Методическая статья

Генерация подоцитов, полученных от пациента, из биопсии кожи

5.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65364

⸱

26 мая 2023 г.

 , 
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается двухэтапный протокол для получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов посредством эписомального перепрограммирования в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и последующей дифференцировки в подоциты.

Аннотация

Подоциты представляют собой эпителиальные клетки, расположенные на мочевом участке клубочкового фильтрационного барьера, которые способствуют селективной фильтрующей функции клубочка. Мутации в специфических для подоцитов генах могут вызывать фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), и подоциты также поражаются при многих других первичных и вторичных нефропатиях. Из-за своей дифференцированной природы модели первичных клеточных культур ограничены для подоцитов. Поэтому обычно используются условно иммортализированные клетки. Однако эти условно иммортализированные подоциты (циподоциты) имеют ряд ограничений: клетки могут дедифференцироваться в культуре, особенно когда они достигают слияния, а некоторые подоцитарно-специфические маркеры либо незначительны, либо вообще не экспрессируются. Это ставит под сомнение использование циподоцитов и их применимость для физиологического, патофизиологического и клинического охвата. Здесь мы описываем протокол генерации подоцитов человека, в том числе специфических для пациента подоцитов, из биопсии пунша кожи путем эписомального перепрограммирования дермальных фибробластов в ИПСК и последующей дифференцировки в подоциты. Эти подоциты гораздо лучше напоминают подоциты in vivo с точки зрения морфологических характеристик, таких как развитие стопных отростков и экспрессия подоцитарного специфического маркера. Наконец, что важно, эти клетки поддерживают мутации пациентов, что приводит к улучшенной модели ex vivo для изучения заболеваний подоцитов и потенциальных терапевтических веществ в индивидуальном подходе.

Введение

Подоциты представляют собой специализированные постмитотические эпителиальные клетки почек, которые образуют клубочковый фильтрационный барьер почки вместе с клубочковой базальной мембраной (GBM), клубочковыми эндотелиальными клетками и гликокаликсом. Фенотипически подоциты состоят из клеточного тела и первичных, управляемых микротрубочками мембранных расширений, а также вторичных расширений, называемых ножными отростками 1,2. Клубочковый фильтрационный барьер, который фильтрует мочу из крови, построен из фенестрированного эндотелия, GBM и специализированного типа межклеточного соединения, которое соединяет соседние отростки стопы подоцитов, называемого щелевой диафрагмой подокта3. В здоровых условиях белки, крупнее альбумина, удерживаются от фильтрационного барьера из-за их размера и заряда4.

Известно, что мутации в генах, специфичных для цитоскелета или подоцитов, а также циркулирующие факторы, влияющие на сигнальные пути подоцитов, индуцируют стирание, отслоение или апоптоз подоцитов, что приводит к протеинурии и клубочковому склерозу. В частности, ключевыми являются перестройка цитоскелета, изменение полярности подоцитов или повреждение отростков стопы с сопутствующей потерей щелевых соединений5. Из-за их терминально дифференцированного статуса подоциты вряд ли могут быть заменены после отслоения GBM. Однако, если подоциты прикреплены к GBM, они все еще могут восстанавливаться после стирания и реформировать межпальцевые отростки стопы 6,7,8. Дальнейшее понимание событий, которые приводят к повреждению подоцитов при различных клубочковых расстройствах, может обеспечить новые терапевтические цели, которые помогут в разработке методов лечения этих заболеваний. Повреждение подоцитов является отличительной чертой различных клубочковых заболеваний, включая фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), диабетическую нефропатию, болезнь минимальных изменений и мембранозную гломерулонефропатию, что требует надежных моделей подоцитов ex vivo для изучения патологических механизмов и потенциальных подходов к лечению этих заболеваний 9,10. Подоциты могут быть изучены ex vivo с помощью классической первичной клеточной культуры, основанной на выделении клубочков методом дифференциального просеивания11. Однако из-за терминально дифференцированного состояния с ограниченной способностью к пролиферации большинство исследователей используют клеточные линии циподоцитов мыши или человека, которые экспрессируют чувствительные к температуре варианты большого Т-антигена SV40. В качестве альтернативы циподоциты выделяют от трансгенных мышей, несущих ген 1,12 SV40 Tag.

Циподоциты размножаются при 33 ° C, но вступают в остановку роста и начинают дифференцироваться при 37 ° C13,14. Следует иметь в виду, что экспериментальные данные, полученные с этими клетками, следует интерпретировать с определенной осторожностью, поскольку клетки генерируются с использованием неестественной вставки генов15. Поскольку эти клетки содержат иммортализирующий ген, клеточная физиология изменяется из-за продолжающейся пролиферации12. Клеточные линии подоцитов, полученные с помощью этого подхода, недавно были поставлены под сомнение, поскольку циподоциты мышей, человека и крыс экспрессируют менее 5% синаптоподина и нефрина на уровне белка, а также NPHS1 и NPHS2 на уровне мРНК по сравнению с клубочковой экспрессией16. Более того, большинство клеточных линий подоцитов не экспрессируют нефрин17,18. Chittiprol et al. также описали значительную разницу в подвижности клеток и ответах на пуромицин и доксорубицин в циподоцитах16. Подоциты могут быть обнаружены в моче после отделения от ГБМ при различных клубочковых заболеваниях 19,20,21,22. Жизнеспособные мочевые подоциты можно культивировать ex vivo до 2-3 недель, но большинство клеток подвергаются апоптозу23,24. Интересно, что подоциты обнаруживаются не только в моче пациентов с гломерулярной болезнью, но и в моче здоровых добровольцев, скорее всего, когда они стареют снова с ограниченным потенциалом репликации в культуре24. Кроме того, количество подоцитов, полученных из мочи, ограничено, и клетки дедифференцируются в культуре, показывают меньше отростков стопы, изменяют морфологию и, что наиболее важно, имеют ограниченную способность к пролиферации. Экспрессия генов, специфичных для подоцитов, отсутствует, исчезает в течение нескольких недель или варьируется среди этих клеточных клонов. Некоторые клетки, положительные на подоцитарно-специфический маркер, совместно экспрессировали маркер канальцевых эпителиальных клеток или миофибробластов и мезангиальных клеток, что предполагает дедифференцировку и/или трансдифференцировку культивируемых мочевых подоцитов24,25.

Недавно была описана генерация клеточных линий циподоцитов, полученных из мочи пациентов и здоровых добровольцев путем трансдукции термочувствительным большим Т-антигеном SV40 иhTERT26. Экспрессия мРНК синаптоподина, нестина и CD2-ассоциированного белка была обнаружена, но мРНК подоцина отсутствовала во всех клонах. В дополнение к проблемам с мочевыми подоцитами, эти клетки также содержат вставленный иммортализирующий ген, что приводит к недостаткам, рассмотренным выше.

Напротив, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) обладают огромной способностью к самообновлению и дифференцировке в несколько типов клеток при соответствующих условиях. Ранее было показано, что ИПСК могут служить практически неограниченным источником подоцитов27,28.

Здесь описан двухэтапный протокол генерации специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожного пунша с последующим эписомальным перепрограммированием в ИПСК и окончательной дифференцировкой в подоциты, полученные из ИПСК (рис. 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Протокол генерации специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC. Графический обзор протокола получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожи путем перепрограммирования в ИПСК и дифференцировки в подоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В качестве первого шага соматические дермальные фибробласты были выращены из биопсии кожи и перепрограммированы в ИПСК с использованием метода без интеграции путем электропорации с плазмидами, экспрессирующими факторы транскрипции OCT3/4, KLF4, SOX2 и c-MYC 29,30,31. Возникшие колонии hiPSC впоследствии были отобраны и расширены. Дифференцировка началась с индукции мезодермальной линии путем активации сигнального пути WNT с последующей генерацией клеток-предшественников нефрона, которые все еще были способны размножаться. Наконец, клетки дифференцировались в подоциты. В этой процедуре мы модифицировали и объединили ранее опубликованные протоколы эписомального перепрограммирования для генерации ИПСК Bang et al.32 и Okita et al.33, а также протокол дифференцировки hiPSC в подоциты Musah et al.28,34,35.

Действительно, подоциты, полученные по нашему протоколу, имели фенотип, более близкий к подоцитам in vivo, в отношении развития отдельной сети первичных и вторичных отростков стопы и экспрессии специфических для подоцитов маркеров, таких как синаптоподин, подоцин и нефрин. При использовании подоцитов, полученных из hiPSC, генетический фон пациента сохраняется при перепрограммировании и дифференцировке. Это позволяет моделировать специфическое для пациента заболевание подоцитов и обнаруживать потенциальные терапевтические вещества ex vivo в практически неограниченном количестве клеток. Кроме того, этот протокол является минимально инвазивным, экономически эффективным, этически приемлемым и может способствовать новым возможностям разработки лекарств.

Протокол

Протокол был одобрен комитетом по этике Университета Эрлангена-Нюрнберга им. Фридриха-Александра (251_18B), и все пациенты и пробанды дали письменное согласие. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Состав всех используемых сред и растворов см. в таблице 1.

1. Рост дермальных фибробластов в результате биопсии кожного пунша

  1. Перенесите биопсию кожного пунша в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл с 10 мл предварительно разогретой среды фибробластов.
  2. Удалите средство и промойте кожу пункционной биопсией три раза 5 мл стерильного, предварительно разогретого 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Стерильными щипцами перенесите пункционную биопсию кожи на 10-сантиметровую пластину для культивирования клеток и разрежьте ее по ширине на три-четыре части стерильным скальпелем, оставив эпидермис и дерму.
  3. Переложите каждый кусочек в стерильную пластиковую чашку для культивирования клеток диаметром 35 мм и аккуратно прижмите ее к чашке для культивирования. Удалите излишки среды вокруг кусочков биопсии. Дайте высохнуть в течение 5-10 минут, пока жидкость не испарится и биопсия не будет прикреплена к пластику клеточной культуры.
  4. Добавьте 1 мл среды фибробластов по каплям с помощью пипетки объемом 1,000 мкл вокруг биопсии и осторожно заполните до конечного объема 3 мл. Выращивают при 37 °C, 5%CO2 в течение 7 дней без подкормки и перемещения посуды. Осторожно замените среду на свежую, предварительно разогретую среду фибробластов. Через 7 дней переросшие веретенообразные фибробласты можно контролировать вокруг биопсии кожи с помощью фазово-контрастного микроскопа36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда переросшие фибробласты достигнут края чашки, повторите шаг 1.3, чтобы создать еще одну партию фибробластов.
  5. Для расширения переросших фибробластов промывают 2 мл предварительно подогретого 1x PBS, диссоциируют фибробласты 1x трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и инкубируют в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO2. Переложите отделившиеся клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и промойте чашку для культивирования клеток 2 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов.
  6. Поместите моющее средство в пробирку для нейтрализации диссоциирующего агента и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу 1 мл свежей, предварительно нагретой среды фибробластов. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра или автоматического счетчика клеток, используя трипановый синий и семена 2,5 x 10 от3 до 5 x 103 фибробластов на см2 в колбах для свежих клеточных культур.
  7. Поместите колбы обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, перемещая колбы по три раза в каждом направлении. На следующий день замените среду на свежую, предварительно подогретую среду фибробластов. Меняйте среду два раза в неделю и расщепляйте, когда фибробласты достигают слияния около 80%.

2. Замораживание дермальных фибробластов

  1. Чтобы заморозить фибробласты, промойте их 5 мл предварительно разогретого 1x PBS. Аспирируйте PBS и диссоциируйте фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА. Поместите колбу обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 5-7 минут при 37 ° C при 5% CO2. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и постукивайте по боковой стороне колбы, чтобы отделить клетки.
  2. Перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте колбу клеточной культуры 5 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов. Поместите моющую среду в коническую трубку и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C.
  3. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу с 2 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов. Подсчитайте клетки и перенесите 1 х 106 клеток в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C.
  4. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 1 мл холодной среды для замораживания фибробластов, состоящей из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Переложите в криотерапию, поместите в морозильный контейнер и заморозьте на ночь при температуре -80 °C. Для длительного хранения поместите криовиал в резервуар с жидким азотом на следующий день.

3. Эписомальное перепрограммирование фибробластов для генерации ИПСК

  1. Для эписомального перепрограммирования используют 1,5 х 106 фибробластов из прохода с 4 по 8. Чтобы достичь этого количества ячеек, используйте две-три колбы по 250 мл с контесностью около 70%.
  2. За день до перепрограммирования расщепите фибробласты в соотношении 1:2, чтобы обеспечить их пролиферативное состояние. Поэтому аспирируйте среду и промойте колбы 5 мл предварительно разогретого 1x PBS на колбу. Аспирируйте PBS и диссоциируйте фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА. Поместите колбы обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 5-7 минут при 37 ° C и 5% CO2. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и постукивайте по стенке колбы, чтобы отделить клетки от пластиковой поверхности.
  3. Перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и промойте колбы для клеточных культур 5 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов. Поместите моющую среду в коническую трубку и центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 6 мл свежей, предварительно нагретой среды фибробластов.
  4. Приготовьте шесть новых колб для клеточных культур, добавив 5 мл свежей, предварительно подогретой среды фибробластов на колбу. Добавьте 1 мл суспензии клеток фибробластов в каждую колбу. Поместите колбы обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, перемещая колбы по три раза в каждом направлении.
  5. Для эписомального перепрограммирования покройте две 10-сантиметровые пластины для культивирования клеток, подходящие для культивирования hiPSC, 4 мл раствора для холодного покрытия на пластину. Инкубировать пластины в течение 1 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования ИПСК требуются различные пластмассы для клеточных культур и дополнительное покрытие внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов).
  6. Удалите среду из фибробластов и промойте 10 мл предварительно разогретого 1x PBS на колбу. Аспирируют PBS и диссоциируют фибробласты с 4 мл 1x трипсина-ЭДТА на колбу путем инкубации в течение 5-7 мин при 37 ° C. Контролируйте отслоение с помощью фазово-контрастного микроскопа и, при необходимости, постучите по стенке колбы, чтобы отделить клетки от пластиковой поверхности.
  7. Перенесите отделившиеся клетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте пустые колбы 6 мл предварительно разогретой среды фибробластов, чтобы собрать оставшиеся клетки и собрать в коническую пробирку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл свежего, предварительно подогретого 1x PBS.
  8. Подсчитайте клетки и перенесите 1,5 х 106 фибробластов в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу клетки в 5 мл электропорационной среды и снова центрифугу. Тем временем аспирируйте раствор покрытия из покрытых 10 см планшетов для культивирования клеток и добавьте 7 мл предварительно разогретой среды фибробластов.
  9. После центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу ячейки в электропорационной среде с концентрацией 1,5 х 106 клеток в 250 мкл. Перенесите суспензию ячейки 250 мкл в кювету для электропорации с расстоянием между зазором 4 мм (см. Таблицу материалов).
  10. Готовят смесь для трансфекции плазмиды, добавляя по 4 мкг каждой плазмиды (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) к общему объему 50 мкл электропорационной среды. Переложите в кювету и аккуратно перемешайте. Электропорат одним импульсом на 280 В.
  11. Отрежьте наконечник пипетки стерильными ножницами и перенесите 125 мкл электропорированных фибробластов на каждый из подготовленных 10-сантиметровых планшетов для культивирования клеток. Распределите ячейки, трижды перемешав пластины во всех направлениях, и поместите их обратно в инкубатор. Инкубировать в течение ночи при 37 ° C с 5% CO2 без помех.
  12. Чтобы удалить мертвые клетки, замените среду на следующий день 7 мл свежей, предварительно разогретой среды фибробластов. Через 2 дня после электропорации замените среду на питательную среду hiPSC и замените ее через день в течение следующих 20 дней.

4. Отбор, расширение и контроль качества генерируемых ИПСК

  1. Ежедневно контролируйте клетки в течение не менее 20 дней с помощью фазово-контрастного микроскопа с 10-кратным или 20-кратным объективом, чтобы наблюдать за образованием колоний hiPSC после электропорации. Если колонии hiPSC имеют диаметр около 300 мкм с четкими границами, а hiPSC демонстрируют высокое отношение ядер к телу, колонии hiPSC готовы к отбору путем сбора (рис. 2B, C и рис. 3).
  2. Перед сбором покройте 96-луночную пластину, подходящую для культуры hiPSC, 100 мкл раствора покрытия на лунку и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C. Во время инкубации отметьте интересующие колонии на дне чашки для культивирования клеток ручкой. Для окончательного приготовления 96-луночной пластины удалите раствор покрытия и добавьте в каждую лунку по 100 мкл предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Промойте клетки предварительно подогретым 1x PBS и добавьте свежую, предварительно подогретую питательную среду hiPSC, содержащую 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, перед сбором для удаления мертвых клеток. Чтобы собрать колонии hiPSC, используйте калибровочную иглу и разделите колонии hiPSC на мелкие кусочки, нарисовав сетку в каждой колонии.
  4. С помощью фазово-контрастного микроскопа проверьте, чтобы колонии успешно разделились на кусочки. Перенесите их пипеткой объемом 100 мкл на подготовленную 96-луночную пластину. Держите пипетку вертикально над колонией, не касаясь клеток, чтобы избежать царапин и потери колонии.
  5. Поместите 96-луночную пластину в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 и дайте клеткам прикрепиться в течение ночи без помех. Храните посуду со смесью фибробластов и ИПСК на случай, если сбор не увенчается успехом. Поэтому удалите ингибитор ROCK Y27632, изменив среду на питательную среду hiPSC, и поместите планшеты обратно в инкубатор.
  6. На следующий день смените среду 96-луночного планшета на 200 мкл свежей питательной среды hiPSC и меняйте ее через день. На следующий день проконтролируйте 96-луночную пластину и отметьте скважины успешно отобранными клонами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если отобранные клоны hiPSC не полностью отобраны после первой попытки, и фибробласты могут быть обнаружены в лунке, повторите отбор из 96-лунки или соскребите фибробласты с пластины.

5. Расширение выбранных клонов hiPSC

  1. Контролируйте клоны hiPSC с помощью фазово-контрастного микроскопа. Если выбранные ИПСК достигают слияния около 70%, клоны ИПСК готовы к расширению.
  2. Покройте 48-луночную пластину, пригодную для культивирования hiPSC, 250 мкл раствора покрытия на лунку в течение 1 часа при 37 °C. Замените раствор покрытия 200 мкл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Чтобы отсоединить ИПСК от 96-луночной пластины, соскребите пластиковую поверхность наконечником пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите отсоединившиеся ИПСК с 96-луночного планшета на 48-луночный планшет. На следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую питательную среду hiPSC для удаления мертвых клеток и ингибитора ROCK Y27632.
  4. Если клоны hiPSC достигают слияния около 70%, перенесите hiPSC в 24-луночную пластину. Поэтому покройте 24-луночную пластину, подходящую для культивирования hiPSC, 400 мкл раствора покрытия на лунку в течение 1 часа при 37 ° C. Замените раствор покрытия 400 мкл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Аспирируйте среду из 48 лунок и промойте 500 мкл предварительно подогретого 1x PBS.
  5. Замените PBS 100 мкл ферментативного раствора для отслоения клеток, содержащего 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 мин. Смойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте пустую 48-луночную пластину питательной средой hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и погрузите в коническую пробирку.
  6. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют ИПСК в 1 мл питательной среды ИПСК, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632, и переносят на 24-луночную пластину. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C при 5%CO2 и распределите ячейки, трижды перемешивая пластину во всех направлениях. Дайте клеткам прикрепиться в течение ночи без помех.
  7. На следующий день смените среду на питательную среду hiPSC без ингибитора ROCK Y27632.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клоны hiPSC достигают слияния около 70%, перенесите hiPSC на 12-луночную пластину, повторив шаги с 5.4 по 5.7 с увеличенными объемами, подходящими для 12-луночного формата. Если hiPSC с 12-луночной пластины достигают слияния около 70%, перенесите клоны hiPSC на 6-луночную пластину с увеличенными объемами для 6-луночного формата.

6. Замораживание выбранных клонов hiPSC

  1. Чтобы заморозить выбранные клоны hiPSC, аспирируйте среду из 6-луночной пластины. Промойте лунки 2 мл 1x PBS. Аспирируют и диссоциируют ИПСК 1 мл ферментативного раствора для отсоединения клеток, содержащего 10 мкМ Y27632. Поместите пластину обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 4 минут при 37 ° C и 5% CO2.
  2. Промойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Вымойте тарелку 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Бассейн в конической трубке и центрифуге при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Подсчитайте клетки и перенесите 1 х 106 клеток в новую коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл холодной морозильной среды hiPSC без сыворотки и заморозьте в криовиале с использованием морозильного контейнера на ночь при -80 ° C. Для длительного хранения поместите криовиал в резервуар с жидким азотом на следующий день.

7. Контроль качества HiPSC

  1. Характеристика морфологии hiPSC
    1. Проверьте характерную морфологию hiPSC с помощью фазово-контрастного микроскопа с 20-кратным объективом. После перепрограммирования морфология клеток меняется от длинных веретенообразных фибробластов до небольших круглых ИПСК, представляющих высокое отношение ядер к телу, растущих в колониях с четкими границами (рис. 2C).
    2. Если колонии hiPSC становятся слишком плотными и происходит спонтанная дифференцировка, соскребите дифференцированные части с пластины с помощью наконечника пипетки (рис. 3). Поскольку ИПСК имеют высокую скорость пролиферации, ежедневно подкармливайте культуры ИПСК свежей, предварительно подогретой питательной средой ИПСК.
  2. Характеристика маркеров плюрипотентности методом иммунофлюоресцентного окрашивания
    1. Чтобы проверить сгенерированные ИПСК на маркер плюрипотентности с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите пластиковые покровные стекла в 24-луночную пластину и покройте 250 мкл раствора покрытия в течение 1 ч при 37 ° C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 1 мл предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
    2. Затравка 1,9 x 104 диссоциированных ИПСК на 24 лунки. Дайте ИПСК прикрепиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2 без помех. См. шаги с 5.4 по 5.6 для диссоциации ИПСК. Замените среду на следующий день питательной средой hiPSC без ингибитора ROCK Y27632.
    3. Для окрашивания промойте клетки 1 мл предварительно подогретого 1x PBS, а затем зафиксируйте ИПСК 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Неподвижные ИПСК промывают 1x PBS и блокируют неспецифические места связывания 200 мкл прединкубационного раствора на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. Разбавляют первичные антитела Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) в разбавителе антител.
    4. Очистите пластиковую фольгу 70% этанолом и поместите ее в камеру окрашивания, заполненную резервуаром для воды. Поместите капли 30 мкл первичных разведений антител на фольгу. Поместите фиксированные образцы вверх дном в разбавление и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C.
    5. На следующий день трижды промойте образцы 1x PBS в течение 5 минут и поместите 30 мкл капель вторичных разведения антител (1:1,000) на чистые места на фольге. Поместите крышку вверх дном в разбавление. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    6. После инкубации промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин. Установите образцы на предметные стекла в монтажной среде, содержащей DAPI. Дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре и в темноте и визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа (рис. 4).
  3. Исключение бактерии и микоплазменного загрязнения
    1. Чтобы исключить заражение бактериями, перенесите 500 мкл диссоциированных ИПСК на 5 мл предварительно подогретой среды Лурия-Бертани (LB). См. шаги с 5.4 по 5.6 для диссоциации ИПСК. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C. Если среда LB кажется мутной, вероятно, произошло заражение бактериями. Выбросьте ячейки.
    2. Чтобы исключить заражение микоплазмой, соберите среду, которая не заменялась в течение 2 дней, из 6 скважин с примерно 90% сливающимися ИПСК. Используйте количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) для обнаружения загрязнения микоплазмами. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов для обнаружения микоплазмы.

8. Дифференциация ИПСК в подоциты

  1. Подготовка и хранение факторов роста
    1. Чтобы получить исходную концентрацию 10 мМ Y27632, восстановите 10 мг Y27632 (молекулярная масса 320,26 г/моль) в 3,12 мл стерильной воды. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:1000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 10 мкМ.
    2. Чтобы получить исходную концентрацию 30 мМ CHIR99021, восстановите 5 мг CHIR99021 (молекулярная масса 465,34 г/моль) в 358,2 мкл стерильного ДМСО. Храните 50 мкл аликвот при -20 °C и разбавляйте 1:10 000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 3 мкМ.
    3. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл активина А, восстановите 100 мкг активина А в 1 мл 1x PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:2000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 50 нг / мл.
    4. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл костного морфогенного белка 7 (BMP7), восстановите 100 мкг BMP7 в 1 мл стерильной воды, содержащей 0,1% BSA. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:2000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 50 нг / мл.
    5. Чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг/мл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), восстановите 100 мкг VEGF в 1 мл стерильной воды. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:4000 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 25 нг / мл.
    6. Чтобы получить исходную концентрацию 10 мМ полностью транс-ретиноевой кислоты, восстановите 10 мг полностью транс-ретиноевой кислоты в 3,33 мл стерильного ДМСО. Храните 100 мкл аликвот при -20 ° C и разбавляйте 1:100 в среде для культивирования клеток до достижения конечной концентрации 0,5 мкМ.
  2. Активация сигнального пути WNT для индуцирования линии мезодермы
    1. Для дифференцировки ИПСК в подоциты, полученные из ИПСК, оболочку для культивирования клеток или колбы, подходящие для культивирования ИПСК, с раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °С и 5%СО2. Общий объем раствора покрытия составляет 1 мл на 6-луночную культуральную пластину или 4 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину.
    2. Аспирируйте среду и промойте ИПСК предварительно разогретым 1x PBS. Аспирируют PBS и добавляют ферментативный раствор для отсоединения клеток, содержащий 10 мкМ Y27632, общим объемом 1 мл на 6-луночную культуральную пластину или 4 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину.
    3. Поместите пластину обратно в инкубатор и выдерживайте в течение 4 минут при 37 ° C и 5% CO2. Смойте ИПСК с пластины с помощью пипетки объемом 1,000 мкл. Перенесите отделившиеся клетки в коническую трубку.
    4. Вымойте тарелку свежей, предварительно подогретой питательной средой hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632. Поместите моющую среду в коническую трубку, чтобы нейтрализовать диссоциативный реагент. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
    5. Подсчитайте клетки и семена 1 х 104 ИПСК/см2. Распределите ячейки, трижды взбалтывая во все стороны. Дайте ИПСК прикрепиться на ночь при 37 °C с 5% CO2 без помех.
    6. На следующий день замените среду 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки мезодермы, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина А и 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
  3. Дифференцировка в клетки-предшественники нефрона
    1. Через 2 дня замените среду мезодермы на 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки предшественника нефрона, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина A и 50 нг/мл BMP7 на 6-луночную культуральную пластину или 6 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину. Меняйте носитель через день в течение следующих 14 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки-предшественники нефрона размножаются и могут быть пройдены и заморожены после 7 дней дифференцировки в среде расширения предшественника нефрона.
    2. Чтобы расщепить клетки-предшественники нефронов, покройте пластик клеточной культуры, подходящий для культивирования hiPSC, раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °C. Замените раствор покрытия расширительной средой-предшественником нефрона. Аспирируйте носитель и промойте клетки предварительно разогретым 1x PBS. Удалите PBS и диссоциируйте клетки с помощью 1x трипсина-ЭДТА.
    3. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C и 5% CO2. Контролируют отрыв клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. При необходимости постучите по боковой стороне пластика, чтобы отделить ячейки от поверхности. Промойте клетки с пластины и переложите в коническую трубку. Промойте пустую колбу или тарелку тем же объемом предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона, что и диссоциирующий реагент.
    4. Слейте моющее средство в коническую трубку. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу 2 мл свежей, предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона. Подсчитайте клетки и семена 1,5 х 104 клеток-предшественников нефрона насм2 для дальнейшей дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы заморозить клетки-предшественники нефрона, ресуспендируйте 1 x 106 клеток в 1 мл холодной среды для криоконсервации без сыворотки и перенесите в криотерапию. Заморозьте в морозильной емкости при температуре -80 °C на ночь и переложите в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.
    5. Поместите пластины обратно в инкубатор и равномерно распределите ячейки, трижды перемешивая во все стороны. На следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую среду для дифференцировки предшественников нефронов. Замените среду через день до тех пор, пока клетки не будут дифференцированы в течение 14 дней в среде для дифференцировки предшественников нефрона.
  4. Терминальная дифференцировка в подоциты, полученные из hiPSC
    1. Аспирируйте среду и добавьте 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки подоцитов, содержащей 1x добавку B27, 1% пенициллин-стрептомицин, 3 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл активина A, 50 нг/мл BMP7, 25 нг/мкл VEGF и 0,5 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты на 6-луночную культуральную пластину или 6 мл на 10-сантиметровую клеточную культуральную пластину. Поместите планшеты обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. Меняйте среду через день в течение 4 дней свежей, предварительно подогретой средой для дифференцировки подоцитов.
    2. Чтобы сохранить hiPSC-подоциты в культуре после дифференцировки, два раза в неделю кормите клетки поддерживающей средой подоцитов, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,1% инсулин-трансферрин-селена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Терминальные дифференцированные hiPSC-подоциты больше не размножаются. Однако можно держать их в клеточной культуре до 4 недель.
  5. Размораживание и расширение замороженных клеток-предшественников нефрона
    1. Покройте новую пластиковую колбу для клеточной культуры, подходящую для культивирования hiPSC, раствором покрытия в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 5 мл среды для расширения предшественника нефрона.
    2. Подготовьте коническую пробирку объемом 15 мл с 7 мл предварительно разогретой среды для расширения предшественника нефрона. Разморозьте замороженные клетки при температуре 37 °C на водяной бане без движения в течение примерно 20 с. Выньте криовиал из водяной бани, когда половина клеток оттает, и останется немного льда.
    3. Опрыскайте криовиал 70% этанолом и поместите в шкаф биобезопасности. Переносят размороженные клетки в коническую трубку с предварительно подогретой средой для расширения предшественника нефрона. Используйте пипетку объемом 1000 мкл и дайте клеткам очень медленно стекать по стенке трубки.
    4. Промойте пустой криовиал 1 мл среды-предшественника нефрона, чтобы собрать оставшиеся клетки и собрать в коническую пробирку. Центрифугу при 200 x g в течение 5 мин при 20 °C и ресуспендировать гранулу клетки в свежей, предварительно разогретой среде для расширения предшественника нефрона.
    5. Перенесите размороженные клетки в колбу с покрытием и на следующий день смените среду на свежую, предварительно подогретую среду для расширения предшественника нефрона. Перед дальнейшей дифференцировкой дайте клеткам размножиться в среде расширения предшественника нефрона, меняя среду через день, и приступайте к шагу 8.3.5.

9. Характеристика подоцитов, полученных из hiPSC, методом иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Чтобы проверить дифференцированные подоциты на подоцит-специфический маркер с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите пластиковые покровные стекла в 24-луночную пластину и покройте 250 мкл раствора покрытия в течение 1 часа при 37 ° C и 5% CO2. Замените раствор покрытия 1 мл предварительно подогретой среды для расширения предшественника нефрона. Семя: 2,5 x 104 диссоциированных клеток-предшественников нефрона на 24-луночную пластину. См. шаги 8.3.2 - 8.3.4 для диссоциации клеток-предшественников нефрона.
  2. Дайте клеткам прикрепиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2 без помех. Замените среду на следующий день предварительно подогретой средой для дифференцировки предшественников нефронов.
  3. Завершите дифференцировку, меняя среду через день, пока клетки не будут дифференцированы в общей сложности 14 дней в среде для дифференцировки предшественников нефрона и еще 5 дней в среде для дифференцировки подоцитов.
  4. После окончательной дифференцировки промойте клетки 1 мл предварительно разогретого 1x PBS. Зафиксируйте hiPSC-подоциты 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Неподвижные клетки промывают 1x PBS и блокируют неспецифические места связывания 200 мкл прединкубационного раствора на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Разбавьте первичные антитела синаптоподин (1:200), подоцин (1:100) и нефрин (1:25) в разбавителе антител и поместите капли разведения первичных антител 30 мкл на чистую пластиковую фольгу в камеру окрашивания, содержащую резервуар для воды.
  6. Поместите предметные стекла с фиксированными hiPSC-подоцитами вверх дном в разбавление. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день трижды смойте 1x PBS в течение 5 минут. Разбавьте вторичные антитела (1:1,000) в 1x PBS и поместите капли разведения вторичных антител 30 мкл на чистые места на фольге. Поместите крышку вверх дном в разбавление.
  7. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин. Установите образцы на предметные стекла в монтажной среде, содержащей DAPI. Дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре и в темноте. Визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.

Результаты

С помощью этого пошагового протокола, сочетающего эписомальное перепрограммирование и дифференцировку, можно генерировать подоциты, несущие мутацию пациента в гене, соответствующем подоцитам. Это позволяет анализировать специфические для заболевания изменения подоцитов ex vivo. Генетический фон пациента сохраняется во время протокола на всех различных клеточных стадиях. Кроме того, ограничение недостаточного количества клеток терминально дифференцированных непролиферирующих подоцитов может быть преодолено с помощью подоцитов, полученных из hiPSC. Несмотря на то, что требуется несколько месяцев, прежде чем hiPSC-подоциты будут сгенерированы из переросших дермальных фибробластов путем перепрограммирования в ИПСК и последующей дифференцировки в подоциты, можно заморозить клетки на трех разных этапах протокола (рис. 2). Замораживание фибробластов, ИПСК и клеток-предшественников нефронов возможно после дифференцировки в среде для дифференцировки предшественников нефронов в течение 7 дней. Поэтому возможна генерация рабочих банков клеток и масштабные эксперименты.

figure-results-1
Рисунок 2: Отдельные этапы протокола через фазово-контрастный микроскоп. (А) Переросшие дермальные фибробласты. (B) образование колоний hiPSC после перепрограммирования. (C) Выбранная культура hiPSC. (D) Клетки мезодермы после 2 дней дифференцировки. (E) Клетки-предшественники нефрона после 14 дней дифференцировки в среде дифференцировки предшественников нефронов. (F) Терминальные дифференцированные подоциты, полученные из hiPSC. Масштабные линейки представляют 300 мкм (A, B, D-F) и 150 мкм (C). Снежинка подчеркивает возможные этапы замораживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Поскольку сгенерированные подоциты, полученные из hiPSC, проходят длинный протокол с радикальными изменениями в отношении типа и морфологии клеток, характеристика клеток является обязательной. Морфологию клеток, такую как размер и форма клеток, а также поведение роста, можно контролировать с помощью фазово-контрастного микроскопа. Фибробласты представляют собой длинный веретенообразный фенотип размером от 150 мкм до 300 мкм (рис. 2А). После перепрограммирования возникают колонии с небольшими ИПСК размером 50 мкм. Эти колонии имеют четкие границы, а ИПСК отличаются высоким отношением ядер к телу и повышенной скоростью пролиферации (рис. 2C). Поскольку подоциты являются терминально дифференцированными клетками, скорость пролиферации уменьшается с прогрессирующей дифференцировкой, и морфология клеток изменяется на 300 мкм крупных звездчатых подоцитов с выступающими отростками стопы (рис. 2F).

Слияние является критической точкой культуры hiPSC, и спонтанная дифференциация может появиться, когда колонии становятся слишком плотными (рис. 3). Эти колонии необходимо удалить перед прохождением, соскоблив пораженные части посуды с культурой.

figure-results-2
Рисунок 3: Примеры ИПСК разного качества. Фазово-контрастные изображения успешно (A) перепрограммированных колоний hiPSC и (B) отдельных hiPSCs, а также (C) спонтанной дифференцировки, (D, E) колоний, не относящихся к hiPSC, и (F) слишком плотной культуры hiPSC. Масштабные линейки представляют 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Различные типы клеток этого протокола должны быть проверены на экспрессию определенного маркера. После перепрограммирования ИПСК восстанавливают плюрипотентную способность и экспрессируют маркеры пролиферации и плюрипотентности, такие как SSEA4, OCT3/4 и Ki67 (рис. 4)38,39,40. Известно, что перепрограммирование, а также длительная культура ИПСК и дифференцировка могут приводить к аномальному кариотипу, а точнее индуцировать мутации41. Следовательно, генетический фон культивируемых клеток следует контролировать с течением времени и в разных местах с помощью g-полос и секвенирования всего экзома.

figure-results-3
Рисунок 4: Характеристика генерируемых ИПСК методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Характеристика генерируемых ИПСК путем окрашивания на (A) пролиферативный маркер Ki67, а также маркеры плюрипотентности (B) OCT3/4 и (C) SSEA4. Масштабные линейки представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Морфологически подоциты, полученные из hiPSC, имеют звездообразную форму и экспрессируют отчетливую сеть длинных первичных и вторичных отростков стопы по сравнению с циподоцитами (рис. 5). Подоциты, полученные из HiPSC, экспрессируют специфические для подоцитов маркерные белки, такие как синаптоподин, нефрин и подоцин (рис. 6A-C)42.

figure-results-4
Рисунок 5: Морфология подоцитов, полученных из hiPSC, в сравнении с циподоцитами. Сравнение (A,B) подоцитов, полученных из hiPSC, от здорового донора с (C,D) циподоцитами в отношении морфологии клеток и филоподий с использованием фазово-контрастного микроскопа (A,C) и сканирующего электронного микроскопа (B,D). Масштабные линейки представляют 150 мкм (A, C) и 20 мкм (B, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таким образом, сравнение подоцитов, полученных из hiPSC, не только от здоровых доноров, но и от пациентов с мутациями в генах, специфичных для подоцитов, позволяет индивидуализировать характеристику мутации пациента ex vivo.

figure-results-5
Рисунок 6: Характеристика подоцитарно-специфического маркера в подоцитах и циподоцитах, полученных из hiPSC. Сравнение (A-C) hiPSC-полученных подоцитов от здорового донора с (D-F) циподоцитами в отношении подоцитарно-специфических маркерных белков синаптоподина (A, D), нефрина (B, E) и подокина (C, F). Масштабные линейки представляют 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Состав всех сред для культивирования клеток и растворов, использованных в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Этот протокол, основанный на клеточных культурах, сочетает в себе эписомальное перепрограммирование дермальных фибробластов человека в специфические для пациента ИПСК и последующую дифференцировку в подоциты, полученные из ИПСК. Это позволяет изучать мутационные изменения подоцитов у пациентов с генетическим гломерулярным заболеванием в отношении повреждения подоцитов. Протокол перепрограммирования дермальных фибробластов методом без интеграции путем электропорации адаптирован из опубликованных работ Bang et al.32 и Okita et al.33. Протокол дифференциации подоцитов от ИПСК адаптирован из опубликованного протокола Musah et al.28,34,35. Уже имеются публикации, описывающие генерацию подоцитов из ИПСК 27,34,35. Тем не менее, представленный здесь протокол оптимизирован и менее дорог в отношении дифференцировки ИПСК в подоциты. По сравнению с опубликованным протоколом Musah et al., мы протестировали этот протокол на различных реагентах покрытия, таких как витронектин, ламининовый шелк-511 и солюбилизированная матрица базальной мембраны. Концентрации витронектина и ламинина шелк-511 могут быть снижены до 2,5 мкг/мл вместо 5 мкг/мл 28,34,35. Кроме того, удалось снизить концентрацию BMP7 и активина А - двух очень дорогих факторов роста - на 50%, со 100 нг/мл до 50 нг/мл.

Это позволяет снизить затраты на дифференциацию. Клетки-предшественники нефрона с 7-го дня все еще размножались, и ранее была показана возможность замораживания. Мы расширили эти клетки после оттаивания и перед окончательной дифференцировкой в основной среде, содержащей модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM) и B27, в течение нескольких дней, что еще больше снизило затраты. В дополнение к этапам дифференцировки, этот протокол описывает рост фибробластов из биопсии кожи с последующей генерацией специфических для пациента ИПСК посредством эписомального перепрограммирования. Комбинация этих двух методов позволяет генерировать специфические для пациента подоциты. Таким образом, здесь представлен полный пошаговый протокол для создания специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC, который ранее не был описан так подробно.

Поскольку общий протокол включает в себя несколько различных типов клеток, крайне важно охарактеризовать генерируемые типы клеток на разных этапах. Клетки находятся в культуре в течение длительного периода времени, поэтому контроль качества должен проводиться на разных проходах. При работе с ИПСК необходимо ежедневное кормление, а также мониторинг поведения и морфологии клеток. Стерильность дифференциационных сред должна быть обеспечена стерилизацией фильтра через фильтр 0,2 мкм. Весь протокол, от биопсии кожи до подоцитов, полученных из hiPSC, занимает несколько месяцев, но можно заморозить клетки на разных этапах процесса. Фибробласты, отобранные клоны hiPSC и пролиферативные клетки-предшественники нефрона через 7 дней в среде дифференцировки предшественников нефронов могут быть заморожены, и может быть создан рабочий банк клеток.

Несмотря на то, что здоровые подоциты, полученные из hiPSC, развивают четкую сеть первичных и вторичных отростков стопы (рис. 5A, B) и экспрессируют типичный маркер, специфичный для подоцитов (рис. 6A-C), характерные щелевые диафрагмы, как видно in vivo, трудно имитировать в классических двумерных моделях клеточных культур. Более того, межклеточная связь с другими типами клубочковых клеток невозможна в условиях монокультуры.

Из-за их терминального дифференцированного состояния и недостаточной способности к пролиферации трудно изучать подоциты ex vivo. С помощью условно иммортализации первичных подоцитов можно преодолеть это ограничение путем введения термочувствительного переключателя, в результате чего получается модель клеточной культуры, в которой клетки размножаются при 33 °C и дифференцируются при 37 °C13,14. Хотя эти циподоциты обладают высоким потенциалом для исследования подоцитов, существуют ограничения, такие как отсутствие экспрессии маркеров, дедифференцированная морфология и неспособность формировать отростки стопы15,16.

Дифференцировка подоцитов от соматических клеток, полученных от пациента, позволяет генерировать и сравнивать больные подоциты со здоровыми контрольными клетками ex vivo. Это позволяет изучать повреждение подоцитов из-за мутаций в специфических для подоцитов генах. Кроме того, работа с ИПСК имеет потенциал для создания трехмерных моделей заболеваний клеточных культур, или, скорее, органоидов43,44. Совместное культивирование подоцитов, полученных из hiPSC, с другими клубочковыми клетками, такими как клубочковые эндотелиальные клетки или мезангиальные клетки, может привести к новому пониманию межклеточной коммуникации в здоровье и клубочковых заболеваниях.

Кроме того, характеристика и лечение специфических для пациента подоцитов могут быть выполнены ex vivo в высокопроизводительном анализе. Индивидуальный подход открывает возможность исследовать новые терапевтические мишени для конкретных мутаций и выполнять индивидуализированную медицину в будущем.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF) Университета Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге с номером гранта M4-IZKF-F009, предоставленным Янине Мюллер-Дейле, и Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) под названием проекта STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treatment FSGS, грант No 01GM2202D, предоставленный Янине Мюллер-Дейле. Мы благодарим Анналену Краус за поддержку в создании снимков SEM.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m стерильный фильтрRotilabP668.1для стерилизации дифференцировочной среды
полностью транс-ретиноевой кислотыStem Cell Technologies72262добавка для дифференцировки
B27 добавка (50 х), бессывороточная добавкаGibco17504044добавка для бессывороточной дифференцировочной среды
BG iMatrix-511 SilkbiogemsRL511Sдополнительная опция реагента внеклеточного матрикса, используемого в растворе для покрытия клеточных культур пластиками, подходящими для культуры hiPSC
Бычий сывороточный альбумин (БСА) Roth8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 млGreiner bio-one82050-856пластик для клеточных культур, подходящий для культивирования фибробластов
CHIR99021 (5 мг)Sigma-Aldrich252917-06-9 Добавка для дифференциации
Сертифицированная матрица Corning Matrigel hESC Corning354277дополнительная опция реагента внеклеточного матрикса, используемого в покрытии раствора для покрытия клеточных культур пластиками, подходящими для культуры hiPSC (солюбилизированный матрикс базальной мембраны)
countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10283для подсчета клеток
countess II FL  Автоматический счетчик клетокInvitrogenдля подсчета клеток
пробирки cryoPure, 2 мл, завинчивающаяся крышка QuickSeal, белыйSarstedt72380криомер для заморозки клеток
диметилсульфоксидом (ДМСО) RothA994.1для замораживающей среды фибробластов
DMEM/F12 (1:1) (1 x)Gibco11320074основная среда для дифференцировки
DMEM/F12 + GlutamaxGibco10565018основная среда для фибробластов
EVOS M5000 Imaging System ThermoFisher ScientificAMF5000фазово-контрастный микроскоп
фетальная бычья сыворотка премиум, инактивированная (FCS)PAN BiotechP301902сыворотка для среды фибробластов, замораживающая среда фибробластов и среда для поддержания подоцитов
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, зазор 4 мм, 800 &; Емкость L, стерильнаяFisherbrandFB104используемая для электропорации/эписомального перепрограммирования фибробластов (зазор 4 мм)
Монтажная среда для флюорограммы-G, с DAPIInvitrogen00-4959-52монтажной средой, содержащей
измерительную иглу dapi (0,6 x 30 мм)BD Microlance3300700для разделения колоний иПСК на мелкие кусочки
человеческого рекомбинантного белкаактивина А78001.1Биологическиактивная добавка для дифференцировки
человеческого рекомбинантного костного морфогенетического белка 7 (BMP7)Peprotech120-03Pдобавка для дифференцировки
человеческого VEGF-165 Рекомбинантный белокThermo ScientificPHC9394добавка для дифференцировки
инсулин-трансферрин-селен (ИТС-G) (100 x)Gibco41400045добавка для среда для поддержания подоцитов
LB средаRothX964.1для теста на стерильность культуры hiPSC
lookOut Mycoplasma PCR Detection KitSigma AldrichMP0035-1KTкоммерческий набор для обнаружения микоплазмы
предметные стекламикроскопа Diagonal GmbH & Co.KG21,102
микропробирки 1,5 мл Sarstedt72706400
mTeSR1 Complete KitStem Cell Technologies85850основная среда для бессывороточной культуральной среды hiPSC
nalgene freezing container Mr.FrostyRothAC96.1 для обеспечения оптимальных условий заморозки
нормальная козья сывороткаABCAMAB 7481для прединкубационного раствора и разбавителя антител
Nunc 24 лункиThermo Scientific142485клеточных культур пластики подходят для hiPSC
культура nunc 48 лунок планшеты Пластики для152640подходят для культур hiPSC
nunc 6-луночные планшеты Пластмассы для140685подходящие для культур hiPSC
nunc EasYDish Тарелки 100 ммThermo Scientific150466пластики для клеточных культур, подходящие для культур hiPSC
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, плоскодонный микропланшетThermo Scientific167008пластиков для клеточных культур, подходящих для культуры hiPSC
nutriFreez D10 Среда для криоконсервацииСарториус05-713-1E Бессывороточная криоконсервирующая среда для криоконсервации клеток-предшественников hiPSC и нефронов
Opti-MEMGibco11058021среда для электропорации 
pCXLE-hMLNAddgene#27079плазмида для эписомального перепрограммирования
pCXLE-hOCT3/4 плазмидаAddgene#27077плазмида для эписомального перепрограммирования
pCXLE-hSK плазмидаAddgene#27078плазмида для эписомального перепрограммирования
пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP4333-100MLдля предотвращения бактериального загрязнения
пластика покровные листыSarstedt  83.1840.002для иммунофлуоресцентного окрашивания гипск и подоцитов, полученных из гиПСК
ROTI HistofixRothP087.3коммерческий параформальдегид (4 %) для фиксации клеток
RPMI 1640 + L-глутаминGibco21875034основная среда для поддержания подоцитов средняя
окрашивающая камера StainTray Black lidRothHA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501раствор для отсоединения ферментативных клеток, используемый для диссоциации гиПСК
стерильный фосфатный буферный раствор (PBS) (1 x)Gibco14190094используется для промывки и покрытия
стерильной водыRothT1432
шприц без иглы 20 млBD Plastipak300629для фильтрации стерилизации дифференцировочная среда
чашка TC 100 ммSarstedt8,33,902стерильная клеточная культура пластик для разреза биопсии кожи и культуры фибробластов
TC чашка 35 ммSarstedt8,33,900стерильная клеточная культура пластика для выращивания фибробластов из биопсии кожи
triton X 100Roth3051.3для преинкубационного раствора 
трипан синий краситель (0,4 %) для использования с автоматизированным счетчиком клеток CountessInvitrogenT10282для подсчета клеток
трипсин-ЭДТА (10 x) BiowestX0930-100диссоциационный реагент для фибробластов и клеток-предшественников нефрона
пробирка 15 млGreiner bio-one188271-N
пробирка 50 млGreiner bio-one227261
витронектин ACFSartorius05-754-0002реагент для покрытия клеточных культур реагент используется в покрытии раствора для покрытия клеточных культур пластики, пригодные для культивирования
hiPSCY-27632 дигидрохлорид (10 мг)Tocris1254для предотвращения апоптоза иПСК при расщеплении
Primary Антитела
OCT4 Stem Cell Technologies60093.1маркер плюрипотентности, разведение 1:200
SSEA-4Stem Cell Technologies60062FI.1маркер плюрипотентности, разведение 1:100
Ki67 Abcamab15580маркер пролиферации, разведение 1:300
синаптоподинProteintech21064-1-APподоцит-специфический маркер, разведение 1:200
нефринпрогенGP-N2подоцит-специфичный маркер, разведение 1:25
подоциновыйпротеинтек20384-1-APподоцит-специфичный маркер, разведение 1:100
Secondary Антитела
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции вторичное антитело, Alexa Fluor 555InvitrogenA21435вторичное антитело, разведение 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, высокоадсорбированныйInvitrogenA31634вторичный, разведение 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206вторичное и тело, разведение 1:1000
козье анти-мышиное IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422вторичное идител, разведение 1:1000
козий анти-мышиный IgG (H+L) перекрестно-адсорбированный вторичный антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001вторичное и дитбоди, разведение 1:1000
кювета , клеточных культур Thermo Scientific клеточных культур Thermo Scientific , , вторичный

Ссылки

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114(2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

Биопсия кожиэписомальное репрограммированиедермальные фибробластыиндуцированные плюрипотентные стволовые клеткидифференцировка подоцитовмодель заболевания подоцитовотростки подоцитовэкспрессия маркеров подоцитовмодель подоцитов ex vivo
Генерация подоцитов, полученных от пациента, из биопсии кожи
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.