Методическая статья

Создание и подтверждение постнатальной модели мышиной перегрузки объема правого желудочка

DOI:

10.3791/65372

⸱

9 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлено создание и подтверждение модели постнатальной объемной перегрузки (ВО) правого желудочка у мышей с брюшной артериовенозной фистулой (АВФ), которая может быть применена для изучения того, как ВО способствует постнатальному развитию сердца.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Объемная перегрузка правого желудочка (ПЖ) часто встречается у детей с врожденными пороками сердца. В связи с различными стадиями развития миокард ПЖ может по-разному реагировать на ВО у детей по сравнению со взрослыми. Целью настоящего исследования является создание постнатальной модели ПЖ ВО у мышей, использующих модифицированную брюшную артериовенозную фистулу. Для подтверждения создания ВО и последующих морфологических и гемодинамических изменений ПЖ в течение 3 мес выполняли УЗИ брюшной полости, эхокардиографию, гистохимическое окрашивание. В результате процедура на постнатальных мышах показала приемлемую выживаемость и успешность лечения фистулы. У мышей VO полость ПЖ была увеличена с утолщенной свободной стенкой, а ударный объем увеличился примерно на 30%-40% в течение 2 месяцев после операции. После этого систолическое давление ПЖ повышалось, наблюдалась соответствующая регургитация легочного клапана, возникало ремоделирование малой легочной артерии. В заключение, модифицированная операция артериовенозной фистулы (АВФ) осуществима для создания модели RV VO у постнатальных мышей. Учитывая вероятность закрытия свища и повышенного сопротивления легочной артерии, перед применением необходимо выполнить УЗИ брюшной полости и эхокардиографию для подтверждения статуса модели.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Объемная перегрузка правого желудочка (ПЖ) часто встречается у детей с врожденными пороками сердца (ВПС), что приводит к патологическому ремоделированию миокарда и неблагоприятному долгосрочному прогнозу 1,2,3. Глубокое понимание ремоделирования ПЖ и связанных с этим ранних целенаправленных вмешательств имеет важное значение для хорошего исхода у детей с ИБС. Существует несколько различий в молекулярных структурах, физиологических функциях и реакциях на раздражители в сердцах взрослых и детей 1,4,5,6. Например, под влиянием перегрузки давлением пролиферация кардиомиоцитов является основной реакцией в сердцах новорожденных, тогда как фиброз возникает в сердцах взрослых 5,6. Кроме того, многие эффективные препараты для лечения сердечной недостаточности у взрослых не оказывают терапевтического эффекта на сердечную недостаточность у детей и даже могут вызвать дальнейшее повреждение 7,8. Поэтому выводы, сделанные на взрослых животных, не могут быть непосредственно применены к молодняку.

Модель артериовенозной фистулы (АВФ) использовалась для индуцирования хронического сердечного ВО и соответствующей сердечной дисфункции в течение десятилетий у взрослых животных разных видов 9,10,11,12,13. Тем не менее, мало что известно об этой модели на постнатальных мышах. В наших предыдущих исследованиях постнатальная мышиная модель VO была успешно сгенерирована путем создания брюшного АВФ. Также было продемонстрировано изменение траектории развития ПЖ в постнатальном периодесердца 14,15,16,17.

Для изучения основного модифицированного хирургического процесса и характеристик данной модели представлен подробный протокол; В этом исследовании модель оценивается в течение 3 месяцев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, представленные здесь, соответствовали принципам, изложенным в Хельсинкской декларации, и были одобрены Комитетом по благополучию животных и изучению человека в Шанхайском детском медицинском центре (SCMC-LAWEC-2023-003). Для настоящего исследования использовали детенышей мышей C57BL/6 (P7, самцы, 3-4 г). Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей и их кормящие матери (щенки:матери = 6:1 в одной клетке) содержались в лабораторных условиях, свободных от специфических патогенов, в 12-часовом цикле света и темноты при температуре 22 ± 2 °C со свободным доступом к воде и питательной диетой. Детеныши были рандомизированы в две группы: группу VO и группу с фиктивным управлением (sham).

1. Подготовка оборудования и хирургического инструмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные обо всех материалах/оборудовании перечислены в Таблице материалов.

  1. Убедитесь в готовности и исправном функционировании следующих видов оборудования: операционный стол (пенопластовая панель), аппарат ингаляционной анестезии, микроскоп с вертикальной подсветкой и встроенной камерой, ультразвуковой аппарат с датчиком 24 МГц, термостатическая нагревательная платформа.
  2. Простерилизуйте хирургические инструменты (например, микроиглодержатель, щипцы с тонким наконечником и пружинные ножницы Vannas с круглой ручкой).
  3. Соберите следующие расходные материалы: хирургические шовные иглы 11-0 и 9-0 (конусная точка) с ниткой, полоски ленты, иглы для шприцев по 5 мл, шелк 2-0 (хирургическая фиксация), стерильные ватные палочки и гель для УЗИ.
  4. Убедитесь в присутствии следующих реагентов: бетадин, 70% этанол, обычный стерильный физиологический раствор, изофлуран, ацетаминофен, офтальмологическая мазь и крем для удаления волос.

2. Хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура операции по удалению фистулы была модифицирована в соответствии с ранее описанным методом11. На рисунке 1 показана принципиальная схема работы АВФ у мышей в постнатальном периоде.

  1. Анестезия и фиксация
    1. Поместите детенышей мышей в бокс для индукционной анестезии, снабженный 2% изофлураном/кислородом, на 2 минуты с расходом, установленным на 1 л/мин. Ввести парацетамол (0,1 мл перорально 80 мг/2,5 мл) с помощью противотуберкулезного шприца.
    2. Поместите щенков в положение лежа на спине на операционном столе с назальной ингаляцией 1,5% изофлурана с потоком 0,8 л/мин для поддержания анестезии. Отрегулируйте положение щенка, привязав лапки к неподвижным иглам шприца. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза щенков, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    3. Ущипните щенка за хвост под наркозом, чтобы проверить его реакцию на боль; Отсутствие явных движений тела указывает на адекватную анестезию.
  2. Хирургия свища
    1. Продезинфицируйте кожу тремя чередующимися скрабами из бетадина и 70% этанола, а затем накройте место операции. Разрежьте брюшную стенку и брюшину от нижней части живота до субксифоидной, чтобы полностью обнажить брюшную полость, стараясь не травмировать органы брюшной полости. Закапать обычный стерильный физиологический раствор для увлажнения наружных органов.
    2. Осторожно оттяните желудочно-кишечный тракт и мочевой пузырь от места операции с помощью ватных тампонов, чтобы визуализировать вертикальную брюшную аорту (АА) и нижнюю полую вену (НПВ) под забрюшинным пространством. Поверните операционный стол на 90° против часовой стрелки и отрегулируйте увеличение микроскопа, чтобы четко визуализировать два горизонтальных сосуда.
    3. Пункцию свища из АА в НПВ в косом направлении на 1 см дистальнее почечной артерии шовной иглой 11-0 (диаметр = 0,07 мм). Проверка успешного создания фистулы на основе набухания и смешивания венозной и артериальной крови в НПВ.
    4. Затем быстро сожмите место кровотечения с соответствующей силой с помощью сухих ватных тампонов в течение 15 с. Как можно скорее замените желудок, кишечник и мочевой пузырь в брюшной полости, чтобы способствовать гемостатической компрессии.
    5. Зашить брюшную стенку и брюшину общим швом с использованием шовной нити 9-0. Прекратите анестезию и обеспечьте щенкам 100% кислород в течение 1 минуты.
  3. Анестезиологическая реанимация
    1. Поместите щенков на нагревательную платформу с температурой 38 °C. После полного пробуждения с жизненной силой верните детенышей кормящей матери. Вся процедура длится около 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании фиктивная группа подвергается той же процедуре, за исключением этапа прокалывания.

3. Ультразвуковое подтверждение свища

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая работа ультразвукового аппарата была идентична предыдущим отчетам18,19.

  1. Подтверждение свища с помощью УЗИ брюшной полости
    1. После индукции анестезии (шаг 2.1.1) зафиксируйте мышей ленточными полосками в положении лежа на спине на теплой платформе. Затем подключите мышей к монитору электрокардиограммы (ЭКГ) с гелем для УЗИ. Поддерживайте анестезию с использованием 1,5% изофлурана при потоке 0,8 л/мин.
    2. Подготовьте кожу груди и живота с помощью крема для депиляции. Через несколько секунд удалите крем с помощью теплого ватного наконечника, смоченного в воде. Поместите датчик (24 МГц) на среднебрюшную линию и поверните маркер датчика к голове мышей.
    3. Переместите платформу влево или вправо от мышей и используйте B-режим и режим цветного допплера для визуализации изображения сосудов и сигналов крови по длинной оси18,19. Измерьте скорость кровотока в АА, НПВ и фистуле для подтверждения проходимости АВФ в режиме импульсно-волновой допплерографии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На успешное создание фистулы на УЗИ указывал сигнал турбулентного потока, видимый между АА и НПВ (рис. 2C). Допплеровская скорость кровотока в месте АВФ была значительно повышена по сравнению с относительно более низкой систолической скоростью в АА (рис. 2А, В). Более того, в отличие от нормальных паттернов кровотока в НПВ (рис. 2B), пульсирующая форма волны кровотока НПВ проксимальнее АВФ также подтвердила успешное создание фистулы (рис. 2D).
  2. Подтверждение ВО с помощью эхокардиографии
    1. Сдвиньте хвостовую часть платформы вниз, поместите датчик (24 МГц) на грудную клетку и поверните маркер датчика к правому плечу мыши. Визуализируйте модифицированный парастернальный вид легочной артерии (ПА) по длинной оси с использованием B-режима и режима цветной допплерографии.
    2. Используя режим импульсно-волновой допплерографии, измеряйте сигналы кровотока в ПА, включая интеграл скорости во времени (PA-VTI), диаметр клапана PA (PAD), время ускорения легочной артерии (PAT) и время выброса ПЖ (RVET) (рис. 2E,F и рис. 3A,B).
    3. Измеряют параметры ультразвука по среднему значению трех последовательных измерений. Рассчитайте ударный объем ПЖ (ПЖ, мл) и систолическое давление ПЖ (ПЖ, мм рт. ст.) по следующим формулам20:
      RVSV [мл] =1/4 × πD2 × VTIPA
      РВСП [мм рт.ст.] = -83,7 × PAT/RVET - индекс + 63,7
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая во внимание смещение ультразвуковых измерений, увеличение на >15% RVSV или VTIPA у мышей VO по сравнению с мышами в фиктивной группе считалось VO в RV (рис. 2E, F).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выживаемость и проходимость АВФ в течение 3 месяцев
В общей сложности 30 (75%) мышей в группе VO и 19 (95%) мышей в фиктивной группе пережили операцию AVF (рис. 4A). В группе VO восемь мышей умерли в течение 1 дня после операции из-за чрезмерного кровотечения (n = 5) или каннибализации (n = 3), в то время как две мыши умерли по неизвестным причинам через 1 месяц.

Из выживших мышей VO (n = 30) УЗИ подтвердило успешное установление свищей у 21 мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее классическая модель RV VO создавалась с использованием клапанной регургитации21; однако, по сравнению с АВФ, операция на открытом клапане сердца может потребовать более сложных методов и может быть связана со значительно более высокой смертностью, особенно у постнатальных мышей. Поскольку исследования на животных показали, что тот же эффект VO был достигнут с помощью AVF22, в этом исследовании была использована модифицированная операция по удалению абдоминальной фисту...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (No 82200309) и Инновационным проектом выдающейся медицинской команды в Нинбо (No 2022020405)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
70% этанолTiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Пероральный растворVistaPharm, Inc. Ларго, Флорида 33771, СШАNDC 66689-054-01
Наркозный аппаратRWD Life Science,КитайR550IP
Маска для анестезииRWD Life Science,Китай68680
C57BL/6 мышейXipu' er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Шанхай, Китай)
Крем для эпиляцииVeet, ФранцияVT-200
Гематоксилин и эозин Kit Beyotime biotech C0105M 
ИзофлуранRWD Life Science, КитайR510-22-10
Микроскоп  Yuyan Instruments, КитайSM-301
Иглы для хирургических швовNINGBO MEDICAL NEEDLE CO., LTD, Китай
Термостатическая нагревательная платформаQingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, Китай
Ультразвуковое устройствоFUJIFILM VisualSonics, Inc.Режимы изображения Vevo 2100включают в себя B-режим, режим цветного допплера и режим импульсной волновой допплерографии
ультразвуковой гельParker Laboratories, СШАREF 01-08
Ультразвуковой преобразовательFUJIFILM VisualSonics, Inc.МС 400

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanz, J., Sanchez-Quintana, D., Bossone, E., Bogaard, H. J., Naeije, R. Anatomy, function, and dysfunction of the right ventricle: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (12), 1463-1482 (2019).
  2. Alonso-Gonzalez, R., Dimopoulos, K., Ho, S., Oliver, J. M., Gatzoulis, M. A. The right heart and pulmonary circulation (IX). The right heart in adults with congenital heart disease. Revista Española de Cardiología. 63 (9), 1070-1086 (2010).
  3. Kovacs, A., Lakatos, B., Tokodi, M., Merkely, B. Right ventricular mechanical pattern in health and disease: beyond longitudinal shortening. Heart Failure Reviews. 24 (4), 511-520 (2019).
  4. Ye, L., et al. Role of blood oxygen saturation during postnatal human cardiomyocyte cell cycle activities. JACC: Basic to Translational Science. 5 (5), 447-460 (2020).
  5. Ye, L., et al. Pressure overload greatly promotes neonatal right ventricular cardiomyocyte proliferation: a new model for the study of heart regeneration. Journal of the American Heart Association. 9 (11), e015574(2020).
  6. Geraets, I. M. E., Glatz, J. F. C., Luiken, J., Nabben, M. Pivotal role of membrane substrate transporters on the metabolic alterations in the pressure-overloaded heart. Cardiovascular Research. 115 (6), 1000-1012 (2019).
  7. Burns, K. M., et al. New mechanistic and therapeutic targets for pediatric heart failure: report from a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Circulation. 130 (1), 79-86 (2014).
  8. Shaddy, R. E., et al. Carvedilol for children and adolescents with heart failure: a randomized controlled trial. Journal of the American Medical Association. 298 (10), 1171-1179 (2007).
  9. Flaim, S. F., Minteer, W. J., Nellis, S. H., Clark, D. P. Chronic arteriovenous shunt: evaluation of a model for heart failure in rat. American Journal of Physiology. 236 (5), H698-H704 (1979).
  10. Liu, Z., Hilbelink, D. R., Crockett, W. B., Gerdes, A. M. Regional changes in hemodynamics and cardiac myocyte size in rats with aortocaval fistulas. 1. Developing and established hypertrophy. Circulation Research. 69 (1), 52-58 (1991).
  11. Scheuermann-Freestone, M., et al. A new model of congestive heart failure in the mouse due to chronic volume overload. European Journal of Heart Failure. 3 (5), 535-543 (2001).
  12. Du, Y., Plante, E., Janicki, J. S., Brower, G. L. Temporal evaluation of cardiac myocyte hypertrophy and hyperplasia in male rats secondary to chronic volume overload. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1155-1163 (2010).
  13. Wu, J., Luo, X., Huang, Y., He, Y., Li, Z. Hemodynamics and right-ventricle functional characteristics of a swine carotid artery-jugular vein shunt model of pulmonary arterial hypertension: An 18-month experimental study. Experimental Biology and Medicine. 240 (10), 1362-1372 (2015).
  14. Sun, S., et al. Postnatal right ventricular developmental track changed by volume overload. Journal of the American Heart Association. 10 (16), e020854(2021).
  15. Wang, S., et al. Metabolic maturation during postnatal right ventricular development switches to heart-contraction regulation due to volume overload. Journal of Cardiology. 79 (1), 110-120 (2022).
  16. Zhou, C., et al. Downregulated developmental processes in the postnatal right ventricle under the influence of a volume overload. Cell Death Discovery. 7 (1), 208(2021).
  17. Cui, Q., et al. Volume overload initiates an immune response in the right ventricle at the neonatal stage. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 772336(2021).
  18. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments. (84), e51041(2014).
  19. Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013(2019).
  20. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (2), 157-163 (2010).
  21. Mori, Y., et al. A new dynamic three-dimensional digital color doppler method for quantification of pulmonary regurgitation: validation study in an animal model. Journal of the American College of Cardiology. 40 (6), 1179-1185 (2002).
  22. Bossers, G. P. L., et al. Volume load-induced right ventricular dysfunction in animal models: insights in a translational gap in congenital heart disease. European Journal of Heart Failure. 20 (4), 808-812 (2018).
  23. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  24. Jouannic, J. M., et al. The effect of a systemic arteriovenous fistula on the pulmonary arterial blood pressure in the fetal sheep. Prenatal Diagnosis. 22 (1), 48-51 (2002).
  25. Jouannic, J. M., et al. Systemic arteriovenous fistula leads to pulmonary artery remodeling and abnormal vasoreactivity in the fetal lamb. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (3), L701-L709 (2003).
  26. Patel, M. D., et al. Echocardiographic assessment of right ventricular afterload in preterm infants: maturational patterns of pulmonary artery acceleration time over the first year of age and implications for pulmonary hypertension. Journal of the American Society of Echocardiography. 32 (7), 884-894 (2019).
  27. Habash, S., et al. Normal values of the pulmonary artery acceleration time (PAAT) and the right ventricular ejection time (RVET) in children and adolescents and the impact of the PAAT/RVET-index in the assessment of pulmonary hypertension. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 35 (2), 295-306 (2019).
  28. Arkles, J. S., et al. Shape of the right ventricular Doppler envelope predicts hemodynamics and right heart function in pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (2), 268-276 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Right Ventricular OverloadArteriovenous FistulaPostnatal Mouse ModelCongenital Heart DiseaseAbdominal UltrasoundEchocardiographyHemodynamic ChangesPulmonary Artery RemodelingHistochemical StainingStroke Volume

Похожие статьи