треугольную связку. Разрежьте диафрагму с левой стороны полой вены.
    6. Мобилизуйте правую печень, разрезав правую диафрагму от вентральной к дорсальной, заканчивающуюся каудально от внутрипеченочного пересечения полой вены.
    7. Разрежьте надпеченочную полую вену и отрежьте все оставшиеся насадки. Теперь печень свободна; Выньте его и положите в миску с ледяной водой.
  10. Процедура работы с задним столом
    1. Взвесьте печень. Канюлю воротной вены с помощью канюли 25 пробы и закрепите лигатурами. Канюляцию печеночной артерии канюль с 14 французским армированием и фиксацию лигатурами.
    2. Канюлируйте подпеченочную полую вену и расположите кончик канюли на уровне, где в полой вене дренируются печеночные вены. Фиксируют лигатурами.
    3. Наденьте кошельковую завязку по краю диафрагмы, чтобы предотвратить кровотечение из любых диафрагмальных вен, и перевяжите надпеченочную полую вену.
    4. Очистите портальную канюлю от воздуха и выполните промывку воротной вены за столом 250 мл холодного плазменного экспандера. Проверьте, нет ли утечек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте достаточный отток через кавальную канюлю.
    5. После промывки портала поместите трубчатый зажим на портальную канюлю, следя за тем, чтобы воздух не попадал в канюлю и воротную вену.
    6. Обеспарните артериальную канюлю и промывайте 250 мл холодного плазменного экспандера через печеночную артерию. Проверьте наличие утечек и обрежьте все боковые ветки. Поместите трубочный зажим на артериальную и кавальную канюлю.

5. Нормотермическая аппаратная перфузия

  1. Перфузат
    1. Во время подготовки к заднему столу добавьте в контур промытые эритроциты, произведенные сберегателем клеток, чтобы получить желаемый гематокрит в 30%. Запустите насос, чтобы смешать эритроциты с плазменным экспандером. Запустите газоанализатор непрерывного действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула объема эритроцитов для получения желаемого гематокрита: (масса печени + объем грунта) x желаемый гематокрит/гематокрит после промывания. Непрерывный газоанализатор также обеспечивает обратную связь по температуре перфузии, которая обычно соответствует настройке нагревателя на уровне 38 °C.
    2. Добавьте в перфузат 10 мл 10% глюконата кальция, 2 мл гепарина (10 000 МЕ) и 750 мг цефуроксима в 10 мл 0,9% NaCl. Установите ручной газовый смеситель на 0,5 л/мин FiO2 или 21%.
  2. Инициация перфузии
    1. Включите датчики давления, датчики расхода и роликовый насос для рециркуляции утечек.
    2. Поместите печень в сосуд. Поместите зажимы трубки на портальную и артериальную входную трубку и кавальную отводящую трубку контура, а также вырежьте Y-образный разъем.
    3. Подсоедините канюли к соответствующим входным и выходным трубкам с Т-образным соединительным элементом между ними. Не допускайте попадания воздуха в контур.
    4. Установите трехходовые метчики на Т-образные соединительные элементы и подсоедините к ним напорные трубопроводы. Обнулите давление в трубопроводах и начните непрерывный контроль давления.
    5. Установите пережимные клапаны, почти полностью закрыв их, чтобы предотвратить супрафизиологические потоки и эндотелиальный стресс.
    6. Запустите перфузию, сняв зажимы трубки с входного отверстия портала. Сразу после того, как начался портальный приток, снимите хомуты с кавального отвода и запустите насос. Частота вращения насоса регулируется давлением, поэтому стремитесь к давлению в кавальном выходе от -5 мм рт.ст. до -2 мм рт.ст. Стремитесь к портальному потоку 0,75 мл/мин/г печени.
    7. Когда перфузия портала стабильна и полое давление достаточно, снимите зажимы с артериальной трубки. Стремитесь к давлению около 55-60 мм рт.ст. и расходу около 0,25 мл/мин/г печени.
  3. Поддержание стабильной перфузионной гемодинамики
    1. Накройте печень стеклянным куполом или полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить потерю тепла с поверхности.
    2. Если портальный поток слишком высок, закройте прижимной клапан на портальной впускной трубе.
    3. Если кавальное давление становится слишком отрицательным, риск создания вакуума внутри полой вены увеличивается. Чрезмерное отрицательное давление можно нейтрализовать, снизив частоту вращения насоса. В качестве альтернативы, увеличение притока через воротную вену снижает отрицательное давление оттока, обеспечивая больший объем полой вены.
    4. Если артериальное давление слишком низкое, его можно увеличить, увеличив скорость насоса или закрыв пережимный клапан в направлении портального резервуара, чтобы протолкнуть больше потока через артериальную входную трубку.
  4. Выборка
    1. Отбирайте пробы перфузата из кавального выпускного трехходового клапана или из специальной линии отбора проб между оксигенатором и портальным резервуаром.
    2. Получите биопсию иглы на протяжении всей перфузии. Отверстия от игл должны быть зашиты, так как коагуляция отсутствует из-за гепаринизации контура.
    3. Соберите желчь путем фиксации французской канюли 8 в желчном протоке. Обязательно перевязайте пузырный проток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленный протокол перфузии использует саморегуляцию кровотока печени для достижения стабильных гемодинамических условий на срок до 24 ч и моделирования физиологического распределения кровотока в воротной вене и печеночной артерии. На рисунке 1 представлен схематический обзор контура перфузии. На рисунке 2А показано последовательное распределение кровотока, при этом воротная вена и печеночная артерия составляют примерно 75% и 25% от общего печеночного крово...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы подробно описали наш опыт работы с NMP свиной печени. К преимуществам этой методики можно отнести высокую трансляционную ценность и универсальность. NMP печени свиньи может быть применена либо для исследования и углубления понимания этого усовершенствованного метода сохранения, либо для имитации трансплантации. Эта конфигурация позволяет вручную контролировать каждый аспект перфузии, позволяя регулировать как портальное, так и артериальное давление и поток различными способами.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить всех студентов-исследователей с медицинского факультета Лёвенского католического университета, участвовавших в этих экспериментах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприцевая помпа Alaris GH PlusBD Care Fusion80023 ООН 01-G
Аппарат для анестезииDrä ГерманияТит
Артериальный катетер Cavafix CertoБраун, Мельзунген, ГерманияBRAU4152557
Анализатор газов кровиРадиометрАБЛ815
Глюконат кальция 10%Браун, Мельзунген, Германия570/13596667/1214
КапнографDrä ГерманияШио
Экономия ячеекМедтроникАвтолог
Центробежный насос BiomedicusМедтроник85315 ОБ/3.0
Центрифуга Rotina 420R HettichВВР521-1156
Перфузионная схема по индивидуальному заказуМедтроникM323901C
Одноразовый набор для сохранения ячеекМедтроникАТЛС24
DLP Одноступенчатая венозная канюля, прямая 20FМедтроник66120
ЭпопростенолGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, БельгияФлолан
Фентанил-Janssen 0,05 мг/млЯнссенНК-08700
Датчик расхода BioPro TTЭм-Тек12271
Формальдегид 4%ВВРVWRK4078.9005
Морозильная камера -80° CНаучный центр Нью-БрансуикаУ570-86
ХолодильникLiebherrКУБОК 3513
ГелоплазмаFresenius-Kabi, Бад-Хомбург, ГерманияФрифлекс
Охладитель отопителяStö Керт-Шили, группа Сорина16-02-1950
Гепарин 5000 МЕ/млLeo Pharma, Ballerup, ДанияГепаринЛео
Канюля печеночной артерииМедтроникБИО-МЕДИКУС 12Ф
Решение для сохранения органов IGL-1Институт Жоржа ЛопесаIGL-1/1000/D
Встраиваемый анализатор газов кровиТЕРУМОКалибратор 3MCDI 540/CDI 500
Инсулин 200 МЕ АктрапидNovo Nordisk, Дагсвард, ДанияМЕДИ-00018
Изофлуран 1000 мг/г Пары ингаляцийШанель ФармаИзо-Вет
Внутривенный катетер BD Insyte-W 20 GБД381334
Бак для жидкого азотаKGW ИзотермаС22
Мерсилен 250CM M3 USP2/0 неигольчатый лигапакJNJ медицинскийФ4503
Мерсилен 250CM M3.5 USP0 неигольчатый лигапакJNJ медицинскийФ4504
Мерсилен 5X70CM M3.5 USP0 неигольчатыйJNJ медицинскийEH6935H
Мерсилен 6X45CM M3 USP2/0 неигольчатыйJNJ медицинскийEH6734H
Микропипетки 1000 &; LСокорекс82,51,000
КонтрольСименсSC 8000
Плазмалит ViafloБакстерПлазмалит Viaflo
Канюля с воротной венойУСПОКОЕННЫЕ ЛАБОРАТОРИИ18Ф РВ-40018
Датчик давленияStö Керт-Шили, группа Сорина22-06-2000
Серворегулятор давленияМедтроникБМ 9505-2
Пролене 4-0JNJ медицинскийEH7151H
Роликовый насосКоби Сенчури США468048-000 РЭБ С
Гидрокарбонат натрия 8,4%Браун, Мельзунген, Германия362 2339
Таурохолат натрияSigma Aldrich, Берлингтон, США86339
Хирургический скальпель No 24Суонн Мортон0211
Венозный катетер, 3-просветный; 12FRСТРЕЛААК-12123-Ф
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 неигольчатый гигапакJNJ медицинскийВ1205Г
Ксилазин 2%VMD Животноводческая фармацевтикаКСИЛ-М 2%
Цинацет Цефуроксим 750 мгGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, БельгияНДЦ 0173-0353-32
Золетил 100ВирбакЗолетил 100

Ссылки

  1. Dunson, J. R., Bakhtiyar, S. S., Joshi, M., Goss, J. A., Rana, A. Intent-to-treat survival in liver transplantation has not improved in 3 decades due to donor shortage relative to waitlist growth. Clinical Transplantation. 35 (10), e14433(2021).
  2. Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. Liver transplantation using donation after cardiac death donors. Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).
  3. Croome, K. P., Taner, C. B. The changing landscapes in DCD liver transplantation. Current Transplantation Reports. 7 (3), 194-204 (2020).
  4. Coffey, J. C., et al. The influence of functional warm ischemia time on DCD liver transplant recipients' outcomes. Clinical Transplantation. 31 (10), (2017).
  5. Meurisse, N., et al. Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience. Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).
  6. Ruck, J. M., et al. Temporal trends in utilization and outcomes of DCD livers in the United States. Transplantation. 106 (3), 543-551 (2022).
  7. Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
  8. Blondeel, J., Monbaliu, D., Gilbo, N. Dynamic liver preservation: Are we still missing pieces of the puzzle. Artificial Organs. 47 (2), 248-259 (2022).
  9. Gilbo, N., et al. Porcine liver normothermic machine perfusion: Methodological framework and potential pitfalls. Transplantation Direct. 8 (1), e1276(2021).
  10. Maione, F., et al. Porcine isolated liver perfusion for the study of ischemia reperfusion injury: A systematic review. Transplantation. 102 (7), 1039-1049 (2018).
  11. Gilbo, N., et al. Coagulation factors accumulate during normothermic liver machine perfusion regardless of donor type and severity of ischemic injury. Transplantation. 106 (3), 510-518 (2021).
  12. Butler, A. J., et al. Successful extracorporeal porcine liver perfusion for 72 hr. Transplantation. 73 (8), 1212-1218 (2002).
  13. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nature Biotechnology. 38 (2), 189-198 (2020).
  14. Xu, J., Buchwald, J. E., Martins, P. N. Review of current machine perfusion therapeutics for organ preservation. Transplantation. 104 (9), 1792-1803 (2020).
  15. Martins, P. N., Turco, S. D., Gilbo, N. Organ therapeutics during ex-situ dynamic preservation. a look into the future. European Journal of Transplantation. 1, 63-78 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ex situ
Свиная нормотермная изолированная перфузия печени
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.