В данной работе мы представляем метод стандартизации сшитого пептида, связанного с коллагеном, агонистом тромбоцитов (CRP-XL) с использованием аггрегометрии светопропускания. В то время как протокол нацелен на функцию тромбоцитов, экспериментальный процесс может быть применен к большинству биологических молекул и биотестов, чтобы обеспечить научную строгость и воспроизводимость.
Методическая статья
Воспроизводимость и гармонизация в исследованиях с использованием биологических стандартов: на примере агониста тромбоцитов коллаген-связанного пептида
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Метрология - наука о измерении - это предмет, которому мало кто из ученых-биологов преподается в процессе обучения в ущерб себе; Применение простых процессов стандартизации в повседневной работе обеспечивает уверенность в данных и воспроизводимость в зависимости от расстояния и времени.
Этот метод демонстрирует, как стандартизировать основной лабораторный эксперимент, широко используемый в исследованиях гемостаза и клинической практике, в частности, измерение ответов на агонист рецептора тромбоцитарного коллагена (гликопротеин [GP]VI), сшитый пептид, связанный с коллагеном (CRP-XL), с помощью агрегометрии светопропускания (LTA). Использование этого подхода обеспечит внутрилабораторную воспроизводимость и межлабораторную гармонизацию, независимо от наличия агонистов или поставщика. Важно отметить, что этот метод применим и к другим агонистам тромбоцитов, и ко многим другим биологическим молекулам и биотестам.
Процесс, описанный ниже, включает в себя проведение серии 6-8-точечных разбавлений «стандарта» и «теста» (материала, который вы проверяете) и их параллельное выполнение в выбранном анализе (в данном случае LTA). CRP-XL используется при массовых/объемных концентрациях, но не каждый материал дает одинаковую биологическую активность при заданной концентрации, поэтому для сравнения стандартного и испытуемого материала и определения того, какая концентрация необходима для получения эквивалентной активности, делается серия разведений. Серия разбавления должна охватывать агрегацию от 0 до 100%. Данные строятся с помощью нелинейной регрессии, и определяется значение EC50 для каждого образца (стандартного и тестового). Чтобы определить активность, разделите значение EC50 стандарта на значение теста, чтобы определить, насколько он более или менее сильнодействующий, и соответствующим образом отрегулируйте концентрацию. Такой подход гарантирует, что одна и та же биологическая «активность» будет добавляться к анализу снова и снова.
Введение
Многие из нас используют биологические агонисты и антагонисты в своих экспериментах, чаще всего в биологическом анализе, который количественно оценивает их влияние на функцию клеток в определенных условиях. Метод, описанный здесь, предназначен для агониста тромбоцитов, связанного с коллагеном, сшитого (CRP-XL), агониста гликопротеина VI типа, который активирует тромбоциты и активность которого может быть измерена в различных анализах (агрегометрия светопропускания, микроскопия, проточная цитометрия, высвобождение Ca2+ и т. д.), но протокол стандартизации агонистов применим к любому биологическому агонисту/антагонисту и/или биотесту. Физические науки хорошо разбираются в использовании стандартов в своей повседневной работе, и компании, разрабатывающие биотерапевтические препараты в коммерческом секторе, понимают ценность использования референтных стандартов1, однако они по-прежнему недостаточно используются многими учеными-биологами, особенно в академическом исследовательскомсообществе, и их недостаточное использование негативно сказывается на качестве научной продукции.
CRP-XL является специфическим агонистом GPVI, который используется тромбоцитарным полем в течение десятилетий с момента его описания в 1995 году, помогая сообществу разграничить роль GPVI от роли других коллагенсвязывающих тромбоцитарных белков с момента 3,4. Этот агонист может быть получен из различных коммерческих источников или произведен самостоятельно. Пептидный мономер может быть приобретен у поставщика, а затем сшит собственными силами, или это может быть сделано поставщиком за дополнительную плату. Дальнейшая экономия средств может быть достигнута за счет снижения требуемой чистоты при доставке (например, 70% против 95%). Также нет единого мнения о том, как следует хранить CRP-XL: некоторые выбирают криохранение, а другие — охлаждение, некоторые хранят материал лиофилизированным до использования, а другие хранят его в растворе (воде или буфере, в зависимости от предпочтений). Поэтому качество и состав лабораторных запасов не стандартизированы или гармонизированы. Поскольку этот агонист используется в определенной концентрации (масса/объем), а не в единицах активности, активность CRP-XL в одной лаборатории, например, в концентрации 1 мкг/мл, не будет такой же, как в другой. Стоит отметить, что другие агонисты тромбоцитов, используемые в этой области, уже стандартизированы (например, тромбин, который поставляется и используется в единицах активности, а не массы/объема), поэтому переход от массы/объема к единицам биологического не должен быть слишком сложным для сообщества. Следует также отметить, что реакция пациентов на агонисты тромбоцитов, включая СРБ-XL, варьирует с точки зрения их чувствительности к агонистам, а также их способности реагировать (степень ответа)5, поэтому еще более важно использовать в анализах последовательное количество активности агонистов.
Если агонисты тромбоцитов могут быть гармонизированы путем их использования с определенной активностью, а не с весом/объемом, можно гарантировать, что эксперимент в одной лаборатории будет напрямую сопоставим с экспериментом в других лабораториях и может быть точно воспроизведен с уверенностью. До тех пор, пока не будет достигнуто соглашение о том, как хранить и стандартизировать активность CRP-XL, важно проводить регулярные проверки материала, чтобы гарантировать его постоянство в течение месяцев/лет, в течение которых он используется.
Присвоение ценности деятельности для биологических стандартов должно осуществляться на основе совместных многоцентровых исследований (например, 6,7) и требует специальных знаний. Необходимость установленных биологических стандартов для агонистов тромбоцитов была недавно подчеркнута совместным многоцентровымисследованием8, проведенным при поддержке Международного общества тромбоза и гемостаза (ISTH); До тех пор, пока не появится международный стандарт CRP-XL, исследователи могут стандартизировать свои собственные материалы на местном уровне, чтобы обеспечить согласованность с течением времени, и чтобы новый материал, полученный коммерчески или собственными силами, имел сопоставимую активность с предыдущими препаратами, а также с другими препаратами.
Протокол
Кровь должна быть взята у здоровых добровольцев и обработана в соответствии с местными правилами. Этот протокол измеряет агонист-индуцированную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме (PRP) с помощью агрегометрии светопропускания (LTA). ISTH предоставляет стандартизированные протоколы, в том числе метод 2013 года для подготовки PRP и LTA9. Собирайте цельную кровь в 4% цитрат натрия в соответствии с рекомендациями ISTH в соответствии с правилами местного комитета по этике. Исключите доноров, принимавших какие-либо НПВП в течение последних 2 недель.
1. Процедура анализа
- Возьмите аликвоту исходного CRP-XL и разбавьте его в пробирном буфере (Tyrodes10) (Таблица 1) до начальной концентрации, которая вызовет максимальную агрегацию (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже шага 1.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: В литературе концентрация 1 мкг/мл вызывает максимальную агрегацию, но в некоторых лабораториях для достижения того же эффекта требуются более высокие концентрации - скорректируйте серию разведения соответствующим образом - Сделайте соответствующую серию разбавлений со стандартом (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже шага 1.3 и Рисунок 1) таким образом, чтобы концентрации были такими же, как у исследуемого реагента.
- Изготовьте серию 6-8-точечных разбавлений для теста и стандарта, опять же в буфере для анализа, который принимает реакцию агрегации от 100% до 0% агрегации. Пример, показывающий 8-точечную кривую концентрации ряда разбавлений, показан в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые лаборатории добавляют агонист в общей сложности 10% объема анализа, например, 50 мкл агониста на 450 мкл тромбоцитов, так что они разбавляют 10-кратную концентрацию до конечной 1-кратной концентрации в анализе, в то время как другие добавляют меньшие (более концентрированные) объемы агониста, например, 5 мкл агониста на 495 мкл тромбоцитов - просто убедитесь, что серия разведения подходит для анализа, принимая во внимание, как объемное смещение влияет на концентрацию тромбоцитов – опять же, будьте последовательны. В этом примере 30 мкл 10-кратного агониста добавляется к 270 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). - После того, как тромбоциты отдохнут и будут готовы к использованию, натрите их в кюветы LTA, добавьте перемешиватель и дайте им нагреться до 37 °C в лунках для выдержки.
- Как только температура нагреется, поместите кювету (кюветы) в агрегатометр и начните записывать следы (следы). Добавьте агонист (при перемешивании) и запишите данные.
- Повторяйте шаг 1.4 для каждой концентрации теста и эталона до тех пор, пока не будут собраны данные, необходимые для построения кривых (примеры кривых показаны на рисунке 2).
- Рассчитать эффективность испытуемого реагента относительно эффективности стандартного; Опять же, используйте любую метрику - максимальную агрегацию или площадь под кривой - при условии, что существует согласованность и модель анализа соответствующим образом соответствует данным.
2. Проверка кривых концентрации
- Во-первых, убедитесь, что кривые реакции на концентрацию параллельны. Существует множество программных пакетов, которые делают это, но здесь процесс описан для Graphpad Prism (см. рис. 3).
- Введите данные так, чтобы log(концентрация) находился на оси X, а отклик (% максимальной агрегации/AUC) — на оси Y (рисунок 3A)
- Преобразование концентраций CRP-XL (Рисунок 3B)
- Выберите Non-Linear Regression (Нелинейная регрессия) из функций Analysis (Анализ) и используйте уравнение для стимуляции/торможения по принципу «доза-реакция».
- Выберите логарифм (агонист) и отклик (переменный наклон) - используйте 3- или 4-стороннюю аппроксимацию в зависимости от того, что лучше для данных.
- Определите, являются ли кривые параллельными, с помощью вкладки Compare (как показано на рисунке 3C) и нажмите кнопку, чтобы сравнить наборы данных, чтобы убедиться, что наклон (Уклон холма) и асимптоты ( Верх и Низ кривых) эквивалентны. В этом примере уклон холма для теста равен 2,279, а стандарт равен 2,025, что дает коэффициент 1,125.
- Если наклоны параллельны (например, критерий приемлемости отношения уклонов между 0,8-1,25) и асимптоты эквивалентны, продолжайте расчет потенции (EC50), используя шаги 2.1.3 и 2.1.4. В приведенном здесь примере асимптоты были ограничены, так как вычисление на шаге 2.1.5 подтвердило, что асимптоты эквивалентны.
- Разделите значение EC50 стандарта на значение теста, чтобы определить относительную эффективность. В приведенном здесь примере test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, т.е. «тест» вдвое слабее стандарта.
- Скорректируйте массовую/объемную концентрацию с учетом разницы в эффективности, т.е. если стандарт использовался ранее в концентрации 1 мкг/мл, то новый материал будет использоваться в концентрации 1/0,4846 = 2,063 мкг/мл), чтобы обеспечить использование в экспериментах сопоставимых количеств активного материала
Результаты
На рисунке 1 приведено схематическое представление серии разбавлений, предназначенное для того, чтобы подчеркнуть, что серия разбавления необходима как для стандарта, так и для испытания. На рисунке 2A показаны трассировки агрегирования для стандарта, а тестовые данные показаны на рисунке 2B. При 0,075 мкг/мл наблюдается четкая реакция на стандарт, в то время как для теста соответствующая концентрация (0,075 мкг/мл) является плоской, т.е. отсутствует. Эти данные используются для построения последующих графиков, чтобы получить EC50. В приведенном здесь примере для построения кривой «концентрация-реакция» и определения EC50 использовалась 100%-ная максимальная агрегация, как показано на рисунке 3.
Рисунок 1: Графическое описание двух серий разведений теста (слева) и стандарта (справа). Начиная с максимальной концентрации (рекомендуемая концентрация: 10 мкг/мл CRP-XL), последовательные 1 из 2 разведений производятся параллельно в 8 точках (>3 log единицы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Трассировки агрегации для стандартной (слева) и тестовой серии разведения (справа). По мере агрегации тромбоцитов (ось x) количество света, проходящего через образец и достигающего датчика, увеличивается (ось y). (А) Стандарт. (B) Тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ввод и анализ данных. (A) Данные вводятся, (B) преобразуются и (C,D) анализируются на предмет параллелизма (попросите программное обеспечение определить, сопоставимы ли наклоны и асимптоты Хилла [C]). (E) Если кривые параллельны, определите потенцию (EC50) с помощью аппроксимации кривой нелинейной регрессии. (F) Преобразованные данные на графике. Пожалуйста, обратитесь к методу для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Буфер Tyrodes9 | ||
| Составляющих | Концентрация | Комментарии |
| NaCl | 134 мМ | |
| Дна2ХПО4 | 0,34 мМ | |
| KCl | 2,9 мМ | |
| NaHCO3 | 12 мМ | |
| 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES) | 20 мМ | |
| Глюкоза | 5 мМ | |
| MgCl2 | 1 мМ | рН 7,3 |
Таблица 1: Состав буфера Tyrodes.
| Серия 8-точечного разбавления | |
| Разбавление 1 | 10 мкг/мл |
| Разбавление 2 | 5 мкг/мл |
| Разбавление 3 | 2,5 мкг/мл |
| Разбавление 4 | 1,25 мкг/мл |
| Разбавление 5 | 0,625 мкг/мл |
| Разбавление 6 | 0,3125 мкг/мл |
| Разбавление 7 | 0,15625 мкг/мл |
| Разбавление 8 | 0,073125 мкг/мл |
Таблица 2: Пример, показывающий 8-точечный ряд разбавления.
Обсуждение
Как показано здесь, процесс стандартизации материалов очень прост. Несмотря на то, что для оценки новых партий материала и/или проверки того, что текущая партия стабильна и не теряет активности с течением времени, требуется некоторое время, наградой является то, что эксперименты воспроизводимы снова и снова и сравнимы по годам, а не только по сроку службы партии реагента. Это также означает, что другие исследователи могут точно воссоздать условия анализа, и что сообщество гармонизируется на глобальном уровне. Важнейшие этапы протокола включают сбор цельной крови и подготовку PRP9, а также точность при проведении серии разведений. Также важно убедиться, что испытуемая и стандартная кривые параллельны, прежде чем приступать к сравнению EC50 . Если линии не параллельны или асимптоты не эквивалентны, это может указывать на то, что тестовый и стандартный материал в некоторой степени отличаются.
Каждый, кто работает в биологических науках, знает, что биологические анализы не всегда работают последовательно, поэтому нужно помнить об этом при оценке данных. В приведенном здесь примере, несмотря на то, что мы используем одни и те же доноры для измерения эффективности двух очень похожих, если не идентичных, материалов, склоны холмов и асимптоты не идентичны. Тем не менее, мы допускаем некоторую степень изменчивости и заключаем, что кривые в данном случае параллельны и, следовательно, пригодны для сравнения и корректировки потенции. Биологические молекулы большие и сложные, и посттрансляционные модификации во время производства могут повлиять на их эффективность в биотестах. Стандартизация биомолекул и биотестов не может быть осуществлена только с использованием массы или объема и должна осуществляться путем количественной оценки и сравнения биологической активности в биопробе11. Необходимо использовать свою подготовку и опыт, чтобы оценить данные в контексте анализа.
Ограничения метода заключаются в том, что, хотя данные могут указывать на проблему с реагентом (реагентами), он не может сказать вам, в чем заключается проблема. Потребуется дальнейшая работа, чтобы определить, почему материалы не сопоставимы. В идеальном мире любой материал, критически важный для экспериментов и последующих научных выводов, должен быть проверен с помощью масс-спектроскопии, но это не всегда возможно. Тем не менее, если данные не сопоставимы, дальнейшее расследование все же оправдано в том или ином качестве. Еще одним ограничением этого подхода является время и ресурсы, необходимые для его выполнения. В идеале тест и стандарт должны быть сравнены на 3-6 донорах, чтобы обеспечить некоторую уверенность в определении биологической активности материала, но мы считаем, что это оправдано поддержкой воспроизводимости и надежности. Стандартизация биологического материала не требуется каждый раз, когда проводятся эксперименты, но, как минимум, это следует делать для каждой новой партии агонистов, желательно чаще, в зависимости от стабильности и использования. В самом деле, если стандарт будет доступен, это то, что международные организации по стандартизации могут внести ясность.
Несмотря на то, что приведенный здесь пример относится к CRP-XL в контексте измерения агрегации тромбоцитов, протокол сравнения биологической активности биомолекул в биотестах широко применим во всем секторе.
Раскрытие информации
Авторам нечего декларировать.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% цитрат натрия | Sigma-Aldrich | S1804 | Антикоагулянт растворенный в воде9 |
| 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | Сшитый тройной спиральный пептид2,4 с последовательностью GCP*(GPP*)GCP*G (однобуквенный аминокислотный код: P* = гидроксипролин) был получен по индивидуальному заказу от Peptide Protein Research Ltd. | |
| Кюветы и мешалки | Stago | 86921 | Расходные материалы для агрегатометра |
| Глюкоза | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl<суб>2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis программный пакет | |
| Platelet богатая | : Выделен из цельной крови здоровых добровольцев, не принимающих нестероидные противовоспалительные препараты, в течение как минимум 10 дней8. |
Ссылки
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577(2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123(2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209(2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338(2019).
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide
Posted by JoVE Editors on 12/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide. The Authors section was updated from:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1National Institute for Biological Standards and Control
to:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1Medicines and Healthcare products Regulatory Agency
Теги
