Методическая статья

Адъювантная активность микобактерий паратуберкулеза в повышении иммуногенности аутоантигенов при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

DOI:

10.3791/65422

⸱

12 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем альтернативный протокол для активной индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей C57BL / 6 с использованием иммуногенного эпитопа миелина олигодендроцитарного гликопротеина (MOG) 35-55, суспендированного в неполном адъюванте Фройнда, содержащем убитый теплом подвид Mycobacterium avium paratuberculosis.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), индуцированный гликопротеином миелина олигодендроцитов (МОГ), требует иммунизации пептидом МОГ, эмульгированным в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем инактивированную Mycobacterium tuberculosis. Антигенные компоненты микобактерий активируют дендритные клетки, чтобы стимулировать Т-клетки к продуцированию цитокинов, которые способствуют ответу Th1 через толл-подобные рецепторы. Таким образом, количество и виды микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова, напрямую связаны с развитием ЭАЭ. В этой статье представлен альтернативный протокол для индукции EAE у мышей C57BL / 6 с использованием модифицированного неполного адъюванта Фройнда, содержащего убитый теплом штамм паратуберкулеза подвида Mycobacterium avium K-10.

M. paratuberculosis, член комплекса Mycobacterium avium, является возбудителем болезни Йоне у жвачных животных и был идентифицирован как фактор риска нескольких заболеваний, опосредованных Т-клетками человека, включая рассеянный склероз. В целом, мыши, иммунизированные Mycobacterium paratuberculosis, показали более раннее начало и большую тяжесть заболевания, чем мыши, иммунизированные CFA, содержащим штамм M. tuberculosis H37Ra в тех же дозах 4 мг / мл. Антигенные детерминанты штамма К-10 подвида Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) смогли индуцировать сильный клеточный ответ Th1 во время эффекторной фазы, характеризующейся значительно большим количеством Т-лимфоцитов (CD4+ CD27+), дендритных клеток (CD11c+ I-A/I-E+) и моноцитов (CD11b+ CD115+) в селезенке по сравнению с мышами, иммунизированными CFA. Кроме того, пролиферативный ответ Т-клеток на пептид MOG, по-видимому, был самым высоким у мышей, иммунизированных M. paratuberculosis. Использование энцефалитогена (например, MOG35-55), эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis в составе, может быть альтернативным и валидированным методом активации дендритных клеток для праймирования миелиновых эпитоп-специфических CD4+ Т-клеток во время индукционной фазы EAE.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является общей моделью для изучения демиелинизирующих расстройств человека1. Существует несколько моделей ЭАЭ: активная иммунизация с использованием различных пептидов миелина в сочетании с сильнодействующими адъювантами, пассивная иммунизация путем переноса in vitro миелин-специфических CD4+ лимфоцитов и трансгенные модели спонтанного ЭАЭ2. Каждая из этих моделей имеет специфические особенности, которые позволяют изучать различные аспекты ЭАЭ, такие как начало, эффекторная фаза или хроническая фаза. Модель гликопротеина миелиновых олигодендроцитов (MOG) EAE является хорошей моделью для изучения иммуноопосредованных механизмов хронического нейровоспаления и демиелинизации, поскольку она характеризуется мононуклеарной воспалительной инфильтрацией, демиелинизацией периферического белого вещества и снижением выздоровления после пика заболевания1.

MOG-EAE индуцируется иммунизацией восприимчивых мышей пептидом MOG35-55 в полном адъюванте Фройнда (CFA) с последующей внутрибрюшинной инъекцией коклюшного токсина. Это увеличивает проницаемость гематоэнцефалического барьера и позволяет миелиноспецифическим Т-клеткам, активированным на периферии, достигать центральной нервной системы (ЦНС), где они будут реактивированы3. CFA играет ключевую роль в индукции EAE, усиливая поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками и экспрессию цитокинов, связанных с гуморальными и клеточно-опосредованными ответами4. Этот механизм в основном обусловлен присутствием убитой Mycobacterium tuberculosis , эмульгированной в масле, компоненты которой обеспечивают сильный стимул для иммунной системы5. Фактически, индукция ЭАЭ напрямую связана с количеством микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова6.

Добавление других убитых микобактерий, таких как Mycobacterium butyricum, к неполному адъюванту7 Фройнда, а также эффект комбинаций адъювантов8 могут модулировать клиническое течение ЭАЭ и, следовательно, влиять на воспроизводимость результатов. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), этиологический агент болезни Йоне у жвачных животных, был связан с воспалительными заболеваниями ЦНС 9 человека, поскольку его антигенные компоненты способны вызывать сильный гуморальный и клеточный ответ у пациентов с рассеянным склерозом и нейромиелитом зрительного нерва9. Таким образом, в этом протоколе мы показываем альтернативный и воспроизводимый метод индуцирования MOG-EAE путем замены M. tuberculosis в CFA на M. paratuberculosis.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Хунтендо (номер одобрения 290238) и проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по экспериментам на животных.

1. Общие замечания к эксперименту

  1. Размещайте мышей в отдельных клетках на животноводческом предприятии в контролируемых условиях, свободных от патогенов, при температуре 23 °C ± 2 °C при влажности 50% ± 10% и 12-часовом цикле свет/темнота с свободным доступом к пище и воде.
  2. Вводите мышам фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) без антигена и CFA и используйте их в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно.

2. Получение микобактериальных антигенов

  1. Выращивают штамм M. paratuberculosis K-10 в жидкой среде Миддлбрука 7H9, обогащенной 10% OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза), 0,005% Tween 80 и 2 мг/л микобактина J в течение 2 недель в колбах для культивирования тканей T25 при 37 °C. Регулярно оценивайте рост колонии путем визуального осмотра.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с M. paratuberculosis в учреждении уровня биобезопасности 2 (BSL-2).
  2. Выращивают обогащенную культуру 500 мл колбы Эрленмейера с суспензией 1,7 × 10,5 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл в конечном объеме 200 мл (та же среда, что и на этапе 2.1) в встряхивающем инкубаторе в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку загрязняющие организмы могут повлиять на результаты, бактерии должны быть инокулированы на твердую среду Middlebrook 7H10 для определения морфологии колоний и проверки чистоты с помощью обычных наборов для обнаружения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для M. paratuberculosis.
  3. Инактивировать бактериальные суспензии в течение 5-10 мин при 70 °С и центрифуге при 3000 × г в течение 10 мин. Промыли взвешенные гранулы в PBS дважды, разрушили ультразвуком и хранили при -20 °C.
  4. Переложите гранулу в стерильный контейнер и заморозьте ее сухим льдом или жидким азотом. Немедленно переложите в камеру сублимационной сушки.
  5. Сублимационная сушка (4 ч при -50 °C в вакууме) M. paratuberculosis в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
  6. По окончании лиофилизации извлеките контейнер из нержавеющей стали из сублимационной сушилки и перенесите его на стол для биоочистки. Используйте шпатель из нержавеющей стали, чтобы удалить высохшие комки MAP, прилипшие к внутренней стенке контейнера из нержавеющей стали, и измельчить их как можно мельче.
  7. Взвесьте измельченные клетки с помощью электронных весов и вручную поместите их в асептический флакон объемом 10 мл в концентрации 10 мг / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток была количественно определена в граммах сухого веса на литр образца. Через 3 недели 1 мг (сырой вес) гранулы бактериальных клеток содержит примерно 2,5 × 108 КОЕ.

3. Приготовление эмульсии MOG 35-55

  1. Содержимое одного флакона высушенного M. paratuberculosis (10 мг) измельчить в мелкий порошок с помощью ступки и пестика и добавить 10 мл к неполному адъюванту Фройнда для получения исходного раствора 10 мг/мл. Хранить при температуре -4 °C.
  2. Перед иммунизацией разбавьте исходный раствор до конечной концентрации 4 мг/мл.
  3. Разбавьте пептид MOG35-55 в ddH 2 O до конечной концентрации2мг/мл и храните при -20 °C.
  4. Используя гомогенизатор, смешайте раствор MOG35-55 (2 мг/мл) с равным объемом адъюванта (4 мг/мл) со стадии 3.2 в пробирке объемом 5 мл до образования густой эмульсии. После каждых 10 секунд смешивания поместите раствор на лед на 20 секунд и вращайте трубку, чтобы восстановить весь раствор.
  5. Перелейте эмульсию в шприц объемом 1 мл, удалите весь воздух и добавьте иглу 27 г. Теперь эмульсия готова к инъекциям.
    ЗАМЕТКА. Поскольку во время приготовления происходит некоторая потеря вязкой эмульсии MOG35-55 , лучше всего приготовить в 1,5 раза больше необходимого количества.

4. Иммунизация животных

  1. Обезболивайте животных ингаляцией изофлурана, чтобы свести к минимуму стресс для животных.
  2. Введите эмульсию (200 мкл, содержащую 200 мкг/мышь MOG35-55) подкожно в нижнюю часть спины.
  3. Вводят дозу коклюшного токсина (100 мкл, содержащий 200 нг/мышь) внутрибрюшинно на 0-й и 2-й дни после иммунизации.
    ВНИМАНИЕ: Коклюшный токсин оказывает множественное супрессивное действие на иммунную систему; Избегайте проглатывания и контакта с глазами и кожей.

5. Клиническая оценка

  1. Ежедневно контролируйте мышей на предмет веса и клинических признаков. Используйте следующую систему подсчета баллов: 0 = отсутствие клинических признаков; 1 = вялый хвост; 2 = нарушение выпрямляющего рефлекса и слабость задних конечностей; 3 = полный паралич задних конечностей; 4 = полный паралич задних конечностей с частичным параличом передних конечностей; 5 = умирающий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При первичном наблюдении клинических признаков животным предоставляется расширенный доступ к воде и пище. Чау-чау грызунов размягчают и увлажняют, затем помещают на пол клетки из бункера для корма. В случае обезвоженных животных вводят добавки подкожной жидкости или дают суспензию для грызунов через ротовой зонд. Если мышь нуждается в таком виде помощи более 3 дней, будет проведена эвтаназия.
  2. Чтобы избежать или свести к минимуму боль и страдания животных, используйте следующие конечные точки человека: потеря массы тела более чем на 20%, клинический балл ≥4,0, отсутствие рефлекса выпрямления при балле 3 и когда животное не может получить доступ к корму или воде в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были усыплены на 30-й день после индукции EAE внутрибрюшинными инъекциями пентобарбитала (≥150 мг / кг).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Группы мышей C57BL/6 (всего n = 15/группа) иммунизировали MOG35-55 в эмульсии, содержащей M. paratuberculosis, или обычным методом с CFA. Во всех группах мышей проявлялось острое монофазное заболевание, характеризующееся единичным пиком инвалидности, наблюдаемым через 14-17 дней, с последующим частичным восстановлением симптомов в течение следующих 10 дней (рис. 1А). Мыши, иммунизированные адъювантом, содержащим M. paratuberculosis

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы продемонстрировали надежный альтернативный протокол для активной индукции тяжелой ЭАЭ у мышей C57BL/6J с использованием пептида MOG35-55 , эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis10. Индукция ЭАЭ этим методом привела к более тяжелому заболеванию, чем то, которое индуцировано общим протоколом с CFA. Это различие может быть связано с различными липидными компонентами в клеточной стенке микобактерий11. Фактически, в отличие от других ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа получила поддержку за счет гранта Японского общества содействия науке (грант No JP 23K14675).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
антитело против мыши CD115Biolegend, США135505для цитофлуориметрии 1:1 000
антитело против мыши CD11bBiolegend, США101215для цитофлуориметрии 1:1 000
антитело против мыши CD11c Biolegend, США117313для цитофлуориметрии 1:1 000
антитело против мыши CD16/32  антителоBiolegend, США101302для цитофлуориметрия 1:1,000
антитело против мыши CD4 Biolegend,США 116004для цитофлуориметрии 1:1,000
антитело против мыши CD8a  Biolegend, США100753для цитофлуориметрии 1:1,000
антитело против мыши I-A/I-E Biolegend, США107635для цитофлуориметрии 1:1,000
антитело против мыши Ly-6C Biolegend, США128023для цитофлуориметрии 1:1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, СШАBD 211886для выделения и культивирования микобактерий
C57BL/6J мышейCharles River Laboratory, Япония3 недели, самцы и самки
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, США42F9155Kдля клеточной культуры, теплые при температуре 37 °°; C перед использованием
сублимационной сушилкиEyela, Токио, ЯпонияFDU-1200для лиофилизации бактерий
неполная e Freund' s адъювантDifco Laboratories, MD, США263810для использования в адъюванте
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, США90003-876помогает в росте микобактерий
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, СШАBAA-968бактерий бычьего происхождения
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, DesiccatedBD Biosciences, США743-26880-EAдля использования в адъюванте
Mycobactin JAllied Laboratory, MO, СШАстимулятор роста
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec, СШАAS-60130-10энцефалотигенный пептид
овальбумин (257-264)Sigma-Aldrich, СШАS7951-1MGотрицательный контрольный антиген  для пролиферативного анализа
раствор коклюшного токсинаFujifilm Wako, Осака Япония168-22471Из грамотрицательных бактерий Bordetella pertussi, повышает проницаемость гематоэнцефалического барьера
Гомогенизатор Polytron PT 3100Kinematicaдля смешивания антигена с адъювантом
RPMI 1640 с L-глутаминомGibco Life Techologies, США 11875093Для клеточной культуры
тимидин, [Methyl-3H], в 2% этаноле, 1 мКиPerkinElmer, Waltham, MA, СШАNET027W001MCдля пролиферативного анализа, используйте (1 μ Ci/well)
Зомби NIR Фиксируемый набор жизнеспособностиBiolegend, США423105  цитофлуориметрия, для жизнеспособности клеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MOGTh1T

Похожие статьи