Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов

Краткое содержание

Мы разработали межвидовой сравнительный подход к онкогеномике, использующий геномный анализ и функциональный геномный скрининг для выявления и сравнения терапевтических мишеней в опухолях, возникающих на генетически модифицированных мышиных моделях, и соответствующего типа опухоли человека.

Аннотация

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (MPNST) происходят из шванновских клеток или их предшественников. У пациентов с синдромом предрасположенности к опухолям нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) МПНТ являются наиболее распространенным злокачественным новообразованием и ведущей причиной смерти. Эти редкие и агрессивные саркомы мягких тканей предлагают суровое будущее, с 5-летней безрецидивной выживаемостью 34-60%. Варианты лечения людей с МПНСТ разочаровывающе ограничены, при этом обезображивающая хирургия является основным вариантом лечения. Многие некогда многообещающие методы лечения, такие как типифарниб, ингибитор передачи сигналов RAS, потерпели клиническую неудачу. Аналогичным образом, клинические испытания II фазы эрлотиниба, который нацелен на эпидермальный фактор роста (EFGR), и сорафениба, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и Raf, в сочетании со стандартной химиотерапией, также не вызвали ответа у пациентов.

В последние годы методы функционального геномного скрининга в сочетании с генетическим профилированием линий раковых клеток доказали свою полезность для выявления основных цитоплазматических сигнальных путей и разработки таргетно-специфической терапии. В случае редких типов опухолей разновидность этого подхода, известная как межвидовая сравнительная онкогеномика, все чаще используется для выявления новых терапевтических мишеней. В межвидовой сравнительной онкогеномике генетическое профилирование и функциональная геномика выполняются на генетически модифицированных мышиных моделях (GEM), а затем результаты подтверждаются на редких человеческих образцах и клеточных линиях, которые доступны.

В данной статье описывается, как идентифицировать гены-кандидаты-драйверы в клетках MPNST человека и мыши с помощью секвенирования всего экзома (WES). Затем мы опишем, как проводить скрининг шРНК на уровне генома для выявления и сравнения критических сигнальных путей в клетках MPNST мыши и человека и идентификации лекарственных мишеней в этих путях. Эти методологии обеспечивают эффективный подход к выявлению новых терапевтических мишеней при различных типах рака человека.

Введение

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ) представляют собой высокоагрессивные веретеноклеточные новообразования, которые возникают в связи с синдромом восприимчивости к опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1), спорадически в общей популяции и в местах предшествующей лучевой терапии ^1,2,3. Пациенты с НФ1 рождаются с копией гена-супрессора опухолей NF1 дикого типа и вторым аллелем NF1 с мутацией с потерей функции. Это состояние гаплонедостаточности делает пациентов с НФ1 восприимчивыми ко второй мутации с потерей функции в гене НФ1 дикого типа, которая запускает опухолегенез. Когда эта мутация NF1 происходит в клетке шванновской клеточной линии, результирующая опухоль представляет собой либо дермальную нейрофиброму, возникающую в коже, либо плексиформную нейрофиброму, которая развивается в крупных нервах или нервных сплетениях. Несмотря на то, что патология дермальных и плексиформных нейрофибром идентична, их биологическое поведение совершенно различно: хотя и дермальные, и плексиформные нейрофибромы являются доброкачественными, только плексиформные нейрофибромы могут претерпевать трансформацию и давать начало МПНСТ. В дополнение к потере нейрофибромина, белка, активирующего Ras ГТФазу, кодируемого геном NF1, MPNST несут мутации множества других генов-супрессоров опухолей, включая TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 и PTEN 10, мутации генов, кодирующих компоненты поликомбного репрессивного комплекса 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 и EED) и аберрантная экспрессия рецепторных тирозинкиназ ^1,2. Мутации NF1 и других генов, отмеченных выше, также присутствуют в спорадических и радиационно-индуцированных MPNST^11,12.

Несмотря на то, что эти достижения в нашем понимании геномных аномалий у МПНТ были неоценимы для понимания их патогенеза, они еще не привели к разработке новых эффективных методов лечения МПНСТ. Основным препятствием, препятствующим разработке новых методов лечения, является тот факт, что MPNST являются редкими видами рака. Из-за этого трудно получить большое количество образцов пациентов, которые необходимы для глобального анализа, определяющего ключевые мутации, такие как те, которые проводятся Атласом генома рака (TCGA). По нашему опыту, накопление даже небольшого количества человеческих образцов MPNST может занять годы. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи, изучающие другие редкие типы рака, обратились к использованию межвидовой сравнительной онкогеномики для выявления существенных мутаций генов-драйверов, определения основных цитоплазматических сигнальных путей в интересующей их опухоли и определения новых терапевтических мишеней. Поскольку сигнальные пути, необходимые для опухолегенеза, очень консервативны между человеком и другими видами позвоночных, применение подходов функциональной геномики, таких как скрининг шРНК на уровне генома, может быть эффективным средством идентификации этих новых драйверных мутаций, сигнальных путей и терапевтических мишеней 13,14,15,16,17,18,19 , особенно при изучении редких типов опухолей человека, которые доступны в предельных количествах²⁰.

В представленных здесь методологиях мы описываем этот подход к выполнению геномного профилирования в клеточных линиях MPNST человека и культурах раннего пассажа MPNST, полученных от мышей P 0-GGFβ3, генетически модифицированной мышиной модели (GEM), в которой шванновская клеткоспецифическая гиперэкспрессия фактора роста нейрегулина-1 (NRG1) способствует патогенезу плексиформных нейрофибром и их последующей прогрессии до MPNST ^{21, С. 22,23.} Первым шагом в этом подходе является идентификация генов-кандидатов в MPNST P 0-GGFβ3, клеточных линиях MPNST человека и хирургически резецированных MPNST человека. Для функциональной валидации сигнальных путей, затронутых этими мутациями, мы используем скрининг шРНК на уровне генома для идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания в клеточных линиях MPNST человека и мыши. После идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания, мы определяем лекарственные генные продукты в коллекции «хитов» с помощью базы данных по взаимодействию генов с лекарственными препаратами. Мы также сравниваем «попадания» в клетки человека и мыши MPNST, чтобы определить, демонстрируют ли модель GEM и MPNST человека одинаковую зависимость от одних и тех же генов и сигнальных путей. Идентификация перекрытий в генах, необходимых для пролиферации и выживания, а также в затронутых сигнальных путях служит средством валидации мышиной модели P 0-GGFβ3 на молекулярном уровне. Этот подход также подчеркивает эффективность комбинирования скринингов человека и мыши для выявления новых терапевтических мишеней, где мышиная модель может служить дополнением к человеческим экранам. Ценность этого межвидового подхода особенно очевидна при поиске терапевтических мишеней в редких опухолях, где трудно получить человеческие опухоли и клеточные линии.

Протокол

Перед началом исследований необходимо пересмотреть и утвердить процедуры и протоколы обращения с вирусными векторами на животных и их использование Комитетом по уходу за животными (IACUC) и Комитетом по биобезопасности (IBC). Процедуры, описанные здесь, были одобрены советами IACUC и IBC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Анализ WES-Seq и идентификация патогенных вариантов

1. Выделите геномную ДНК из образца опухоли или субконфлюентных (70%) клеток MPNST, выращенных на 60-миллиметровой чашке, используя стандартные коммерчески доступные методы адсорбции на основе силикагеля (подробные шаги см. в протоколе производителя). Общий рабочий процесс показан на рисунке 1.
2. Введите не менее 10 мкл геномной ДНК с концентрацией 50 нг/мкл в секвенирующий ядро, если не указано другое количество или концентрация геномной ДНК.
   1. Основная установка фрагментирует геномную ДНК с помощью ультразвука, а затем очищает ее предпочтительным методом. Захват экзома и построение библиотеки выполняются с использованием предпочтительного набора для секвенирования экзома, а индексные теги добавляются к усиленному захваченному экзому.
   2. Отправьте образцы в центр секвенирования для проведения секвенирования всего экзома с парными концами (WES; секвенирование 100.н. с каждого конца).
   3. Файлы FASTQ, сгенерированные ядром, предоставляются исследователю. Используйте для анализа только файлы FASTQ, которые передают метрики качества.
3. Выровняйте и проанализируйте файлы FASTQ с помощью коммерчески доступных программ (например, DNAStar19,20, Partek21 или Varsome). Выровняйте файлы FASTQ по референсному геному мыши GRCm38/mm10, используя настройки по умолчанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя DNAStar и образец MPNST мыши в качестве примера, общий рабочий процесс представлен в виде диаграммы Рисунок 1 и кратко объяснено ниже.
   1. Откройте программное обеспечение DNAStar и выберите рабочий процесс SeqMan NGen.
   2. Выберите «Рабочий процесс», выбрав « Анализ вариантов/повторное секвенирование » и тип анализа секвенирования : «Ампликон на основе NGS», «Панель генов» или «Экзом». Нажмите кнопку Далее.
   3. Выберите предпочтительную референсную последовательность, выбрав «Загрузить пакет генома » и соответствующий референсный геном (например , Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip или Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Если основное учреждение предоставило файл кровати, загрузите этот вспомогательный файл. Нажмите кнопку Далее.
   4. Выберите Входные последовательности, выбрав соответствующую технологию секвенсора, Illumina, и укажите, что чтение секвенирования является парным. Затем выберите настройку эксперимента, несколько образцов и загрузите файлы FASTQ для секвенирования, нажав кнопку Добавить. Если вы работаете с несколькими образцами, обозначьте каждый набор с парным концом уникальным названием эксперимента или образца: « Опухоль», «Клеточная линия» или «А18, А202...» Нажмите кнопку Далее.
   5. Задайте контрольный набор данных, если он есть. Нажмите кнопку "Далее" и снова нажмите кнопку "Далее" в разделе "Параметры сборки". В разделе «Параметры анализа» выберите соответствующий режим «Обнаружение вариантов» как «Диплоид», а затем нажмите кнопку «Далее». В разделе "Выходные данные сборки" назовите и укажите место сохранения файла проекта; нажмите кнопку Далее. Запустите сборку на локальном компьютере или в облаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующие файлы выравнивания могут быть открыты в рабочем процессе ArrayStar для аннотирования вариантов обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Этот рабочий процесс обнаруживает однонуклеотидные полиморфизмы, а не прирост или потерю числа копий генов. Отдельный анализ, называемый массивом SNP высокой плотности, обнаруживает изменения числа копий; Секвенирование всего экзома не позволяет надежно обнаружить изменения числа копий. Обратитесь к руководству пользователя программы, чтобы узнать о конкретных действиях, которые необходимо выполнить с программой выравнивания.
   6. Применяйте пользовательские фильтры к аннотации вариантов обнаруженных SNP, чтобы включить или исключить определенные данные. Чтобы получить сжатый список вероятных функционально значимых вариантов, примените следующие фильтры к наборам данных вариантов в этой иерархии: не в контроле (при наличии нормальной контрольной выборки), частота популяции (gnomAD, ExAC, 1000 частот геномов), частота аллелей (включая ≤0,001 или 0,1%), глубина охвата (исключая глубину <10), патогенность или класс ClinVar (включают: патогенный, вероятно патогенный; исключают: неопределенный, вероятно доброкачественный, доброкачественный), и, при желании, тип SNP и кодирование воздействия (включают: несинонимичный, миссенс, нонсенс, сдвиг кадра, внутрикадровый, сплайсинг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известный список релевантных генов рака также может быть применен к окончательному списку, чтобы извлечь только определенные гены, относящиеся к заболеванию, см. шаг 1.3.7. Эти фильтры могут сократить список вариантов генов до менее чем 20 генов.
      1. Гомозиготные и гетерозиготные варианты будут представлены приблизительно на 100% и 50% соответственно для чистой неконтаминирующей клеточной популяции (установленная клеточная линия, полученная из опухоли, должна представлять одну популяцию изогенных опухолевых клеток). В этом случае примените 100-90 % и 50-40% частот аллелей для вариантов в качестве фильтра, тем самым удаляя любые варианты ниже этого. Если данные массива SNP высокой плотности также доступны для того же набора данных, примените усиление или потерю числа копий к однонуклеотидным полиморфикам с частотами вариаций аллелей меньшими, чем гомозиготные или гетерозиготные отношения (т. е. увеличение числа копий, приводящее к 2 копиям аллеля A и 1 копии аллеля B, даст соответствующие частоты вариаций аллелей 75%, 25%, соответственно).
   7. После идентификации патогенных вариантов с помощью ArrayStar экспортируйте и сохраните список вариантов генов в виде файла csv, txt или xls и сравните гены, содержащие эти мутации, с генами в когорте опухолей, сгенерированных P 0-GGFβ3, чтобы определить перекрывающиеся и уникальные списки мутировавших генов. Сравните мутировавшие гены с известными мутировавшими генами, связанными с их человеческими аналогами (например, со списком генов рака Bushman Lab или списком, курируемым пользователем).
      1. Необязательно, прежде чем применять какие-либо пользовательские фильтры (1.3.6), экспортируйте и сохраните аннотированный файл как файл VCF.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл VCF может быть загружен в другое программное обеспечение для прогнозирования эффекторов вариантов Varsome или VEP для сравнения в качестве вторичного анализа. Биологический анализ и анализ путей также могут быть выполнены на отфильтрованных списках вариантов генов.
   8. Выполняйте функциональную классификацию списка вариантов генов с помощью предпочитаемой пользователем базы данных для получения информации о классе белка, пути, компоненте пути, семействе генов и онтологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера здесь используется PANTHER (pantherdp.org).
      1. Загрузите отфильтрованный список генов с идентификатором гена.
      2. Выберите организм (Mus musculus).
      3. Выберите анализ (Функциональная классификация, просмотренная в списке генов) и нажмите Отправить биологический анализ и анализ путей в отфильтрованных списках вариантов генов.

2. Скрининг шРНК на уровне генома

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько библиотек шРНК и CRISPR, которые могут быть использованы для функциональных скринингов геномного масштаба с культурами опухолей с низким пассажем. В этой статье мы опишем использование библиотек шРНК CELLECTA DECIPHER в качестве примера. Библиотеки лентивирусных шРНК CELLECTA DECIPHER оптимизированы для генетических скринингов РНК-интерференции в объединенном формате. Каждый транскрипт нацелен по меньшей мере на 5-6 уникальных шРНК, а каждый лентивирусный вектор шРНК содержит уникальный генетический штрих-код, окруженный сайтами праймеров ПЦР. Эти библиотеки охватывают большинство генов, связанных с болезнями человека и мышей, но не охватывают все гены в геноме. Пулы плазмидной ДНК библиотеки человека Cellecta доступны в трех модулях (модуль I, II, III; нацелен на 15 377 генов), в то время как пулы плазмид библиотеки мышей доступны в двух модулях (модули I и II мыши; нацелены на 9 145 генов). Эти библиотеки используются для проведения анализов «отсева», в которых целевые гены, необходимые для пролиферации и/или выживания, дифференцированно экспрессируются в разные моменты времени после вирусной трансдукции.

1. Лентивирусная упаковка
   1. День 0: Тарелка 10 пробирок по 10 миллионов 293 Т-клеток/15-сантиметровая чашка в 30 мл/чашка DMEM без антибиотиков, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
   2. День 1: Подтвердите, что клетки сливаются на ~80% на следующий день и готовы к трансфекции. В конической пробирке объемом 50 мл смешайте следующее в следующем порядке: 600 мкл смеси плазмид упаковки (0,5 мкг/мкл), 60 мкл библиотеки штрих-кодов плазмид, 12 мл DMEM (без сыворотки или антибиотиков) и 600 мкл реагента для трансфекции. Выдерживают при комнатной температуре 15 мин.
   3. Поместите 900 мкл трансфекционного реагента и 12 мл DMEM в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл и перемешайте вихревым способом. Добавьте 12,9 мл смеси реагента для трансфекции и DMEM в смесь ДНК и перемешайте. Выдерживать при комнатной температуре 15 минут без дополнительного перемешивания. Добавьте 2,5 мл этой смеси по каплям в каждую 15-сантиметровую чашку с 293Т-клетками и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур.
   4. День 2: На следующий день замените питательную среду обычной питательной средой, содержащей антибиотики.
   5. День 3: Собирают вирус, собирая среду, пропуская ее через фильтрационную установку 0,2 мкм и аликвотируя в конические пробирки объемом 15 мл; также готовят пять аликвот отфильтрованного вируса по 1 мл в криовиалах для использования в титровании вируса (считается вирусом через 48 ч); хранить вирус в морозильной камере при температуре -80 °C. Замените среду 30 мл питательной среды на планшеты по одной, чтобы избежать высыхания клеток.
   6. День 4: Собирайте вирус, собирая среду и пропуская ее через фильтрующую установку 0,2 мкм. Аликвотный вирус в конические пробирки по 15 мл. Это считается 72-часовым вирусом; хранить вирус в морозильной камере при температуре -80 °C.
2. Титровые лентивирусные пулы
   1. Добавьте 65 мкл катионного полимера (10 мг/мл) к 65 мл среды для выращивания опухолевых клеток. Пипетку по 1 мл/лунку полимерсодержащей среды в одиннадцать 6-луночных тканевых культуральных планшетов. Трипсинизация опухолевых клеток раннего пассажа и подсчет клеток предпочтительным методом таким образом, чтобы каждая лунка получала 50 000 клеток/мл/лунку. Разморозьте 1 мл аликвоты лентивируса в течение 48 ч из морозильной камеры на водяной бане с температурой 37 °C.
   2. Для каждого вирусного модуля подготовьте инфекцию, как показано в таблице 1.
   3. Поместите все планшеты с 6 лунками в инкубатор для тканевых культур. На следующий день удалите вирусные среды и пополните их свежими. Через 48 ч добавьте пуромицинсодержащую среду во все лунки, получающие отбор. Перед слиянием контрольных клеток выполните подсчет клеток выживших клонов, используя предпочтительный метод.
      Примечание: Концентрация пуромицина, необходимая для уничтожения нетрансдуцированных клеток, должна быть предварительно определена эмпирически путем тестирования диапазона концентраций на кривой «убийства». Используйте самую низкую концентрацию, которая равномерно индуцирует гибель нетрансмиссивных культур.
3. Лентивирусная инфекция клеток-мишеней
   1. Трипсинизируйте клетки MPNST и подсчитывайте. Тарелка 2,5 миллиона ячеек на 15-сантиметровую тарелку, всего двадцать 15-сантиметровых тарелок на модуль. Разморозьте вирус и трансдуцируйте клетки с вирусом при MOI 0,5 в присутствии 5 мкг/мл катионного полимера (рис. 2A).
   2. На следующее утро удалите вируссодержащие среды и замените их свежими. Культивируйте клетки в течение дополнительных 2 дней, чтобы обеспечить экспрессию маркера отбора, а затем добавляйте пуромицин в культуры для удаления нетрансдуцированных клеток.
   3. Через три дня после добавления пуромицина трипсинизируют клетки и центрифугируют половину клеточной популяции при 200 × г в течение 5 мин в настольной центрифуге. Храните гранулированные клетки в морозильной камере при температуре -80 °C для будущего препарирования геномной ДНК; это точка отсчета времени, или точка времени 1 (T1).
   4. Пересадите другую половину клеточной популяции и выращивайте ее в течение примерно 7 удвоений популяции перед сбором и центрифугированием, как указано выше. Эта клеточная гранула будет служить конечной точкой времени (точка времени 2, T2) и хранится при -80 °C для будущего выделения геномной ДНК (рис. 2).
4. Выделение геномной ДНК из клеток, трансдуцированных с помощью вирусных пулов
   1. Разморозьте клеточную гранулу из морозильной камеры при температуре -80 °C и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл буфера для ресуспензии с добавлением РНКазы и сразу же разделите на две полиметилпентеновые пробирки по 15 мл (Рисунок 2B).
   2. Добавьте 500 мкл 10% SDS на 5 мл, перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем поместите пробирки в устройство для резки ДНК для ультразвуковой обработки ДНК в течение 25 циклов по 30 с включение/30 с выключение, следя за тем, чтобы температура была на уровне 4 °C.
   3. Добавьте 5 мл фенола/хлороформа, pH 8,0 (хранить при 4 °C), обязательно хорошо перемешав фенол/хлороформ перед использованием. После добавления фенола/хлороформа хорошо перемешать, энергично вихревая на максимальной настройке в течение 45-60 с. Центрифуга в течение 60 мин, -20 °C при 7 200 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пенистый/молочный вид после вихря будет сигнализировать о полной ресуспензии.
   4. Перелейте 3 мл прозрачной верхней фазы в свежую пробирку объемом 15 мл, добавьте 0,5 мл 3 М ацетата натрия и 4 мл изопропанола и хорошо перемешайте (рисунок 2C). Центрифуга в течение 30 мин при 20 °C при 7 200 × г.
   5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, а затем осторожно удалите пипеткой оставшуюся жидкость. Добавьте 0,5 мл 70% этанола и вытесните гранулу пипеткой вверх и вниз. Переложите повторно взвешенную гранулу в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и смешайте обе гранулы из одного образца в одну центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга на максимальной скорости в настольной центрифуге в течение 5 мин.
   6. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте лабораторную салфетку, чтобы абсорбировать остатки 70% этанола. Повторно суспендируйте гранулу в 0,5 мл дистиллированной воды, следя за тем, чтобы гранула не высохла, так как это затруднит повторную суспендию. Перед измерением концентрации ДНК храните образцы при температуре 4 °C.
5. Вложенная ПЦР для амплификации штрихкодов шРНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките ДНК из хранилища и положите на лед. Если концентрация ДНК ниже 100 нг/мкл, то быстро высушите ДНК в вакууме и ресуспендируйте в соответствующем объеме дистиллированной воды. Мы рекомендуем обрабатывать только один модуль за раз (точка времени 1 (T1) или точка времени 2 (T2)). Выполните две подготовки каждого временного момента, которые должны быть объединены в конце; Следовательно, важно не обрабатывать повторяющиеся моменты времени в один и тот же день. Следующий протокол предназначен для одной временной точки геномной ДНК.
   1. Установите 7 пробирок и пометьте их, как описано: отрицательный контроль, положительный контроль, 4 пробирки для геномной ДНК и одна для мастер-смеси (рис. 3A). Отрицательным контролем является дистиллированная вода; положительным контролем является плазмидная ДНК, используемая при трансфекции 293T для генерации лентивируса.
   2. Сначала добавьте воду в каждую трубку, как указано в таблице 2.
   3. Приготовьте мастер-микс (ММ), как показано в таблице 3.
   4. Добавьте 18 мкл ММ в каждую пробирку с водой. Затем добавьте 25 мкл геномной ДНК в каждую из 4 матричных пробирок. Затем добавьте 1 мкл положительного контроля (10 нг/мкл) в пробирку с положительным контролем, стараясь не загрязнять другие пробирки положительной контрольной ДНК. Наконец, добавьте 2 мкл полимеразы в каждую пробирку, сначала в 4 пробирки с образцами, а затем в пробирку с положительным контролем; смешать и открутить пробирки для ПЦР (рис. 3).
   5. Проводят ПЦР-реакцию в условиях, указанных в таблице 4.
   6. Во время проведения первой ПЦР подготовьте пробирки для^2-й ПЦР, как указано в таблице 5. Установите семь пробирок: отрицательный контроль, положительный контроль, 4 пробирки для геномной ДНК и одну для ММ (рис. 3B).
   7. Добавьте 22 мкл ММ в каждую пробирку, содержащую воду, и дождитесь окончания первого раунда ПЦР, прежде чем добавлять ДНК и полимеразу.
      1. После завершения первого раунда ПЦР объедините 4 пробирки с образцами в одну микроцентрифужную пробирку и перемешайте.
      2. Добавьте 25 мкл в каждую пробирку с водой.
      3. Затем добавьте 2 мкл первого отрицательного контроля ПЦР и 2 мкл первого положительного контроля ПЦР в пробирки с соответствующей маркировкой.
      4. Добавьте по 2 мкл полимеразы в каждую пробирку, сначала в 4 пробирки с образцами, а затем в отрицательный контроль.
   8. Проведите ПЦР-реакцию, как указано в таблице 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе результатов первой реакции ПЦР методом электрофореза на 3,5% агарозном геле, если получено изобилие продукта, количество циклов может быть сокращено до 9-10 для следующего повторения этой процедуры; Точно так же, если выход продукта низкий, количество циклов может быть увеличено до 14.
   9. Когда вторая реакция ПЦР будет завершена, объедините 4 образца в одну микроцентрифужную пробирку плюс 80 мкл красителя с 6-кратной загрузкой. Для положительного и отрицательного контроля используют 20 мкл образца.
      1. Приготовьте 3,5% агарозный гель в буфере Трис-Борат-ЭДТА (КЭ) (Рисунок 4А). Чтобы вместить большой объем образца, создайте одну большую лунку в гелевом гребне, соединив несколько лунок вместе (если гребень, подходящий для этого объема, недоступен), обязательно оставляя две лунки доступными для положительного и отрицательного контроля. Запустите гель при 90 В в течение 1 ч.
   10. Визуализируйте гель и подтвердите полосу примерно на 250 парах оснований (.о.).
6. Первая очистка: гелевая экстракция
   1. Используя чистый скальпель или бритвенное лезвие, удалите ленту 250.н., срезав как можно больше геля. Разрежьте большую ленту на 4 части и переложите каждый кусочек в чистую пробирку для микроцентрифуги. Измерьте и запишите вес каждого кусочка геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый кусочек должен содержать примерно 200 мг или меньше на тюбик.
   2. Добавьте 6 объемов буфера для солюбилизации (например, если кусочек геля весит 200 мг, добавьте 1,2 мл буфера). Поместите пробирки на водяную баню с температурой 50 °C и вращайте каждые 10-15 минут, пока кусочки геля не растворятся. Затем добавьте 1 объем изопропанола в каждую пробирку (например, 0,2 мл изопропанола, если кусочек геля весит 200 мг).
   3. Используя две центрифуговые колонны для очистки, загрузите пробы из всех 4 пробирок в колонны. Выполните несколько отжимов, чтобы обработать весь объем образца, так как колонки вмещают только 750 мкл. Отжим колонки при давлении 17 900 × г в течение 1 мин в обычной настольной микроцентрифуге и каждый раз отбрасывайте проточный поток.
   4. Промойте колонки промывочным буфером объемом 750 мкл и центрифугой при 17 900 × г в течение 1 мин. После промывки выбросьте проточный поток и высушите центрифугирование при 17 900 × г в течение 3 минут. Элюируют ДНК с помощью 50 мкл дистиллированной воды на колонку и центрифугируют, как и раньше, в течение 1 мин и объединяют обе пробирки для получения общего объема образца 100 мкл.
7. Второе очищение
   1. На следующем этапе очистки будет использоваться связывающий буфер 2 (из набора для очистки ПЦР), который не удаляет мелкие фрагменты. Добавьте 400 мкл буфера к 100 мкл ДНК и загрузите его на одну спиновую колонку (рис. 4B). Центрифугируют образец при 17 900 × г в течение 1 мин.
   2. Затем промойте мембрану 650 мкл промывочного буфера и отжимите, как это было сделано ранее. Высушите центрифугирование с помощью дополнительного центрифугирования, как указано выше, в течение 3 минут.
   3. Элюируют ДНК с помощью 30 мкл дистиллированной воды и вращают с максимальной скоростью в течение 1 минуты. После элюирования проверяют концентрацию на спектрофотометре; Убедитесь, что концентрация не ниже 10 нг/мкл и не выше 70-80 нг/мкл. Храните ДНК в морозильной камере при температуре -20 °C.
8. Секвенирование усиленных штрих-кодов
   1. Для секвенирования разбавляйте очищенные штрихкоды до 0,75 нг/мкл с помощью элюирующего буфера (EB). Чтобы добавить разнообразие последовательностей, ампликоны кластеризуются при 17 пМ, включая 30% (v/v) PhiX. Выполнить одностороннюю (SE) кластеризацию на автоматизированной системе генерации кластеров по протоколу производителя.
   2. Ядро секвенирования выполнит в общей сложности 36 циклов одностороннего секвенирования на секвенсоре NextGen (рис. 4C) . Добавьте специальный праймер GexSeqS к праймерам секвенирования Illumina на 0,5 мкМ.
   3. Используйте указанное программное обеспечение для анализа для создания файлов Fastq и обработки их с помощью программного обеспечения для обрезки длины считывания до 18 нуклеотидов.
   4. Используйте программное обеспечение Barcode Analyzer и Deconvoluter для деконволютирования обрезанных считываний. Рассчитайте баллы по сворачиванию для каждой шРНК как отношение количества считанных в контрольный момент времени (T1) к конечной точке времени (T2).
9. Анализ результатов шРНК-скрининга и идентификация потенциальных терапевтических мишеней
   ПРИМЕЧАНИЕ: В библиотеке шРНК Cellecta большинство генов нацелены либо на 5 (67%), либо на 6 различных шРНК (32%). Тем не менее, несколько генов, отвечающих за поддержание работоспособности, которые должны быть хитами в большинстве клеток, являются мишенью для большого количества шРНК и служат в качестве контроля, определяющего диапазон оценок для отрицательных результатов.
   1. Чтобы предотвратить смещение в сторону генов, на которые нацелено большее количество шРНК, логарифмическое преобразование показателей истощения. Выполните квантильную оценку, вычислив 80-й процентиль для каждого гена по его эмпирическому распределению.
   2. Чтобы получить нулевое распределение баллов логарифмического складчатого истощения, предположим, что >95% генов не будут истощены и что их логарифмические квантильные оценки будут иметь нормальное распределение. Используйте медиану эмпирического распределения для оценки среднего значения нулевого распределения. Используя это нулевое распределение, классифицируйте все гены с логарифмическими показателями истощения, которые превышают 95-й процентиль нулевого распределения, как «хиты».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все удары должны содержать, по крайней мере, две шРНК с показателями истощения выше точки отсечения (рис. 5).
   3. Для оценки качества данных скрининга выпадения РНК-интерференции и валидности точки отсечения используйте для сравнения набор генов, которые были определены как «основные основные» в рамках инициативы скрининга РНК-интерференции рака COLT^24,25. Удалите CEG из списка попаданий, чтобы получить первоначальный список потенциальных терапевтических мишеней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гены в наборе COLT оказались хитовыми в >50% из 72 линий раковых клеток, которые были проверены с помощью COLT. Основной список основных генов содержит 640 генов.
   4. Для идентификации потенциальных терапевтических мишеней, которые обычно или равномерно требуются нескольким клеточным линиям MPNST, постройте диаграммы Венна для не-CEG попаданий, идентифицированных в скрининге различных клеточных линий MPNST или культур раннего пассажа (рис. 6A). Приоритизируйте попадания, не относящиеся к CEG, которые требуются во всех или большинстве линий или культур MPNST.
      1. В качестве альтернативы можно провести анализ путей в списке попаданий, отличных от CEG, из каждой клеточной линии или культуры раннего пассажа для выявления генов, продукты которых кодируют компоненты сигнальных путей, необходимых для пролиферации и/или выживания опухолевых клеток. Затем сравните сигнальные пути, которые были идентифицированы при анализе путей не-CEG, с сигнальными путями, которые были идентифицированы как затронутые мутациями, идентифицированными с WES.
         Примечание: Мы считаем особенно полезным идентифицировать сигнальные пути, на которые последовательно влияют мутации, идентифицированные в WES, и сравнивать их с сигнальными путями, идентифицированными как критические в скринингах шРНК.
   5. Чтобы определить лекарственные мишени, для которых уже доступны терапевтические агенты, проверьте список хитов, оставшихся после удаления основных важных генов, используя базу данных по взаимодействию генов лекарственных средств (dgidb.org).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта база данных позволяет вводить и проверять гены одновременно, а также предоставляет рекомендации по препаратам, которые в настоящее время доступны для воздействия на эти гены.
   6. Сначала валидируйте идентифицированные лекарственные мишени с высоким интересом, сбивая экспрессию их генов с помощью шРНК, отличных от тех, которые использовались на начальном библиотечном скрининге, в формате одной партии (а не в формате библиотечного пакета, который только что описан). Чтобы подавить экспрессию генов, используют две-три лентивирусные шРНК. Через три-четыре дня после заражения определите влияние, которое это оказывает на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток, как описано ниже.

3. Проведение цитометрического анализа количества клеток и жизнеспособности клеток MPNST, подвергнутых воздействию потенциальных терапевтических агентов

1. Увеличьте количество клеток MPNST в DMEM до 80% слияния. Промойте клетки сбалансированным солевым раствором Хэнкса комнатной температуры (HBSS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выращивайте клетки до слияния, так как рост этих клеток будет замедляться в течение некоторого времени после замены покрытия.
2. Отделите клетки от субстрата, накрыв клетки на срок от 30 с до 1 мин раствором для неферментативной диссоциации клеток. Добавьте 5 мл DMEM на 1 мл раствора диссоциации и осторожно пропитывайте клетки вверх и вниз, чтобы отделить их от субстрата.
3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластинчатые ячейки с плотностью 1 200 ячеек на лунку в 96-луночных пластинах с черными стенками; Наметьте не менее трех лунок для каждого лекарственного разведения, которое будет тестироваться, и выполните три биологических повторения этих экспериментов.
4. Чтобы определить первоначальные концентрации препарата, которые будут тестироваться, просмотрите литературу, чтобы оценить, какие концентрации были эффективны против других типов раковых клеток. В первоначальных экспериментах тестируйте диапазон на два порядка выше и на два порядка ниже концентрации препарата, используемого при других типах рака.
5. Подготовьте разведенные растворы препарата, который будет испытуем, и добавьте каждое разведение или транспортное средство по крайней мере в три реплицированные лунки.
6. Оценивают прямые номера клеток через 1, 3, 5 и 7 дней после добавления препаратов. Добавьте Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 °C. Считывание пластин на высокопроизводительном цитометре с визуализацией с помощью опции прямого подсчета клеток для общего количества клеток со временем экспозиции 100 000 мс.
7. Анализируйте показания с помощью программного обеспечения и экспортируйте их в электронную таблицу, а также используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа.
8. Если в скважинах, обработанных лекарственными препаратами, наблюдается статистически значимое снижение количества клеток, проведите анализ «Живой/мертвый», чтобы определить, связано ли это снижение, отчасти, с индукцией гибели клеток.
   1. Пластинчатые ячейки в 96-луночных планшетах с черными стенками, как описано в шаге 3.3.
   2. Подготовьте и добавьте лекарственные препараты, как описано в шаге 3.5.
   3. Оценивают жизнеспособность и гибель клеток через 1, 3, 5 и 7 дней после добавления препарата. Добавьте кальцеин AM до конечной концентрации 1 мкМ и йодид пропидия до конечной концентрации 1 мкМ в каждой лунке. Инкубируют клетки в течение 15 мин при 37 °C.
   4. Визуализация клеток на цитометре с помощью программного обеспечения Live+Dead . Анализируйте показания с помощью программного обеспечения и экспортируйте их в электронную таблицу, а также используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа.

Результаты

На рисунке 5 показаны показатели истощения основных основных важных генов (CEG), помеченных как TRUE, по сравнению с не-CEG (помеченных как FALSE) в каждой клеточной линии человека, которая была проверена. Баллы представляют собой log2 баллов кратного истощения для отдельных генов, которые отображаются на блочной диаграмме общего распределения баллов. t-критерий Стьюдента был использован для проверки значимой разницы в средних баллах истощения между двумя группами в каждой клеточной линии.

Обсуждение

Детально представленные методы были разработаны для изучения неоплазии периферической нервной системы и патогенеза МПНСТ. Несмотря на то, что мы считаем эти методы эффективными, следует признать, что существуют некоторые потенциальные ограничения для методов, которые мы здесь описываем. Ниже мы обсудим некоторые из этих ограничений и потенциальные стратегии их преодоления в других модельных системах.

Мы обнаружили, что секвенирование всего экзома эффективно идентифицирует интересующие мутации ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ультразвуковая система Bioruptor	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, Сан-Диего, Калифорния	н/д
Цитометр изображения Celigo	Nexcelom	н/д
Cellecta Анализатор штрих-кодов и деконволютер программное обеспечение
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-луночный черный микропланшет	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15мл конические пробирки	Diagenode
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Элюирующий буфер	Qiagen	19086
Этанол (200 пруф)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTGGCAAGCAAAAGAGGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'			ВЭЖХ очищенный
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, Сан-Диего, Калифорния	Н/А
Параформальдегид (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Реагент для трансфекции	Thermo Scientific	11514015
Полибреновый реагент для трансфекции	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Набор для быстрой очистки ПЦР	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Набор для экстракции геля	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Титановая Taq-полимераза	Clontech	639210
Trimmomatic программное www.usadellab.org