Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов

Summary

Мы разработали межвидовой сравнительный подход к онкогеномике, использующий геномный анализ и функциональный геномный скрининг для выявления и сравнения терапевтических мишеней в опухолях, возникающих на генетически модифицированных мышиных моделях, и соответствующего типа опухоли человека.

Abstract

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (MPNST) происходят из шванновских клеток или их предшественников. У пациентов с синдромом предрасположенности к опухолям нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) МПНТ являются наиболее распространенным злокачественным новообразованием и ведущей причиной смерти. Эти редкие и агрессивные саркомы мягких тканей предлагают суровое будущее, с 5-летней безрецидивной выживаемостью 34-60%. Варианты лечения людей с МПНСТ разочаровывающе ограничены, при этом обезображивающая хирургия является основным вариантом лечения. Многие некогда многообещающие методы лечения, такие как типифарниб, ингибитор передачи сигналов RAS, потерпели клиническую неудачу. Аналогичным образом, клинические испытания II фазы эрлотиниба, который нацелен на эпидермальный фактор роста (EFGR), и сорафениба, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и Raf, в сочетании со стандартной химиотерапией, также не вызвали ответа у пациентов.

В последние годы методы функционального геномного скрининга в сочетании с генетическим профилированием линий раковых клеток доказали свою полезность для выявления основных цитоплазматических сигнальных путей и разработки таргетно-специфической терапии. В случае редких типов опухолей разновидность этого подхода, известная как межвидовая сравнительная онкогеномика, все чаще используется для выявления новых терапевтических мишеней. В межвидовой сравнительной онкогеномике генетическое профилирование и функциональная геномика выполняются на генетически модифицированных мышиных моделях (GEM), а затем результаты подтверждаются на редких человеческих образцах и клеточных линиях, которые доступны.

В данной статье описывается, как идентифицировать гены-кандидаты-драйверы в клетках MPNST человека и мыши с помощью секвенирования всего экзома (WES). Затем мы опишем, как проводить скрининг шРНК на уровне генома для выявления и сравнения критических сигнальных путей в клетках MPNST мыши и человека и идентификации лекарственных мишеней в этих путях. Эти методологии обеспечивают эффективный подход к выявлению новых терапевтических мишеней при различных типах рака человека.

Introduction

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ) представляют собой высокоагрессивные веретеноклеточные новообразования, которые возникают в связи с синдромом восприимчивости к опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1), спорадически в общей популяции и в местах предшествующей лучевой терапии ^1,2,3. Пациенты с НФ1 рождаются с копией гена-супрессора опухолей NF1 дикого типа и вторым аллелем NF1 с мутацией с потерей функции. Это состояние гаплонедостаточности делает пациентов с НФ1 восприимчивыми ко второй мутации с потерей функции в гене НФ1

Protocol

Перед началом исследований необходимо пересмотреть и утвердить процедуры и протоколы обращения с вирусными векторами на животных и их использование Комитетом по уходу за животными (IACUC) и Комитетом по биобезопасности (IBC). Процедуры, описанные здесь, были одобрены советами IACUC и IBC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Анализ WES-Seq и идентификация патогенных вариантов

1. Выделите геномную ДНК из образца опухоли или субконфлюен....

Results

На рисунке 5 показаны показатели истощения основных основных важных генов (CEG), помеченных как TRUE, по сравнению с не-CEG (помеченных как FALSE) в каждой клеточной линии человека, которая была проверена. Баллы представляют собой log2 баллов кратного истощения для отдельных генов, которые отображаются на блочной диаграмме общего распределения баллов. t-критерий Стьюдента был использован для проверки значимой разницы в средних баллах истощения между двумя группами в каждой клеточной линии.

Discussion

Детально представленные методы были разработаны для изучения неоплазии периферической нервной системы и патогенеза МПНСТ. Несмотря на то, что мы считаем эти методы эффективными, следует признать, что существуют некоторые потенциальные ограничения для методов, которые мы здесь описываем. Ниже мы обсудим некоторые из этих ограничений и потенциальные стратегии их преодоления в других модельных системах.

Мы обнаружили, что секвенирование всего экзома эффективно идентифицирует интересующие мутации .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ультразвуковая система Bioruptor	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, Сан-Диего, Калифорния	н/д
Цитометр изображения Celigo	Nexcelom	н/д
Cellecta Анализатор штрих-кодов и деконволютер программное обеспечение
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-луночный черный микропланшет	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15мл конические пробирки	Diagenode
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Элюирующий буфер	Qiagen	19086
Этанол (200 пруф)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTGGCAAGCAAAAGAGGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			ВЭЖХ очищенный
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, Сан-Диего, Калифорния	Н/А
Параформальдегид (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Реагент для трансфекции	Thermo Scientific	11514015
Полибреновый реагент для трансфекции	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Набор для быстрой очистки ПЦР	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Набор для экстракции геля	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Титановая Taq-полимераза	Clontech	639210
Trimmomatic программное www.usadellab.org