Скрининг ионных каналов в раковых клетках

Мембранные транспортные белки имеют решающее значение для коммуникации между клетками, а также для поддержания клеточного гомеостаза. Среди мембранных транспортных белков ионные каналы служат для стимулирования роста и развития клеток, а также для поддержания состояния клеток в сложных и изменяющихся условиях. Кроме того, сообщалось, что ионные каналы стимулируют и поддерживают развитие солидных опухолей как системно, так и в центральной нервной системе (ЦНС)^1,2. Например, каналы KCa3.1 отвечают за регулирование мембранного потенциала и контроль объема клеток, что важно для регуляции клеточного цикла. Сообщалось, что дефектные каналы KCa3.1 способствуют аномальной пролиферации опухолевых клеток³. Кроме того, ионные каналы могут способствовать метастатической диссеминации рака. Каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP), например, участвуют в притоке Ca2+ и^Mg2+; Этот приток активирует несколько киназ и белков теплового шока, которые функционируют для регуляции внеклеточного матрикса, окружающего опухоль, что, в свою очередь, важно для инициирования метастазирования рака⁴.

Поскольку ионные каналы могут способствовать развитию рака, они также могут быть мишенями для медикаментозного лечения рака. Например, резистентность к методам лечения, включая химиотерапию и новую иммунотерапию, связана с дисрегуляцией функции ионных каналов ^5,6,7. Кроме того, ионные каналы становятся важными мишенями для лекарств, препятствующих росту и развитию рака, при этом исследуются перепрофилированные низкомолекулярные препараты (одобренные FDA), а также биополимеры, включая моноклональные антитела 1,2,8,9. Несмотря на значительный прогресс на этом фронте, разработка лекарств от рака ионных каналов остается недостаточно разработанной. Отчасти это связано с уникальными проблемами изучения ионных каналов в раковых клетках. Например, существуют технические ограничения в настройке электрофизиологических анализов для медленно действующих соединений и временные различия в активации каналов и действии лекарств. Кроме того, растворимость соединений также может препятствовать прогрессу, поскольку большинство автоматизированных электрофизиологических систем, широко используемых сегодня, используют гидрофобные субстраты, которые могут способствовать возникновению артефактов в результате адсорбции соединений. Кроме того, крупные биоорганические молекулярные терапевтические средства, такие как натуральные продукты, пептиды и моноклональные антитела, технически сложны для скрининга с помощью традиционных электрофизиологических анализов¹⁰. Наконец, биоэлектрические свойства раковых клеток остаются^{малоизученными}.

Между тем, иммунофлуоресцентное окрашивание ионных каналов часто является сложной задачей. Отчасти это связано со сложностью их структур и контекстом в мембране, которые влияют на способность генерировать и использовать антитела для микроскопических исследований. Особенно важно, чтобы антитела, используемые для окрашивания ионных каналов, были проверены на специфичность, сродство и воспроизводимость. Коммерческие антитела к ионным каналам следует рассматривать на основе стратегии валидации и публикаций. Эксперименты должны включать отрицательный контроль, чтобы продемонстрировать отсутствие неспецифического связывания путем нокдауна или нокаута белка-мишени. В качестве альтернативы, клеточные линии, в которых целевой белок отсутствует или находится в низком количестве, основанные на определении мРНК или белка, могут служить отрицательным контролем. Например, это исследование показывает локализацию субъединицы рецептора (ГАМК) Gabra5 в клеточной линии медуллобластомы (D283). Клетки D283 с нокдауном миРНК и клетки Daoy, еще одна клеточная линия мозжечковой медуллобластомы, были окрашены на Gabra5 и не показали заметного окрашивания (данные не показаны).

Представлены методы анализа и анализа функции ионных каналов, а также влияния модуляторов ионных каналов на раковые клетки. Предусмотрены протоколы для (1) окрашивания клеток для ионного канала, (2) тестирования поляризованного состояния митохондрий, (3) установления функции ионных каналов с помощью электрофизиологии и (4) валидации лекарств in vitro. В этих протоколах особое внимание уделяется исследованиям рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК_А) типа А 2,12,13,14,15,16^, хлорид-анионного канала и главного тормозного рецептора нейротрансмиттера. Однако методы, представленные здесь, применимы и к изучению многих других раковых клеток и ионных каналов.

1. Иммуномечение ионных каналов в культивируемых клетках

1. Подготовка клеток и экспериментальная установка
   1. Поддерживают клетки как активно растущую культуру в культуральных колбах по 75^см2 . Проходите клетки один раз, пока они не станут сливающимися на 50%-90%, в зависимости от времени удвоения используемой клеточной линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались клетки D283, клеточная линия медуллобластомы 3-й группы.
   2. Соберите клетки из колбы для культивирования в центрифужную пробирку (15 мл или 50 мл) и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить адгезивные клетки. Выдерживать 5 мин при комнатной температуре (RT). Через 5 минут постучите по колбе три-пять раз, чтобы отсоединить ячейки. Соберите клетки в 10 мл среды с 10% FBS, чтобы остановить действие трипсина.
   3. Центрифуга при 480 x g в течение 5 мин при RT. Осторожно аспирируйте среду. Не тревожьте клеточную гранулу.
   4. Ресуспендируйте клетки в 5–10 мл среды, в зависимости от плотности культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность должна соответствовать активно растущим клеткам и зависит от слияния клеток в колбе. Визуальная оценка должна использоваться для приближения оптимальной плотности клеток; В частности, ячейки должны быть на 40-90% сливаться и равномерно распределяться.
   5. Удалите 100 мкл клеток и добавьте в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 100 мкл 0,4% трипанового синего, чтобы пометить нежизнеспособные клетки. Инкубировать 5-15 мин при RT, в зависимости от клеточной линии.
   6. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра (см. таблицу материалов) в 10 мкл раствора. Подсчитайте живые, неокрашенные клетки в каждом из четырех углов 16 квадратов гемоцитометра. Умножьте среднее количество клеток на коэффициент разведения и на 10 000 получите количество клеток на миллилитр (клеток/мл). В качестве альтернативы можно использовать автоматический счетчик ячеек.
   7. Разбавляют клетки до 1 x 10⁵ клеток/мл в питательной среде, указанной для каждой клеточной линии. Посев 1. По 8 мл клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего покровное стекло размером 22 мм x 22 мм, предварительно покрытое поли-D-лизином 0,1 мг/мл в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, кто-то захочет протестировать использование как поли-D-лизина, так и поли-L-лизина, поскольку есть сообщения о предпочтениях, специфичных для клеточных линий^17,18. Некоторые клеточные линии содержат протеазы, которые могут расщеплять поли-L-лизин, в то время как есть сообщения о том, что поли-D-лизин токсичен для некоторых клеточных линий. Напротив, нейрональные клетки, такие как PC12, более здоровы на поли-D-лизиновых поверхностях.
   8. Выращивайте клетки в инкубаторе с увлажненной средой 5%_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы клетки могли прикрепиться к покровному стеклу. Исследуйте прикрепление клеток под инвертированным микроскопом с 20-кратным объективом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть полностью прикреплены к покровному стеклу перед лечением или прямым иммуноокрашиванием. В это время клетки могут быть обработаны лекарственными препаратами (или контролем транспортных средств) путем добавления концентрированного исходного материала (например, 600 мкл 4-кратного исходного раствора) или замены среды свежей средой, содержащей препарат в желаемой 1-кратной концентрации; Затем клетки могут быть возвращены в инкубатор еще на 48 часов. Клетки, обработанные растворителем, включаются для оценки влияния препарата на уровень и локализацию молекулы-мишени. В настоящем исследовании клетки D283 обрабатывали 600 мкл 3,2 мкМ раствора ГАМК-рецептор-положительного аллостерического модулятора QH-II-066¹⁴ (см. таблицу материалов) в течение 48 ч. Контрольные клетки обрабатывали эквивалентным объемом ДМСО.
2. Подготовка к иммуномечению: фиксация, пермеабилизация и блокирование
   1. Промойте ячейки 2,5 мл 1x PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ_Na2HPO 4, 2 мМ KH₂PO₄, см. таблицу материалов) и немедленно аспирируйте раствор.
   2. Фиксируют клетки с помощью 1 мл 4% PFA в 1x PBS в течение 1 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 4% PFA является стандартным фиксатором для иммуноокрашивания, глутаровый альдегид или глиоксаль также могут быть использованы для фиксации мембранных белков для иммунофлуоресценции. Методы фиксации на основе спирта, такие как обработка ледяным метанолом, могут привести к менее хорошо сохранившейся морфологии и потере мембранных белков^19,20.
   3. Вымойте шесть раз 2,0 мл 1x PBS (5 минут на стирку) путем перемешивания на шейкере. Инкубируют в течение 1 ч при ЛТ в блокирующем буфере, состоящем из 1x PBS с 0,8% Triton X-100 и 10% нормальной сыворотки, соответствующей виду хозяина первичного антитела (в качестве альтернативы вместо нормальной сыворотки можно использовать 3% BSA или бычий сывороточный альбумин с фракцией V).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг используется для блокировки неспецифической привязки.
3. Иммуномаркировка
   ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления антител, конъюгированных с флуорофорами, необходимо в ближайшее время провести измерения, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Инкубации с конъюгированными антителами необходимо защищать от света. Использование монтажной среды, содержащей вещества, поглощающие свободные радикалы, уменьшит фотообесцвечивание. Храните предметные стекла в светонепроницаемом непрозрачном контейнере (при температуре 4 °C) после запечатывания покровных стекол. При визуализации фотообесцвечивание можно свести к минимуму, ограничив интенсивность возбуждающего освещения и время экспозиции.
   1. Подготовьте камеру для увлажнения, застелив дно чашки для культуры диаметром 150 мм фильтровальной бумагой. Смочите фильтровальную бумагу стерильной дистиллированной водой. Нарисуйте сетку размером 3 x 2 на куске лабораторной пленки, вырезанном поверх фильтровальной бумаги, и пометьте ее, чтобы сохранить ориентацию покровных стеблей в 6-луночной пластине. Положите лабораторную пленку поверх фильтровальной бумаги, обнажив верхний и нижний края, чтобы увлажнить камеру.
   2. Приготовьте 100 мкл на покровное стекло желаемого разведения первичного антитела в 1x PBS с 3% BSA. Для обнаружения белкового продукта гена ГАМРА используют рекомбинантное моноклональное первичное антитело кролика в разведении 1:200 (антитело Gabra5, средняя область; см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы эмпирически определить концентрацию первичных антител, которая производит оптимальный сигнал на фоне, используйте серию разведения первичного антитела, сохраняя вторичную концентрацию постоянной. Для установления оптимальных концентраций первичных антител рекомендуются разведения 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 и 1:1000.
   3. Перенесите покровное стекло из блочного раствора в 6-луночном планшете в надлежащее место на сетке, нарисованной на лабораторной пленке. Слейте раствор блока с 6-луночной пластины и оставьте пластину для этапов промывки.
   4. Осторожно добавьте 100 мкл разбавленного первичного антитела в центр каждого покровного стекла. Не наносите раствор на край покровного стекла. Инкубируют в течение 1 часа при РТ.
   5. Добавьте 2,5 мл 1x PBS в каждую лунку 6-луночного планшета. Переместите покровный стекло обратно в соответствующее место на 6-луночной пластине.
   6. Выполните шесть стирок по 5 минут каждая с 2,5 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания покровных стеблей во время ополаскивания, так как это может способствовать фоновому сигналу флуоресценции.
   7. Верните покровные листы в надлежащее место на лабораторной пленке. Для каждого покровного стекла добавьте 100 мкл вторичного антитела, разведенного в 1x PBS + 1%-5% BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (см. таблицу материалов), используются в разведении 1:1000 в 1x PBS + 3% BSA. Концентрация вторичных антител может быть оптимизирована путем увеличения концентрации для обнаружения белков-мишеней с низкой распространенностью или уменьшения концентрации для снижения фона, если это необходимо.
   8. На остальных этапах минимизируйте воздействие света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание конъюгированного вторичного антитела. Накройте культуральную чашку алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение 1 ч при РТ.
   9. Перенесите покровные стекла обратно на 6-луночную пластину. Используя шейкер, выполните шесть стирок по 5 минут каждая с 2,5 мл 1x PBS. Снимите PBS, перевернув пластину над раковиной или контейнером для слива. После последней промывки оставьте PBS в колодце, чтобы облегчить удаление покровного стекла.
   10. Подпишите предметное стекло микроскопа для каждого покровного стекла. Добавьте каплю глицеринсодержащей монтажной среды с DAPI (для окрашивания ядер) (см. Таблицу материалов) в центр предметного стекла.
   11. С помощью щипцов извлеките покровное стекло из колодца и аккуратно поместите его на каплю монтажной среды в центре предметного стекла.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха в монтажной среде.
   12. Используйте небольшие кусочки фильтровальной бумаги, чтобы удалить излишки монтажного материала. Запечатайте края покровного стекла лаком для ногтей и дайте лаку полностью высохнуть, прежде чем делать снимки. Храните предметные стекла при температуре 4 °C в непрозрачной пластиковой коробке.
4. Визуализация и анализ
   1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа под 40-кратным объективом с иммерсионным маслом (см. таблицу материалов).
   2. Визуализируйте флуоресцентные изображения с помощью соответствующих фильтров.
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: Для Alexa Fluor 488 используйте возбуждение/излучение 496 нм/519 нм; для DAPI используйте возбуждение/излучение 358 нм/461 нм.
   4. Захват и сохранение файлов цифровых изображений. Значение биннинга 4 x 4 используется для увеличения скорости сбора изображений и уменьшения фона.
   5. Подготовьте окончательные изображения. Изображения могут быть обработаны с помощью ImageJ или коммерчески доступного программного обеспечения. Результаты проиллюстрированы на рисунке 1.

2. Тестирование поляризованного состояния митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется анализ TMRE (тетраметилродамин, этиловый эфир) для мечения мембранного потенциала в активных митохондриях, поддерживая отрицательный заряд^21,22. TMRE представляет собой проницаемый для клеток, красно-оранжевый, положительно заряженный краситель, накапливающийся в активных митохондриях из-за их относительного отрицательного заряда. Неактивные или деполяризованные митохондрии имеют пониженный мембранный потенциал и не могут пропорционально секвестрировать TMRE. FCCP (карбонильцианид 4-[трифторметокси] фенилгидразон), ионофорный разъединитель окислительного фосфорилирования (OXPHOS), деполяризует митохондриальные мембраны, тем самым предотвращая накопление и секвестрацию TMRE²³. Это проиллюстрировано на рисунке 2.

1. Подготовка клеток и экспериментальная установка
   1. Выдерживают клетки в 75 см² колбы для культивирования. Аспирируйте питательную среду и промойте клетки 1x PBS без кальция и магния.
   2. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить адгезивные клетки. Инкубируют в течение 5 мин при РТ и ресуспендируют клетки в 10 мл среды.
   3. Соберите клетки из колбы для культивирования в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 480 x g в течение 5 мин при RT. Аспирируйте среду.
   4. Ресуспендируйте клетки в 5-10 мл среды, в зависимости от исходного слияния культуры, так, чтобы концентрация клеток составляла 50-100 клеток на квадрат на гемоцитометре. При необходимости отрегулируйте объем, чтобы обеспечить необходимую плотность ячеек для точного подсчета.
   5. Удалите 100 мкл клеток и добавьте в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 100 мкл 0,4% трипанового синего. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Разбавляют клетки до 3 x 10⁴ клеток/мл в питательной среде без фенолового красного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используется среда DMEM, в которой отсутствует феноловый краситель, потому что воздействие фенолового красного ингибирует проницаемость мембраны и может способствовать фоновой автофлуоресценции.
   6. Высейте 2,5 мл клеточной суспензии (75 000 клеток) на лунку в 6-луночную пластину, содержащую покровное стекло размером 22 x 22 мм, предварительно покрытое поли-D-лизином в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
   7. Выращивайте клетки в инкубаторе с увлажненным 5%_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы клетки могли прикрепиться к покровному стеклу.
   8. Исследуйте прикрепление клеток под инвертированным микроскопом с 20-кратным объективом. Ячейки должны быть полностью прикреплены к покровному листу, прежде чем двигаться дальше.
2. Приготовление исходных растворов
   1. Для приготовления исходного раствора TMRE объемом 1 мМ (1000x) (MW = 514,96 г/моль) (см. таблицу материалов) растворяют 1 мг TMRE в 1,94 мл ДМСО. Аликвотировать и хранить при температуре −20 °C в защищенном от света месте. Избегайте повторяющихся циклов замораживания/оттаивания.
   2. Для приготовления 50 мМ (2500x) исходного раствора FCCP (MW = 254,17 г/моль) (митохондриальный окислительный развязыватель фосфорилирования) растворяют 10 мг FCCP в 786,9 мкл ДМСО. Аликвотировать и хранить при температуре −20 °C в защищенном от света месте. Избегайте повторяющихся циклов замораживания/оттаивания.
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленные исходные растворы входят в состав набора для анализа потенциала митохондриальной мембраны TMRE (см. таблицу материалов).
3. Определение концентрации TMRE для клеточных линий
   1. Приготовьте рабочий раствор TMRE 500 нМ в питательной среде клеток. Рабочий раствор беречь от света.
   2. Добавляйте TMRE к клеткам, выращенным на покровных стеклах в диапазоне от 50 до 200 нМ. Для этого сначала аспирируют питательную среду и заменяют ее питательной средой, содержащей TMRE.
   3. Инкубировать 20 мин при 37 °C. Убедитесь, что время лечения распределено, чтобы дать возможность визуализации, так как клетки просматриваются в режиме реального времени.
   4. Промойте клетки дважды с помощью 1x PBS и переверните покровное стекло на предметном стекле микроскопа, помеченное конечной концентрацией TMRE.
   5. Сразу же визуализируйте живые клетки (пик E_x/E_m = 549 нм/575 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно визуализируйте образцы после извлечения из условий культивирования, так как здоровье митохондрий находится под угрозой, как только клетки извлекаются из среды и помещаются на предметное стекло микроскопа. В качестве альтернативы покровным стеклам ячейки могут быть изображены в чашках со стеклянным дном.
   6. Получение изображений с помощью имеющегося микроскопа и программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры визуализации экспериментальной микроскопии в процессе оптимизации концентрации TMRE и поддерживайте те же условия в последующих экспериментах, чтобы обеспечить точное сравнение данных. В протоколе подробно использовался конфокальный микроскоп и совместимое программное обеспечение (см. таблицу материалов).
   7. Выберите оптимальную концентрацию TMRE, которая зависит от клеточной линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация TMRE, которая обеспечивает наилучший сигнал для разрешения изменений в митохондриальных уровнях TMRE, как правило, является самой низкой концентрацией TMRE, давая равномерный и легко обнаруживаемый флуоресцентный сигнал.
4. Проверка поляризованного состояния клетки
   1. Подготовка к анализу
      1. Приготовьте исходные растворы для обработки в требуемых концентрациях и подготовьте среду с конечной концентрацией соединения для анализа. Для FCCP исходный раствор должен составлять 20 мМ (приготовленный с ДМСО из 50 мМ исходного раствора).
      2. Работая с одним покровным стеклом за раз, добавьте к клеткам 1,8 мл среды плюс испытуемое соединение.
      3. Инкубируют клетки с исследуемым составом при 37 °C и 5%_CO2 во влажной среде в течение желаемого периода времени.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки будет варьироваться в зависимости от механизма, с помощью которого исследуемое соединение может изменять мембранный потенциал митохондрий. Мощные протонофоры, такие как FCCP, которые быстро и непосредственно деполяризуют мембранные потенциалы митохондрий, требуют анализа вскоре после лечения (в течение нескольких минут). В отличие от этого, эффекты лечения соединениями, которые косвенно влияют на функцию митохондриальной цепи переноса электронов, например, те, которые изменяют активацию белка или обмен белка или требуют синтеза белка, могут занять больше времени, чтобы проявить эффект.
      4. Во время инкубации включите микроскоп и настройте его на заданные оптимальные параметры визуализации, в том числе по усилению, интенсивности лазера, скорости захвата изображения, усреднению и времени экспозиции.
      5. После периода лечения препаратом добавьте 200 мкл 10-кратного TMRE (оптимальная концентрация, определенная выше) к контрольным и обработанным лекарственными препаратами клеткам.
      6. Инкубируют 15-30 мин при 37 °С в 5%_СО2 во влажной среде. Осторожно аспирируйте среду и промойте клетки один раз с помощью 1x PBS.
      7. Повторите 1x этап промывки PBS, чтобы избежать фона, вызванного средой для клеточной культуры или лечебными соединениями, и переверните покровное стекло на предметном стекле микроскопа, помеченном условиями обработки.
      8. Изображение клеток живет при E_x/E_m = 549 нм/575 нм. Используя конфокальный микроскоп, соберите несколько полей z-стека с высокоскоростным захватом изображения (512 пикселей x 512 пикселей, усреднение = 4) до потери целостности клетки.
      9. Сохраните и сохраните файл изображения для анализа. Процедуру повторяют для следующего экспериментального условия.
   2. Экспериментальный контроль
      1. Используйте контроль без обработки (отрицательный), выполненный, как описано выше (шаги 3.1.1-3.1.8), при отсутствии испытуемого соединения в среде.
      2. Используют контроль потенциала разрушения митохондриальной мембраны (положительный), состоящий из протонофорного соединения FCCP. Добавьте 1,8 мл 20 мкМ FCCP (см. таблицу материалов) в среду к ячейкам. Как описано выше (этапы 3.1.1-3.1.2; и визуализация клеток, как описано в шагах 3.1.3-3.1.8), инкубируют в течение 10 мин при 37 °C в 5 %_CO2 во влажной среде перед окрашиванием TMRE.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов требуется как положительный, так и отрицательный контроль.
   3. Квантификация
      1. Измерение интенсивности пикселей отдельных ячеек по одному репрезентативному изображению из центральной области каждого z-стека. В этой работе была выбрана единая плоскость фокусировки для облегчения анализа.
      2. Анализируйте интенсивность пикселей не менее 30 клеток (в целом) за одну обработку. Используйте Excel или Prism для усреднения интенсивности пикселей для каждой обработки и представьте их в формате гистограммы со стандартной ошибкой среднего значения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ также можно использовать для количественной оценки флуоресценции. Кроме того, флуоресценция окрашивания TMRE может быть количественно определена с помощью коммерческих программных платформ.

3. Установление функции ионных каналов с помощью электрофизиологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, описанная в этом разделе, описывает использование автоматизированного электрофизиологического анализа для скринингового тестирования соединений в линии раковых клеток (рис. 3).

1. Подготовка клеток
   1. Соберите клетки из здоровой культуры, в которой отсутствуют мертвые клетки и/или избыточный рост клеток. Используйте либо химический раствор для отслоения клеток TrypLE, либо ручной скребок для сбора адгезивных и кластеризованных клеток. Диссоциируют клетки, которые растут в скоплениях или сферах, что особенно распространено среди раковых клеток ЦНС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкая диссоциация клеток помогает поддерживать целостность мембранных белков, необходимых для ионной проводимости.
   2. Центрифугируют клетки при 561 x g в течение 10 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте гранулы в DMEM (без фенолового красного), HEPES и пенициллине/стрептомицине с 20% FBS и 4 мМ L-глутамином (см. таблицу материалов) при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используется среда DMEM, в которой отсутствует феноловый краситель, потому что воздействие фенолового красного ингибирует проницаемость мембраны.
   3. Поместите ячейки на покровное стекло с поли-L-лизиновым покрытием при низкой плотности, чтобы между отдельными ячейками было разделение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется поли-L-лизин, а не поли-D-лизин, так как поли-L-лизин обладает лучшими свойствами покрытия.
   4. Перед записью инкубируют клетки при температуре 37 °C и 5% CO2 в увлажненной камере в течение₁₂ –24 ч (необходимо установить оптимальное время).
2. Электрофизиологическая регистрация
   1. Удалите медиум с покровных стекол. Аккуратно промойте клетки дважды с помощью 1x PBS. Добавьте ~300 мкл раствора TrypLE. С помощью пипетки осторожно поднимайте/опускайте пипетку четыре-пять раз, пока клетки не отделятся.
   2. Добавьте безсывороточную среду (DMEM) (без фенолового красного) и поддерживайте конечное количество клеток на объем не менее 1 миллиона клеток/мл. С помощью пипетки объемом 1 мл очистите клетки, чтобы получить клеточную суспензию без клеточных кластеров.
   3. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1 мл. Инкубируйте клетки при 4 °C в течение 10 мин для стабилизации клеточной мембраны. Держите клетки вращающимися на шейкере (щадящий цикл), чтобы избежать образования клеточных комков.
   4. Подготовьте установку Port-a-Patch (см. Таблицу материалов). Включите компьютер, усилитель и систему перфузии. Откройте программу Patch-Master и создайте новый файл.
   5. Доведите буферы (внеклеточные и внутренние) до ЛТ, а затем загрузите буферы в соответствующие перфузионные пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации рецептора ГАМК_А требуется как «внеклеточный (ванный) раствор», содержащий 161 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,5 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES и 6 мМ D-глюкозы (pH, доведенный до 7,4 с помощью NaOH), так и «внутренний раствор», содержащий 120 мМ KCl, 2 мМ MgCl ₂, 10 мМ EGTA, и 10 мМ HEPES (рН, доведенный до 7,2 с использованием NaOH).
   6. Заполните нижнюю часть электродного чипа (предоставленного производителем) 5 мкл внутреннего раствора и поместите электродную микросхему на верхнюю часть Port-a-Patch. Добавьте в микросхему 10 мкл внешнего раствора и наблюдайте за прямоугольным импульсом на осциллографе с помощью программного обеспечения Patch-Master (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление может быть в диапазоне 2-3 МОм, но это зависит от клеточной линии.
   7. Начинайте запись, как только прямоугольный импульс станет видимым, после первоначальной электронной настройки и после того, как программное обеспечение предложит пользователю добавить ячейки.
   8. Осторожно добавьте 20 мкл одноэлементной суспензии на центральную часть электрода и дождитесь заплатки ячейки, за которой последует гигаомное уплотнение, наблюдая за значениями сопротивления в программном обеспечении.
   9. Ход коммутации ячеек в реальном времени можно наблюдать в левой колонке программного обеспечения. После того, как ячейка будет «поддерживаться в режиме всей ячейки», начните запись, открыв протокол в программном обеспечении.
   10. Установите удерживающий потенциал на −80 мВ. Запустите протокол непрерывной записи без пробелов с помощью программного обеспечения Patch-Master для записи тока из ячейки.
   11. Получите стабильный исходный уровень и переключитесь на применение лиганда и соответствующего соединения на заданное время с помощью вкладки автоматической перфузии на левой панели программного обеспечения.
   12. Получение данных с помощью программного обеспечения Patch-Master.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Данные фильтруются на частоте 1 кГц и оцифровываются на частоте 100 кГц.
   13. Выполните анализ данных, вычислив максимальную амплитуду текущего отклика с помощью программного обеспечения Nest-o-Patch (см. Таблицу материалов).

4. Потенция in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре подробно описывается анализ MTS для определения эффективности препарата. Анализ пролиферации клеток One Solution объединяет все необходимые реагенты для анализа в приготовленный раствор, который может быть добавлен за один шаг в лунки для клеточных культур для оценки жизнеспособности и пролиферации клеток после обработки экспериментальными соединениями. Реагент восстанавливают в соответствии с рекомендациями производителя (см. таблицу материалов), аликвотируют и хранят при температуре −20 °C. В разделе описывается использование анализа для определения IC₅₀ исследуемых соединений в конкретной клеточной линии (рис. 4). Этот реагент MTS также может быть использован для высокопроизводительного скрининга большого количества соединений в известных концентрациях.

1. Подготовка клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток зависит от роста и метаболизма каждой отдельной клеточной линии. Определите оптимальное количество клеток экспериментально, прежде чем использовать анализ для оценки любых исследуемых методов лечения.
   1. Забор адгезивных клеток из культуры путем трипсинизации и использование Аккутазы (см. Таблицу материалов) для диссоциации клеток, которые растут в скоплениях или сферах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии глиобластомы и первичной медуллобластомы часто требуют Аккутазы, поскольку они имеют тенденцию расти в группах или сферах.
   2. Подсчитайте количество клеток и сделайте клеточный раствор с 10 000 клеток на лунку в объеме 75 мкл. Сделайте разведения материала для испытуемых номеров клеток. Приготовьте не менее 1 мл на разведение.
   3. Распределите 75 мкл каждого разведения на наборы из пяти последовательных лунок в 96-луночном планшете. Инкубировать при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи во влажной среде (например, в инкубаторе).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии с медленным ростом или метаболизмом (которые подкисляют свою питательную среду более чем за 3 дня) могут требовать более 10 000 клеток в качестве верхнего диапазона количества клеток, в то время как клеточные линии, которые растут быстро (обычно быстрее, чем 20 часов времени удвоения), требуют меньшего количества клеток. Клеточным линиям с высоким метаболизмом может потребоваться менее 1000 клеток на лунку. Диапазон ячеек может быть скорректирован для определения оптимальной плотности покрытия для анализа MTS для этих клеточных линий.
2. Контроль имитационной обработки
   1. Добавьте 25 мкл среды на лунку, чтобы смоделировать добавление испытуемого соединения в анализе MTS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В фактическом анализе MTS 25 мкл 4-кратного запаса выбранной лечебной концентрации для исследуемого соединения (в данном случае модулятора рецептора ГАМК_А , QH-II-066) будут добавлены к клеткам, чтобы получить 1-кратную концентрацию окончательной обработки в общем объеме 100 мкл на лунку.
   2. Инкубируют при 37 °C и 5 % CO₂ во влажной среде в течение 48 ч. Это имитирует стандартную инкубацию в присутствии препарата.
3. Проба МТС
   1. Разморозьте необходимые аликвоты реагента МТС. Добавьте 20 мкл реагента MTS на лунку. Инкубируют при 37 °C и 5 % CO₂ во влажной среде в течение 1 ч.
   2. Центрифугируйте планшет (1 350 x g в течение 5 мин) при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки, которые могут повлиять на показания абсорбции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите все пузырьки с помощью иглы тонкого калибра.
   3. Считайте поглощение на длине волны 490 нм. Сохраните данные в виде файла Excel.
   4. Верните планшеты до 37 °C при 5% CO₂ и повторите считывание в течение 4 ч линейного диапазона анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости повторно центрифугировать перед считыванием абсорбции. Данные более поздних показаний, особенно показания через 2 часа, могут быть важны для изучения того, насколько быстро клеточная линия метаболизирует реагент MTS, и полезны при выборе количества клеток на планшете для анализа.
   5. Постройте график оптической плотности поглощения (OD) на длине волны 490 нм (OD₄₉₀) в зависимости от номера ячейки с покрытием с помощью Excel или Prism.
   6. Выберите номер ячейки для анализа. Оптимальное количество ячеек будет находиться в линейном диапазоне и ниже насыщения (OD₄₉₀ = 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток с медленным ростом максимальное количество клеток может быть скорректировано до 20 000 клеток на лунку, а 500 клеток на лунку могут быть исключены из анализа.
4. Определение IC₅₀
   1. День 1: Пластинчатые ячейки для анализа МТС
      1. Запишите название клеточной линии и номер прохода каждой строки в исследовании. Чтобы противостоять испарению во время анализа, как минимум, заполните верхний и нижний ряды по внешнему периметру, а также крайние левую и правую колонны по периметру 96-луночного планшета 1x PBS, 100 мкл на лунку, чтобы противостоять испарению во время анализа.
      2. Определите оптимальное количество клеток для каждой клеточной линии, определенное до начала анализа. Поместите клетки в 75 мкл на лунку среды, не содержащей фенолового красителя и антибиотиков, не содержащей буфера HEPES. FBS может быть увеличен до 20% для поддержки роста клеточных линий.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используется среда, в которой отсутствует феноловый краситель, потому что воздействие фенолового красного ингибирует проницаемость мембраны.
      3. Распределите образец по крайней мере в пятикратной концентрации для обработки. Подсчитайте количество клеток с помощью ручного или автоматизированного гемоцитометра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для использования ручного гемоцитометра (1) приготовьте разведение 1:1 клеток, ресуспендированных в среде в трипановом синем; (2) инкубируют 5-15 мин, в зависимости от клеточной линии; (3) загрузить 10 мкл клеток трипанового синего в счетную камеру гемоцитометра; (4) подсчитайте жизнеспособные клетки в четырех углах и средних клетках и определите среднее число клеток в квадрате; (5) Рассчитайте количество жизнеспособных клеток на миллилитр следующим образом:
         Количество жизнеспособных клеток в мл = Среднее количество жизнеспособных клеток × 2 (коэффициент разбавления) × 10⁴
      4. Используйте достаточный объем для приготовления желаемой концентрации клеток в среде, не содержащей фенолового красителя и антибиотиков, которая не содержит буфера HEPES (т.е. 75 мкл на лунку x 60 лунок на планшет = 4,5 мл клеток на планшет).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пластина должна иметь регулятор вычитания фона, предназначенный только для среднего уровня. При необходимости регулятор среды может заменить скважины PBS.
   2. День 2: Добавление лечебного состава
      1. Для получения желаемой конечной концентрации при добавлении 25 мкл лечебных растворов к ячейкам, покрытым 75 мкл среды (= 100 мкл общего объема на лунку).
      2. Тест-растворы (в данном случае модулятор рецептора_{ГАМК А} QH-II-066) готовят путем последовательного разведения запасов с наибольшей концентрацией. Например, если конечные концентрации препарата должны составлять 5,0 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ, 0,625 мкМ и 0,3125 мкМ, то готовят последовательные разведения 1:1, начиная с 20 мкМ, чтобы получить концентрации 10 мкМ, 5 мкМ, 2,5 мкМ и 1,25 мкМ соответственно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пластины требуется два клеточных контроля в дополнение к контролю только среды: необработанные клетки (только среда) и клетки, обработанные растворителем (часто ДМСО) в известной концентрации. Рекомендуется следить за тем, чтобы транспортное средство не влияло на пролиферацию клеток в активном диапазоне действия соединения.
      3. После добавления испытуемого соединения клетки инкубируют при 37 °C и 5%_CO2 во влажной среде в течение 48 ч.
   3. День 3: Проведение анализа на пролиферацию клеток (MTS)
      1. Рассчитайте необходимый объем реагента MTS (20 мкл на 100 мкл испытуемой культуры) и разморозьте необходимый объем аликвотируемого реагента MTS (см. таблицу материалов).
      2. Перед использованием убедитесь, что реагент полностью находится в растворе. Пипетку размороженного реагента в стерильный резервуар для реагента объемом 25 мл.
      3. Пипетку 20 мкл реагента MTS (с помощью многоканальной пипетки) в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего образцы в 100 мкл питательной среды.
      4. Инкубируют планшет при 37 °C и 5%_CO2 во влажной среде от 1 до 4 ч. Пластины могут быть прочитаны в нескольких временных точках. Как правило, пластины считываются через 1 ч и через 2 ч или 3 ч.
      5. Пузырьки в среде могут привести к ошибочным результатам. Перед считыванием показаний в считывателе пластин вращайте пластину при температуре 1 350 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Иглу или наконечник пипетки можно использовать для удаления пузырьков, оставшихся после центрифугирования.
      6. Измерьте поглощение при длине волны 490 нм с помощью подходящего микропланшетного ридера или спектрофотометра (см. таблицу материалов).
      7. Сохраните данные в виде файла Excel.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации в присутствии испытуемого соединения будет варьироваться в зависимости от скорости метаболизма и роста исследуемой клеточной линии, в дополнение к тестируемому соединению. Инкубационный период в 48 ч является хорошей отправной точкой для большинства клеточных линий и исследуемых соединений.
5. Анализ данных
   1. Перенесите данные в файл Excel и систематизируйте данные для каждой репликации, увеличив концентрацию исследуемого соединения. Усредните контрольное значение только для среды и вычтите это значение из экспериментальных данных.
   2. Определите процент пролиферации клеток в лунках для обработки по сравнению с лунками для транспортных средств (или контрольными лунками, обработанными растворителем), установив контроль на 100% пролиферацию для каждой репликации.
   3. Перенесите данные, сгенерированные в Excel, в выбранную программу. Авторы обычно используют программное обеспечение Prism (см. таблицу материалов) для определения концентрации препарата, ингибирующего пролиферацию клеток на 50% (IC₅₀).
   4. В программном обеспечении Prism создайте таблицу данных с X-столбцом в качестве номеров ячеек и Y-столбцом в качестве среднего OD для пяти реплицируемых значений в параллельных подстолбцах.
   5. Введите значения концентрации препарата в столбец X при анализе лекарственного препарата. Обозначьте ось X с указанием названия лечебного состава и единиц концентрации.
   6. Введите вычисленные значения жизнеспособности реплицируемых ячеек из анализа Excel в подстолбцы Y. Обозначьте ось Y как пролиферацию клеток (%).
   7. С помощью инструмента анализа выберите Нелинейная регрессия (подгонка кривой) в разделе Анализ XY.
   8. Выберите зависимость доза-реакция [ингибирование] от нормализованного наклона ответа.
   9. Выполните функцию анализа. Просмотрите таблицу результатов, чтобы увидеть вычисленные значения наилучшего соответствия для IC₅₀ и график аппроксимации кривой. При желании ось X графика может быть изменена на логарифмическую шкалу.

Выше приведены некоторые процедуры, которые могут быть использованы для характеристики ионных каналов в раковых клетках. В первом протоколе особое внимание уделяется окрашиванию ионного канала. Как уже говорилось, при окрашивании ионного канала или, если уж на то пошло, любого белка, присутствующего во внеклеточной мембране, возникает множество проблем. На рисунке 1 показано окрашивание субъединицы пентамерного рецептораГАМК А. Во втором протоколе освещаются результаты тестирования поляризованного состояния митохондрий в раковых клетках. Митохондрии играют важную роль в жизнеспособности и пролиферации клеток, а также в их гибели. В клетках млекопитающих митохондрии активируют апоптоз в ответ на клеточный стресс путем высвобождения белков семейства Bcl-2, находящихся между внутренней и внешней мембранами митохондрий. В цитозоле белки семейства Bcl-2 активируют каспазные протеазы, которые опосредуют запрограммированную гибель клеток. Изменения в функционировании ионных каналов плазматической мембраны могут привести к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза, в том числе с точки зрения уровня ионов в митохондриях, что может привести к потере мембранного потенциала, тем самым запуская апоптоз14. Уровни Ca2+, K+, Na+ и H+ являются важными детерминантами в сигнальных событиях, которые могут вызвать гибель клеток, инициированных митохондриями. На рисунке 2 показано окрашивание проницаемым для клеток положительно заряженным красителем TMRE для мечения и изображения мембранного потенциала в активных митохондриях, которые поддерживают отрицательный заряд21,22. TMRE представляет собой красно-оранжевый краситель, который связывается с активными митохондриями из-за их относительного отрицательного заряда. Деполяризованные или неактивные митохондрии имеют пониженный мембранный потенциал и, таким образом, не могут секвестрировать TMRE. В этом эксперименте ионофорный разъединитель FCCP является важным элементом управления, так как он деполяризует митохондриальные мембраны, тем самым предотвращая накопление TMRE23. В третьем протоколе подчеркивается электрофизиология одноклеточных патч-зажимов. На рисунке 3 показаны репрезентативные записи следа, записанного из клеточной линии D283 медуллобластомы пациента. Наконец, четвертый протокол выделяет анализ для определения состояния пролиферации раковых клеток. На рисунке 4 показана подробная информация о том, как работает анализ MTS, а также иллюстрация планшета и показания при инкубации с агентом, который ухудшает жизнеспособность исследуемых раковых клеток (в данном случае DAOY).

Рисунок 1: Окрашивание клеток для ионных каналов. (A) Окрашивание белка Gabra5, субъединицы рецептора ГАМКА, в раковых клетках медуллобластомы D283. (B) Фиксированные клетки, обработанные флуоресцентным окрашивателем 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), который связывается с ДНК. (C) Слияние раковых клеток медуллобластомы, окрашенных как для Gabra5, так и для DAPI. Масштабные линейки = 10 мкм. Рисунок адаптирован из Kallay et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Тестирование поляризованного состояния митохондрий . (А) Живые клетки медуллобластомы D283 лечат повышенными концентрациями препарата QH-II-066. Затем клетки обрабатывают положительно заряженным, проницаемым для клеток TMRE (тетраметилродамин, этиловый эфир), который накапливается в активных (отрицательно заряженных) митохондриях. Деполяризованные или неактивные митохондрии имеют пониженный мембранный потенциал и, следовательно, не могут удерживать краситель TMRE; В результате они показывают низкий сигнал флуоресценции. Изображение с помощью флуоресцентной микроскопии; FCCP (карбонилцианид 4-[трифторметокси] фенилгидразон). Пик: λex, 549 нм; λem, 575 нм. Масштабные линейки = 10 мкм. (B) Количественная оценка окрашивания TMRE (изображения показаны на панели A) с использованием программной платформы. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения. Рисунок адаптирован из Kallay et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Установление функции ионных каналов с помощью электрофизиологии. (A) На рисунке показана установка или установка Port-a-Patch, состоящая из клетки Фарадея (a), записывающей камеры (b) и аспирационного устройства (c, справа). (B) Вид сверху на установку Port-a-Patch с выделением записывающей камеры, оснащенной перфузионным входом (a), выходом (b) и электродом сравнения (c). (C) Port-a-Patch подключается к системе быстрой перфузии с автоматическим и ручным режимами работы и резервуарами для раствора. (D) Репрезентативная трассировка тока, полученная при регистрации электрофизиологии с цельноклеточным патч-зажимом с использованием установки Port-a-Patch (Nanion) и раковых клеток медуллобластомы D283. ГАМК (10 мкМ) применяли в течение 5 с с удерживающим потенциалом −80 мВ. (E) Репрезентативная трассировка тока при регистрации электрофизиологии цельноклеточного патча с зажимом с использованием установки Port-a-Patch (Nanion) и раковых клеток медуллобластомы D283 с совместным применением ГАМК (1 мкМ) и агониста рецептораГАМК А (общий анестетик) пропофола (50 мкМ), который потенцирует ток, индуцированный только ГАМК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: МТС-анализ для оценки эффективности препарата. (А) Химические реакции, лежащие в основе «МТС-анализа», используемые для оценки эффективности агента, что отражается в снижении пролиферации клеток. Восстановление тетразолия MTS жизнеспособными клетками, генерирующими краситель формазан. (B) 96-луночный планшет, показывающий колориметрические результаты анализа MTS с увеличением концентрации препарата. В этом эксперименте раковые клетки медуллобластомы DAOY обрабатываются возрастающими концентрациями доклинического препарата KRM-II-08, положительного аллостерического модулятора рецептора ГАМКА . (C) Кривая «доза-реакция», полученная с помощью анализа MTS (на основе количественного определения 96-луночного планшета). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение ручных с полуавтоматическими и/или полностью автоматизированными электрофизиологическими установками.

D.A.P.K. является соучредителем, президентом и генеральным директором Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. является соучредителем Amlal Pharmaceuticals Inc. и входит в состав Совета по мониторингу безопасности лекарственных средств Bexion Pharmaceuticals, Inc.