Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка ex vivo среза спинного мозга для регистрации цельноклеточного патча-зажима в двигательных нейронах при стимуляции спинного мозга

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65385

⸱

8 сентября 2023 г.

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на стимуляцию спинного мозга (SCS) с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователям улучшить свои навыки в разделении спинного мозга и поддержании жизнеспособности клеток одновременно.

Аннотация

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Поскольку двигательные нейроны являются конечной единицей для выполнения сенсомоторного поведения, непосредственное изучение электрических реакций двигательных нейронов с помощью SCS может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинномозговой моторной модуляции. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые сложные трудности в достижении этой цели, включая поддержание жизнеспособности клеток, быстрое отделение спинного мозга от костной структуры и использование SCS для успешного индуцирования потенциалов действия. В данной работе мы представляем подробный протокол с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователю улучшить свои навыки по разделению спинного мозга и поддержанию жизнеспособности клеток, чтобы беспрепятственно изучить электрический механизм СКС на двигательном нейроне и избежать ненужных проб и ошибок.

Введение

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Andreas Rowald et al. сообщили, что SCS обеспечивает функцию опорно-двигательного аппарата и туловища нижних конечностей в течение одного дня1. Изучение биологического механизма СКС для восстановления опорно-двигательного аппарата является важной и актуальной областью исследований для разработки более точной стратегии СКС. Например, команда Грегуара Куртина продемонстрировала, что возбуждающий интернейрон Vsx2 и нейроны Hoxa10 в спинном мозге являются ключевыми нейронами для ответа на SCS, а клеточно-специфическая нейромодуляция возможна для восстановления способности крыс ходить после ТСМ2. Тем не менее, лишь немногие исследования сосредоточены на электрическом механизме СКС в масштабе одной клетки. Хотя хорошо известно, что надпороговый стимул постоянным током может вызывать потенциалы действия (ОП) в классическом эксперименте с кальмарами 3,4,5, до сих пор неясно, как импульсная переменная электрическая стимуляция, такая как СКС, влияет на генерацию двигательного сигнала.

Учитывая сложность интраспинальных нейронных цепей, для исследования электрического механизма СКС важен соответствующий отбор клеточной популяции. Несмотря на то, что СКС восстанавливает двигательную функцию, активируя проприоцептивный путь6, двигательные нейроны являются последней единицей для выполнения двигательной команды, полученной путем интеграции афферентного входа7 проприоцептивной информации. Таким образом, непосредственное изучение электрических характеристик двигательных нейронов с помощью СКС может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинальной моторной модуляции.

Как известно, патч-клам является золотым стандартом клеточной электрофизиологической регистрации с чрезвычайно высоким пространственно-временным разрешением8. Поэтому в данной работе описан метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС. По сравнению с головным мозгом, патч-зажим9 является более сложным по следующим причинам: (1) Спинной мозг защищен позвоночным каналом с крошечным объемом, который требует очень тонких микроманипуляций и строгого ледяного поддержания для достижения лучшей жизнеспособности клеток. (2) Поскольку спинной мозг слишком тонкий, чтобы его можно было закрепить на лотке для резки, его следует погрузить в агарозу с низкой температурой плавления и обрезать после затвердевания.

Таким образом, этот метод дает технические возможности в рассечении спинного мозга и одновременном поддержании жизнеспособности клеток, чтобы плавно изучить электрический механизм СКС на двигательных нейронах и избежать ненужных проб и ошибок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил все эксперименты на животных, и исследования были проведены в соответствии с соответствующими правилами защиты животных.

1. Подготовка животных

  1. Животные
    1. Информация о содержании: Домашние крысы-самцы Спрэга-Доули (послеродовой период 10-14 дней, P10-P14) в специфической среде, свободной от патогенов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия в помещении поддерживались на уровне 20 °C ± 2 °C, влажность: 50%-60%, с 12-часовым циклом света/темноты. Животные имели свободный доступ к пище и воде.
    2. Ретроградная маркировка двигательных нейронов: инъекция фторзолота (FG) в двустороннюю переднюю большеберцовую мышцу и икроножную мышцу (2% в стерильном физиологическом растворе, 50 мкл на мышцу), чтобы ретроградно пометить двигательные нейроны за 2 дня до жертвоприношения.
  2. Решения
    1. Приготовьте режущий раствор: смешайте 120 мМ холина хлорида, 2,6 мМ KCl, 26 мМ NaHCO 3, 1,25 мМ 2 PO4, 0,5 мМ CaCl 2, 7 мМ MgCl2, 1,3 мМ аскорбиновой кислоты, 15 мМ глюкозы. Предварительно взбалтывают раствор с 95% О2 и 5%СО2 (доведите до рН 7,4 с КОН) в течение 30 мин перед вскрытием и нарезкой. Остудите раствор колотым льдом.
    2. Приготовление искусственной спинномозговой жидкости (ОКСФ): смешать 126 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ2PO4; 1,3 мМ MgCl 2, 2,4 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 и 10 мМ глюкозы. Предварительно взбалтывайте раствор с 95% О2 и 5%СО2 за 30 мин до инкубации.
    3. Приготовьте внутриклеточный раствор: смешайте 126 мМ К-глюконат, 2 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 0,2 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 4 мМNa2АТФ, 0,4 мМ Na2ГТФ, 10 мМ К-фосфокреатина и 0,5% нейробиотина (рН 7,25 и 305 мОсм/кг). Остудите раствор колотым льдом.
    4. Приготовьте легкоплавкий агарозный гель: растворите 4 г агарозы в 100 мл режущего раствора и используйте магнитный ротор для перемешивания, чтобы полностью растворить его. За 30 мин до заделки нагрейте агарозу с низкой температурой плавления в микроволновой печи на высокой мощности в течение 1 мин, а затем переложите ее на водяную баню с температурой 39 °C для поддержания жидкого состояния.
  3. Подготовка инструмента
    1. Поместите колотый лед на перфузионный лоток (дополнительный рисунок 1A) за 10 минут до перфузии. Заранее поместите анатомический лоток (дополнительный рисунок 1B) и лоток для резки (дополнительный рисунок 1C) с водяной лентой при температуре -80 °C на ночь.
    2. Заранее поместите инкубационную камеру с нейлоновой сеткой в духовку при температуре 45 °C на ночь.
    3. Используйте агарозу с низкой температурой плавления для изготовления платформы с уклоном 35° и толщиной 2 мм (дополнительный рисунок 1D). После затвердевания геля поместите их в центр 35-миллиметровой чашки Петри, чтобы поддержать спинной мозг в следующих предстоящих процедурах.
  4. Интракардиальная перфузия
    1. Обезболивайте крыс 2,5% трибромэтанолом (160 мкл/10 г) путем внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что крысы находятся под полным наркозом, проверив отсутствие реакции на внешние раздражители, такие как легкое пощипывание пальца ноги.
    2. Когда надлежащая анестезия будет подтверждена, уложите крыс на спину и обездвижьте их в чашке Петри, наполненной силикагелем.
    3. Вырезают 5-миллиметровый продольный разрез кожи каудально к мечевидному отростку, затем полностью расширяют подкожное пространство. Сделайте 2-сантиметровый продольный разрез кожи вдоль вентральной средней линии, чтобы полностью обнажить наружную грудную стенку, начиная с вышеупомянутого разреза и заканчивая верхней частью грудной клетки.
    4. Используйте зубчатый пинцет, чтобы поднять мечевидный узел (дополнительный рисунок 2A), а затем используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать диафрагму. Разрежьте грудину по обеим сторонам мечевидного отростка, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце (дополнительный рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы сохранить внутренние грудные сосуды с обеих сторон; В противном случае это может вызвать массивное кровотечение.
    5. Используйте беззубый пинцет, чтобы поднять левый желудочек. Введите иглу 22 G в верхушку левого желудочка вдоль продольной оси левого желудочка (дополнительный рисунок 2C). При этом наблюдайте за ритмичной пульсацией крови в перфузионной трубке, иначе игла может проколоться в правый желудочек, что может привести к плохому перфузионному эффекту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует использовать зубчатый пинцет; В противном случае это может привести к дополнительному вытеканию крови из места удержания пинцета.
    6. Тонкими ножницами разрежьте правое предсердие (дополнительный рисунок 2C), затем вручную введите 100 мл ледяной перфузионной жидкости со скоростью около 2 мл/с в течение 1 минуты.
      Примечание: Когда печень и лапы крыс бледнеют, а кровь не вытекает из правого предсердия, можно добиться хорошей перфузии.
  5. Рассечение спинного мозга (рис. 1)
    1. Поместите крысу в положение лежа на животе и перережьте позвоночник в передней верхней подвздошной кости (примерно на уровне позвонка L4) и в точке смещения кривизны грудного столба (около уровня позвонка Т6) соответственно (рис. 1А). Затем немедленно поместите изолированный позвоночник в насыщенный кислородом ледяной перфузионный раствор, чтобы смыть остатки крови и жировой ткани; Эта процедура полезна для поддержания чистоты операционного поля в последующих процедурах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параспинальные мышцы должны быть зарезервированы, что способствует последующей фиксации позвоночника с помощью штифта в виде насекомых.
    2. Немедленно переместите изолированный позвоночник в анатомическую лопатку (рис. 1B) тыльной стороной вверх и ростральным концом ближе к оператору. Наполните анатомический лоток 50 мл непрерывно насыщенного кислородом ледяного режущего раствора (Рисунок 1B).
    3. Используйте четыре штифта в виде насекомых, чтобы зафиксировать позвоночник, проникнув в параспинальные мышцы (рис. 1B).
    4. Под диссекционным микроскопом микроножницами разрезают ножки позвонков с обеих сторон от рострального конца, что можно назвать «ламинэктомией» (рис. 1С). Обратите внимание, чтобы не повредить спинной мозг. Тем временем используйте пинцет с микрозубьями, чтобы приподнять разрезанное тело позвонка.
    5. После ламинэктомии не следует сразу отделять спинной мозг от спинномозгового канала. Вместо этого используйте микроножницы, чтобы разрезать твердую мозговую оболочку вдоль дорсальной средней линии, что способствует поглощению питательных веществ между клетками и насыщенной кислородом ACSF (рис. 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не разрывайте твердую мозговую оболочку. Разрешается разрезать твердую мозговую оболочку микроножницами; В противном случае нервный корешок и паренхима позвоночника будут серьезно повреждены!
    6. Приподнимите ростральную часть спинного мозга, затем осторожно отрежьте нервный корешок с запасом около 1 мм (рис. 1E). Отделив спинной мозг от позвоночного канала, используйте 2 штифта в виде насекомых, чтобы зафиксировать спинной мозг вентральной стороной вверх (рис. 1F).
    7. С помощью микроножниц разрежьте твердую мозговую оболочку вдоль вентральной срединной линии (рис. 1F). Отрежьте лишние нервные корешки, оставив около 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нерв гораздо более цепкий, чем спинной мозг. Если зарезервированный нервный корешок слишком длинный (>1 мм), вибратом не может отрезать нервный корешок, что может привести к серьезному разрыву паренхимы позвоночника.
    8. С помощью микроножниц отделите поясничное увеличение до длины 6-7 мм (рис. 1G).
  6. Встраивание в легкоплавкую агарозу
    1. Расположите поясничное расширение на склоне 35° (рис. 1H) тыльной стороной вверх и хвостовым концом вниз. Используйте впитывающую фильтровальную бумагу, чтобы удалить обильную воду с поверхности ткани (Рисунок 1H).
    2. Медленно влейте расплавленный агарозный гель в чашку Петри, содержащую поясничное увеличение (Рисунок 1I).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте слишком быстро, иначе в геле будут скапливаться пузырьки.
    3. Поместите вышеуказанную чашку Петри в смесь льда и воды, чтобы гель как можно скорее охладился, что способствует поддержанию активности клеток.
    4. Обрежьте гель в кубик размером 15 мм x 10 мм x 10 мм и закрепите его на диске с образцом с помощью суперклея (рис. 1J).
  7. Разрезание на ломтики
    1. Поместите диск для образцов в предварительно замороженный режущий лоток, затем залейте ледяным режущим раствором (Рисунок 1K). Непрерывно пузырько с 95% CO 2 и 5% O2 в лоток для резки.
    2. Задайте параметры вибратома: толщина: 350 мкм; скорость: 0,14-0,16 мм/с, амплитуда: 1,0 мм, частота вибрации: 85 Гц.
    3. Заготавливают по 2-3 подходящих ломтика на одно животное. Запишите 1-2 здоровых двигательных нейрона FG+ на срез, с диапазоном 5-6 клеток на животное.
  8. Инкубация
    1. С помощью пинцета для крышки зафиксируйте ломтик (Рисунок 1L) и поместите его в инкубационную камеру, заполненную непрерывно насыщенным кислородом ACSF. Поместите инкубационную камеру на водяную баню при температуре 32 °C на 30 минут, а затем продолжайте инкубировать ее при комнатной температуре (RT) еще 30 минут перед записью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные процедуры, от анестезии до получения первого среза, должны быть завершены в течение 20-30 минут, чтобы максимально сохранить жизнеспособность клеток. Двигательные нейроны в каждом срезе могут сохранять свою жизнеспособность в течение примерно 6-7 часов.

2. Запись патч-зажимов с помощью СКС (рис. 2)

  1. Препараты
    1. Перфузируйте регистрирующую камеру непрерывно пузырчатым ACSF со скоростью около 1-2 мл/мин. Регулируйте расход индивидуально с помощью панели управления на перистальтическом насосе.
    2. Поместите срез в камеру записи. Используйте U-образную платиновую проволоку с нейлоновыми нитями, чтобы надежно стабилизировать срез на месте.
    3. Используйте инфракрасный дифференциально-интерференционный контрастный микроскоп (IR-DIC) для наблюдения за срезом. Под линзой объектива 4x убедитесь, что длина дорсального корня составляет около 1 мм. Найдите область, где дорсальный корешок входит в паренхиму, затем переместите центральное поле зрения в эту область.
    4. Соедините генератор импульсов с электродами, изготовленными по индивидуальному заказу (рис. 2А).
  2. Конфигурация СКС
    1. Расположите анод СКС рядом с дорсальной срединной линией с помощью системы микроманипуляций (рис. 2Б).
    2. Разместите катод СКС рядом с зоной входа дорсального корня (DREZ) с помощью микроманипуляционной системы (рис. 2B).
  3. Нацеливание на клетки и визуализация
    1. С помощью ИК-DIC с объективом с 10-кратным увеличением найдите дорсолатеральную область двигательной колонки, где расположено большинство двигательных нейронов. Затем переместите центральное поле зрения в эту область.
    2. Переключитесь на объектив с 60-кратным увеличением, чтобы найти здоровый нейрон с гладкой и яркой поверхностью и невидимыми ядрами (рис. 2C, F).
    3. Немного уменьшите интенсивность ИК-излучения и включите флуоресцентный источник света. Переключите светофильтр на широкополосный ультрафиолетовый возбуждающий фильтр (рис. 2D, G), чтобы выбрать соответствующий FG-положительный (FG+) двигательный нейрон (рис. 2E, H).
    4. Используйте отсасывающие электроды, чтобы применить стимуляцию 1x двигательного порога к дорсальному корешку. Если вызванный потенциал действия обнаруживается в двигательных нейронах (дополнительный рисунок 3), это подтверждает, что активность дорсального корешка не нарушена. Если нет, этот кусочек следует выбросить.
  4. Запись с помощью патч-зажимов
    1. Наполните микропипетку внутриклеточным раствором и вставьте ее в электрододержатель. Используйте систему микроманипуляций, чтобы опустить пипетку в ванну ACSF. Сопротивление пипетки колеблется в пределах 5-8 МОм.
    2. Приложите небольшое положительное давление к пипетке, чтобы сдуть пыль и клеточный мусор.
      1. Опустите электрод, чтобы приблизиться к элементу. При соприкосновении пипетки с поверхностью нейрона FG+ на уровне наконечника становится видно небольшое углубление мембраны. Отпустите положительное давление.
      2. Затем приложите небольшое отрицательное давление к пипетке с помощью шприца. При этом создается небольшое количество всасывания, которое втягивает клеточную мембрану в контакт со стеклянной пипеткой. Всегда обращайте внимание на общее сопротивление в программном интерфейсе до тех пор, пока значение сопротивления не увеличится до гигаомов (>1 ГОм). Затем образуется гигазеаль.
    3. Зажмите мембранный потенциал при -70 мВ, затем нажмите кнопку быстрой компенсации емкости на программном интерфейсе усилителя. Осторожно примените кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать клеточную мембрану, затем нажмите кнопку компенсации медленной емкости на программном интерфейсе усилителя. На этом этапе получается хорошая цельноклеточная конфигурация.
    4. Переключитесь в режим токоизмерительных клещей, нажав кнопку IC в интерфейсе программного обеспечения, и запишите мембранный потенциал покоя (RMP).
    5. Применяют СКС в течение 1-2 с амплитудой 1-10 мА, при этом ширина и частота импульсов фиксируются на уровне 210 мкс и 40 Гц соответственно. Определите двигательный порог, медленно увеличивая амплитуду стимуляции до тех пор, пока не будет наблюдаться первое АД.
    6. Различают замедленное и немедленное возбуждение мотонейронов с помощью 5-секундной инжекции деполяризационного тока вокруг реобазы в режиме токо-клещей10,11,12. Немедленное возбуждение двигательных нейронов: низкое реооснование может индуцировать немедленное и повторяющееся возбуждение со стабильной частотой возбуждения; Замедленное возбуждение двигательных нейронов: Высокое реооснование может индуцировать отсроченное начало повторяющегося возбуждения с ускорением частоты возбуждения (рис. 3).
    7. Когда SCS выключена, продолжайте записывать мембранный потенциал для захвата самопроизвольного срабатывания ТД.
    8. Выполнение записей с помощью поклещи напряжения для возбуждающего постсинаптического тока (EPSC) при включенном и выключенном SCS. Параметр стимуляции составляет 1x двигательный порог, 210 мкс, 2 Гц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Благодаря строгому низкотемпературному поддержанию во время тонкой работы (дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2 и рисунок 1) жизнеспособность ячейки была достаточно хорошей, чтобы выполнять последующие электрофизиологические записи. Чтобы максимально смоделировать клинический сценарий, мы использовали микроманипуляции для размещения катода и анода SCS рядом с дорсальной срединной линией и DREZ соответственно (рис. 2), что могло ини...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Информация о движении, модулированная СКС, наконец, конвергентна к двигательным нейронам. Таким образом, использование двигательных нейронов в качестве объекта исследования может упростить дизайн исследования и более непосредственно раскрыть механизм нейромодуляции СКС. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые трудности, в том числе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая для молодых ученых (52207254 и 82301657) и Китайским фондом постдокторантуры (2022M711833).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аденозин 5'-трифосфат магниевая сольSigmaA9187
Аскорбиновая кислотаSigmaA4034
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
Холин хлоридSigmaC7527
Крышка слайд-пинцетаVETUS36A-SAЗажим ломтика
D-глюкозаSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Тонкие ножницыRWD Life ScienceS12006-10Разрежьте диафрагму
Источник флуоресцентного светаOlympus U-HGLGPS
Фтор-ЗолотоФлюорохромФлуорохромМетка моторного нейрона
Гуанозин 5&-прайм;-трифосфат Гидрат солинатрия SigmaG8877
HEPESSigmaH3375
инфракрасная ПЗС-камераDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-глюконатSigmaP1847
Низкая температура плавления агарозныйSigmaA9414
MgSO4· 7H2OМикроманипулятор SigmaM2773
 Саттер Инструмент MP-200
Съемник для микропипетокИнструмент SutterP1000
Микроножницы Jinzhongwa1020Микроскоп для ламинэктомии
для анатомииOlympus SZX10
Микроскоп для экклетрофиологииOlympus BX51WI
Пинцет с микрозубьямиRWD Life ScienceF11008-09Подъем разрезанного тела позвонка
NaClSigmaS5886
2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-фосфокреатинSigmaP7936
Объектив для экклетрофиологииOlympus LUMPLFLN60XWрабочее расстояние 2 мм 
Осмометр Продвинутый FISKE 210
Усилитель с патч-зажимом Аксон Multiclamp 700B
Патч-зажим дигитайзерAxon pH-метр Digidata 1550B
 Mettler Toledo FE28
Срез АнкерМногоканальная системаSHD-27H
Стимулятор спинного мозгаPINST901
Зубчатый пинцетRWD Life ScienceF13030-10Подъем мечевидного
вибратомаLeicaVT1200S
Широкополосный фильтр ультрафиолетового возбужденияOlympus У-МФ2

Ссылки

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385(2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046(2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917(2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Подготовка ex vivo среза спинного мозга для регистрации цельноклеточного патча-зажима в двигательных нейронах при стимуляции спинного мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.