Кулонометрическая респирометрия идеально подходит для измерения скорости метаболизма мелких организмов. При адаптации к Drosophila melanogaster в настоящем исследовании измеренное потреблениеO2 было в пределах диапазона, о котором сообщалось для дикого типа D. melanogaster в предыдущих исследованиях. ПотреблениеO2 мухой мутантами CASK , которые меньше по размеру и менее активны, было значительно ниже, чем у дикого типа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение потребленияO2 у Drosophila melanogaster с помощью кулонометрической микрореспирометрии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кулонометрическая микрореспирометрия является простым и недорогим методом измерения потребленияO2 мелкими организмами при сохранении стабильной среды. Кулонометрический микрореспирометр состоит из герметичной камеры, в которой расходуется О2, а вырабатываемый организмомСО2 удаляется абсорбирующей средой. Результирующее снижение давления запускает производство электролитического O2, а количество произведенногоO2 измеряется путем регистрации количества заряда, использованного для его генерации. В настоящем исследовании метод был адаптирован к Drosophila melanogaster, протестированному в небольших группах, с чувствительностью аппарата и условиями окружающей среды, оптимизированными для высокой стабильности. Количество O2, потребляемое мухами дикого типа в этом аппарате, соответствует тому, которое было измерено в предыдущих исследованиях. Массовое потреблениеO2 мутантами CASK, которые меньше по размеру и, как известно, менее активны, не отличалось от конгенной контрольной группы. Тем не менее, небольшой размер мутантов CASK привел к значительному снижению потребленияO2 в расчете на муху. Таким образом, микрореспирометр способен измерять потреблениеО2 у D. melanogaster, может различать скромные различия между генотипами и добавляет универсальный инструмент для измерения скорости метаболизма.
Введение
Способность измерять скорость метаболизма имеет решающее значение для полного понимания организма в его экологическом контексте. Например, необходимо измерить скорость метаболизма, чтобы понять ее роль в продолжительности жизни1, роль диеты в метаболизме2 или порог гипоксического стресса3.
Существует два основных подхода к измерению скорости метаболизма4. Прямая калориметрия измеряет расход энергии напрямую, измеряя выработку тепла. Косвенная калориметрия измеряет выработку энергии другими способами, часто с помощью респирометрического измерения ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Разведение и сбор мух
- Содержать мух при температуре 25 °C в узких флаконах, содержащих стандартный корм для дрозофилы .
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер выборки для каждого генотипа должен состоять, по крайней мере, из девяти репликаций, каждый из которых состоит из одной камеры респирометра, содержащей 15-25 мух, установленных так, как описано ниже. - Переносят мух каждые 2-3 дня.
- Обезболивайте мухСО2, собирайте группы по 15-25 самцов каждого генотипа и помещайте каждую группу в свежие бездрожжевые пищевые флаконы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы использовались для уменьшения изменчивости из-за репродуктивного статуса. Ме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выходы давления и тока контроллера респирометра показаны для одной камеры в одном эксперименте на рисунке 3А. Первый, длинный импульс тока создавал давление в камере от давления окружающей среды (примерно 992 гПа) до заданного порога выключения 1017 гПа. По мере того, как мухи потребляли O2 и поглощалиCO2, давление медленно снижалось, пока не достигало порога ON в 1016 гПа, что активировало ток через генераторO2. В показанном примере средняя амплитуда каждого.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Приведенная выше методика демонстрирует измерение потребленияО2 у D. Melanogaster с помощью электронного кулонометрического микрореспирометра. Полученные данные о потребленииО2 у D. melanogaster дикого типа находились в пределах диапазонов, описанных в большинстве предыдущих публикаций с использованием различных методов (табл. 1), хотя и несколько ниже, чем те, о которых сообщали другие специалисты 3,6.
.......Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим д-ра Линду Рестифо из Университета Аризоны за предложение провести тестирование потребления O2 мутантами CASK и за отправку мутантов CASK и их конгенных контрольных групп. Плата за публикацию была предоставлена Департаментским фондом реинвестирования биологического факультета Университета Колледж-Парка. Помещение и некоторое оборудование были предоставлены университетами в Шейди-Гроув.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 19/22 Адаптер для термометра | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Разъем для датчика |
| 2 мл Трубки с завинчивающейся крышкой | Fisher | 3464 | O2 генератор |
| 2-контактный разъем | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 генератор: обрезать до 2-контактного |
| 4-контактного гнездового разъема | TE Connectivity | 215299-4 | Разъем датчика |
| 5 мл Полипропиленовая трубка | Falcon | 352063 | отрезана до 5,5 см и перфорирована |
| 50 мл Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Камера |
| 6-жильный кабель | Zenith | 6-жильный кабель 26 ga | Кабель |
| 6-контактный гнездовой разъем переборки | Переключатель | 17982-6SG-300 | Контроллер |
| 6-контактный гнездовой разъем | Переключатель | 18982-6SG-522 | Разъем датчика |
| 6-контактный штекерный разъем | Переключатель | 16982-6PG-522 | Кабель |
| 800 мкл центрифужная трубка | Fisher | 05-408-120 | Картридж с натриевой известью |
| ABS пластиковый корпус | Bud Industries | PS-11533-G | Контроллер |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Контроллер |
| BME 280 Датчик | DIYMall | FZ1639-BME280 | Разъем датчика |
| Печатная плата Lheng | 5 x 7 см | Контроллер | |
| Сульфат меди | BioPharm | BC2045 | O2 Генератор |
| Компьютер | Azulle | Byte4 | Сбор данных |
| Ватные рулоны | Kajukajudo | #2 | Разрезать пополам, чтобы заглушить трубки от мух Разрезать на четвертинки для влажности |
| Климатическая камера | Percival | I30 VLC8 | Fly |
| Care Эпоксидная смола | JB | Сварочный пластиковый связующий Закрепите | электроды в O2 Генератор |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly |
| Care Зажимы Кека | uxcell | a20092300ux0418 | Фиксирует стеклянное соединение камеры для заглушки |
| Низковязкая эпоксидная | Loctite | E-30CL | Разъем |
| датчика OLED-дисплей | IZOKEE IZKE31-IIC-WH-3 | Контроллер | |
| Платиновая проволока 24 га | uGems | 14349 | O2 генератор |
| Силиконовая смазка | Dow-Corning | High Vacuum Seals | Камерно-штекерное соединение |
| Сода Lime | Jorvet | JO553 | CO2 абсорбция |
| Тумблер | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Контроллер |
| USB кабель | Sabrent | CB-UM63 | Контроллер |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Подключение контроллеров к компьютеру |
| Водяная баня | Amersham | 56-1165-33 | Контроль температуры |
| Водяная баня Бак | Стеклянные клетки | 15 литров безободковая акриловая | ванна для респирометров |
Ссылки
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
