Методическая статья

Анализ микроколониеобразующих единиц для оценки эффективности вакцин против туберкулеза

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65447

⸱

28 июля 2023 г.

 , 
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

В этой статье

Краткое содержание

Определение колониеобразующих единиц (КОЕ) является золотым стандартом для количественного определения бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis , для формирования видимых колоний которых могут потребоваться недели. В этой статье мы опишем микро-КОЕ для определения КОЕ с повышенной эффективностью по времени, уменьшенным пространством лаборатории и стоимостью реагентов, а также масштабируемостью для экспериментов со средней и высокой пропускной способностью.

Аннотация

В 2022 г. от туберкулеза (ТБ), основной причины смерти от инфекционного агента во всем мире, умерло 1,6 миллиона человек, уступив только COVID-19 во время пандемии 2019-2021 гг. Заболевание вызывается бактерией Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), единственная противотуберкулезная вакцина, является старейшей лицензированной вакциной в мире, которая используется до сих пор. В настоящее время 12 вакцин проходят клинические испытания и десятки вакцин находятся на стадии доклинической разработки. Методом выбора для оценки эффективности противотуберкулезных вакцин в доклинических исследованиях является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот трудоемкий анализ занимает от 4 до 6 недель, требует значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, имеет высокую стоимость реагентов и подвержен загрязнению. В этой статье мы опишем оптимизированный метод переписи колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), который предлагает простое и быстрое решение для анализа результатов анализа эффективности вакцины против туберкулеза . Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Кроме того, для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины могут быть получены образцы из различных источников, включая ткани вакцинированных животных, инфицированных микобактериями. Описан оптимизированный метод получения одноклеточной, однородной и высококачественной культуры микобактерий для изучения инфекций. Наконец, мы предлагаем повсеместно использовать эти методы для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза.

Введение

Туберкулез (ТБ) является основной причиной смерти во всем мире от одного инфекционного агента, бактерии Mycobacterium tuberculosis (M.tb), убивающей больше людей, чем любой другой патоген. В 2021 г. туберкулез стал причиной 1,6 миллиона случаев смерти, а вовремя пандемии 2019–2021 гг. его превзошел COVID-191. Более того, согласно глобальному докладу Всемирной организации здравоохранения о туберкулезе за 2022 год, пандемия COVID-19 привела к росту числа новых случаев заболевания туберкулезом. ВОЗ также сообщает о значительном снижении числа людей, у которых диагностирован туберкулез в течение этого периода, что может привести к дальнейшему увеличению числа случаев заболеваниятуберкулезом1.

Бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ) — живой аттенуированный штамм патогенной Mycobacterium bovis, впервые использованный в качестве вакцины более 100 лет назад. Это единственная вакцина против туберкулеза и самая старая лицензированная вакцина в мире, используемаядо сих пор. В настоящее время на разных фазах клинических испытаний находятся 12 вакцин4, а на стадии доклинической разработки находятся десятки вакцин 5,6. Доклиническая оценка вакцин против туберкулеза включает оценку безопасности и иммуногенности7, которые могут быть получены на различных моделях животных, таких как рыбки данио, мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот и приматы 8,9,10. Кроме того, для оценки способности вакцины индуцировать защиту от инфекции и/или передачи МТБ, т.е. эффективности вакцины, необходимо провести тест на МТБ in vivo 5,11. Интересно, что вакцинация БЦЖ индуцирует неспецифические эффекты, которые влияют на выживаемость других бактериальных и вирусных патогенов12,13 через механизм обученного иммунитета14. Для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки у инфицированного животного методом выбора является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ) 5,15. КОЕ — это единица, которая оценивает количество микроорганизмов (бактерий или грибов), которые образуют колонии при определенных условиях роста. КОЕ происходят от жизнеспособных и репликативных микроорганизмов, и абсолютное количество живых микроорганизмов в каждой колонии трудно оценить. Неясно, произошла ли колония от одного или нескольких микроорганизмов. Единица КОЕ отражает эту неопределенность, поэтому в репликах одного и того же образца можно наблюдать большую вариабельность. Этот трудоемкий анализ требует специализированных технических специалистов, обученных работе на объекте уровня биобезопасности 3 (BSL3), значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, занимает от 4 до 6 недель и подвержен загрязнению.

В этом исследовании мы описываем оптимизированный метод пересчета колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), и предлагаем простое и быстрое решение для анализа результатов 15,16,17,18,19,20. Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Мы полагаем, что этот метод должен быть повсеместно принят для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза. Наконец, этот оптимизированный метод подсчета КОЕ был использован для количественного определения не только микобактерий, но и других бактерий, таких как Escherichia coli и Ralstonia solanacearum21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, предназначен для БЦЖ, но может быть применен к любым микобактериям. БЦЖ может быть использована в качестве суррогатной бактерии для экспериментов по борьбе с туберкулезом, когда средства BSL3 недоступны22. Следующие процедуры с использованием БЦЖ должны выполняться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2) и в соответствии с соответствующими рекомендациями по биобезопасности и надлежащей лабораторной практикой для манипуляций с микроорганизмами 2-й группы опасности.

1. Приготовление питательных сред

  1. Приготовьте бульон Middlebrook 7H9 с добавлением 10% (v/v) олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы и каталазы (OADC) в соответствии с инструкциями поставщика. Добавьте в бульон 0,05% (v/v) тилоксапола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тилоксапол представляет собой неионогенный жидкий полимер, который используется в качестве поверхностно-активного вещества для предотвращения образования бактериальных комков16.
  2. Приготовьте твердую среду Middlebrook 7H10 с добавлением 10% (v/v) обогащения OADC в соответствии с инструкциями поставщика.
  3. Распределите 40 мл среды на квадратную чашку Петри (120 мм x 120 мм). Дайте пластинам высохнуть, чтобы свести к минимуму конденсацию на поверхности агара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот специфический размер чашки Петри является основополагающим для обеспечения прямой транспонации по крайней мере 96 капель из 96-луночной чашки. Эффективная сушка пластин в дальнейшем облегчит покрытие мелкими каплями бактериальной суспензии и предотвратит их распространение.
  4. Для получения инфекционной среды подготовьте либо среду Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640), либо модифицированную среду Eagle Medium (DMEM) Dulbecco. В любом случае добавьте в среду 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% L-глютамина и 1 мМ пирувата натрия. Не добавляйте в среду пенициллин и стрептомицин.

2. Пробоподготовка

  1. Получение образцов из различных источников. Как правило, для количественного определения КОЕ для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины берут образцы из тканей вакцинированных и невакцинированных животных. Например, промывание легких и селезенки мышей11 или легких, грудных и периферических лимфатических узлов, селезенки, печени, кожи, крови, костного мозга и бронхоальвеолярного лаважа23. В качестве альтернативы можно получить образцы из культур in vitro макрофагов/дендритных клеток/нейтрофилов, инфицированных БЦЖ 18,19,20,24,25,26.

3. Производство культуры БЦЖ

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью исследований противотуберкулезных вакцин in vivo является повышение эффективности БЦЖ. Поэтому в качестве контроля, как правило, используются группы, привитые БЦЖ. Штаммы БЦЖ, используемые для вакцинации людей, идеально подходят для тестирования на животных моделях. В этом случае культура БЦЖ должна быть восстановлена в соответствии с инструкциями поставщика27. Тем не менее, культура БЦЖ для исследований in vivo также может быть произведена собственными силами11. Получение одноклеточной, однородной и высококачественной культуры БЦЖ для протоколов инфекции in vitro было очень успешно получено в нескольких исследованиях 11,16,18,19,20,26,28,29 с использованием следующего протокола, который также может быть использован для исследований на животных.

  1. Культивирование 50 мл БЦЖ в бульоне 7H9, при 37 °C, с перемешиванием при 200 об/мин. Изменяйте громкость в соответствии с потребностями эксперимента.
  2. Ежедневно в течение 8-10 дней собирают 100 мкл культуры и разбавляют ее, добавляя 900 мкл PBS в кювету объемом 1 мл. Затем приступают к измерению оптической плотности бактерий (OD при λ=600 нм; OD600) в спектрофотометре. Постройте кривую роста из этих значений. Определите среднюю логарифмическую фазу культуры (когда наружный диаметр постоянно удваивается в единицу времени).
  3. Подготовьте следующую культуру и инкубируйте до достижения средней/поздней фазы роста бревен, как описано в шагах 3.1 и 3.2. Используйте значения, полученные на предыдущем шаге, в качестве ориентира. Следите за тем, чтобы культура не достигла фазы стационарного роста (когда наружный диаметр начинает стабилизироваться), чтобы сохранить культуру жизнеспособных бактерий хорошего качества.
  4. Собирают культуру в средней/поздней фазе роста бревна. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 10 мл PBS, чтобы смыть бактерии. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируйте бактерии с помощью 5 мл инфекционной среды. Поместите трубку в ультразвуковую ванну на 15 мин, на полную мощность при 80 Гц.
  7. Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин. Соберите надосадочную жидкость, избегая гранул, так как она богата бактериальными скоплениями, которых следует избегать в высококачественной культуре БЦЖ, и выбросьте ее.
  8. Измерьте наружный диаметр надосадочной жидкости. Здесь культуры в фазе экспоненциального роста с OD600 , равным 0,1, эквивалентны 1 x 107 КОЕ/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория должна построить свои собственные кривые роста БЦЖ перед началом экспериментов по установлению линейной регрессии между OD600 и КОЕ с помощью спектрофотометра. Обратите внимание, что спектрофотометры имеют разные расстояния светового пути, что может варьировать показания, полученные для одного и того же образца.
  9. Проведите несложные расчеты, чтобы установить количество бактерий, которые необходимо добавить в каждую культуру клеток хозяина. Количество бактерий в клетке-хозяине называется множественностью инфекции (MOI). Используйте MOI из 10 бактерий на клетку-хозяина, что является наиболее распространенным MOI, используемым для экспериментов с инфекцией БЦЖ.

4. Анализ микроколониеобразующей единицы

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента с инфекцией in vivo или in vitro подсчет бактерий может быть выполнен с помощью мКОЕ. Для исследований in vivo образцы должны быть сначала гомогенизированы в бисерном венчике или другом тканевом гомогенизаторе. Для in vitro культур макрофагов/дендритных клеток/нейтрофилов, инфицированных БЦЖ, образцы должны быть лизированы с использованием неионогенного детергента (например, 0,05% раствора неионного, неденатурирующего детергента).

  1. Серийные разведения с использованием 96-луночного планшета: выполняют серийные 10-кратные разведения лизатов, в стерильной 96-луночной планшете по схеме на рисунке 1А. Распределите лизаты по рядам А и Е. Для каждой пластины максимальное количество образцов и/или реплик составляет 24.
  2. Добавьте 180 мклdH2Oв оставшиеся лунки для выполнения серийного разбавления.
  3. С помощью 12-канальной пипетки ресуспендируйте лизаты в ряду А и перенесите 20 мкл в ряд В (20 мкл лизата + 180 мкл dH2O). Хорошо гомогенизировать. Последовательно повторите этот шаг для рядов B и C, пока не дойдете до последнего разведения в ряду D.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы выполняем три разведения (100, 101, 102, 103), таким образом, используя 4 ряда планшета (A-D или E-H) для каждого набора из 12 образцов и/или репликаций.
  4. Нанесение микрокапельного покрытия: используйте многоканальную пипетку объемом 0,5–10 мкл (предпочтительнее использовать тонкие наконечники) для переноса 5 мкл из каждого ряда 96-луночного планшета на квадратную пластину со твердой средой, как показано на рисунке 1B.
  5. Медленно пипетируя капли объемом 5 мкл, дайте им слегка коснуться агара. Это поможет отвести каплю от кончика по направлению к агару и уменьшит возможность задержки жидкости внутри наконечника.
  6. Дайте каплям высохнуть, закройте агаровую пластину и инкубируйте ее при температуре 37 °C, наблюдая за ростом бактерий. По желанию инкубируйте пластины с агаром в герметичном полиэтиленовом пакете, чтобы предотвратить высыхание пластин.
  7. Подсчет микроколоний: примерно через 6-10 дней инкубации проверьте наличие отдельных колоний, видимых невооруженным глазом (рисунок 2).
  8. Подсчитайте колонии, используя объектив с наименьшим увеличением (4x или ниже) инвертированного оптического микроскопа или увеличительного стекла. Подсчеты следует проводить в разведениях, где число пчелосемей меньше 300 и выше 30. В качестве альтернативы можно использовать камеру, чтобы сфотографировать каплю, чтобы вручную подсчитать колонии на компьютере, или использовать программное обеспечение, такое как ImageJ, для автоматизации подсчета колоний.
  9. Чтобы выразить количество клеток в КОЕ/мл, используйте следующее уравнение:
    figure-protocol-1
    Где C = количество подсчитанных колоний, V = объем в мкл, а Dil = разведение при подсчете колоний (100, 101, 102, 103). Например, если в капле 5 мкл в разведении 102 насчитали 30 колоний, то:
    figure-protocol-2

figure-protocol-3
Рисунок 1. Схематическое изображение протокола mCFU. (А) Последовательные 10-кратные разведения БЦЖ-содержащих лизатов в 96-луночном планшете. (B) Квадратная чашка Петри, содержащая твердую питательную среду и покрытая 96 каплями по 5 мкл каждая. Капли пипетируются непосредственно из 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-4
Рисунок 2. Микроколониеобразующие единицы БЦЖ после 10 дней инкубации. Слева фотография квадратной чашки Петри, наложенной на 96 капель по 5 мкл каждая, как ранее было представлено на рисунке 1B. Справа отдельные фотографии 3 капель соответствуют исходному лизату (100) и двум разведениям (101, 102). Фотографии были сделаны с помощью DSRL-камеры, оснащенной зум-объективом 18-55 мм (пластина) или макрообъективом 105 мм (капли). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Подсчет микроколониеобразующих единиц на Фиджи (ImageJ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод мКОЕ позволяет количественно определять КОЕ для больших наборов образцов. Изображения капель могут быть записаны для апостериорного анализа, чтобы облегчить подсчет колоний. Несколько фотоустройств могут производить изображения с достаточным для этой цели качеством. К ним относятся цифровые фотоаппараты, веб-камеры, микроскопы и увеличительные стекла, прикрепленные к камере, а также сотовые телефоны. Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений, такое как ImageJ, предлагает возможность ручного или автоматизированного подсчета колоний на этих изображениях. Для демонстрации обоих методов будет использован метод Фиджи, представляющий собой дистрибутив ImageJ, включающий в себя несколько инструментов для научного анализа изображений30. Фиджи можно загрузить с https://fiji.sc/.

  1. Ручной метод подсчета
    1. Откройте изображение, содержащее mCFU на Фиджи. Выберите «Плагины» > «Анализ счетчика ячеек» > «Анализ».
    2. В меню Счетчик ячеек выберите команду Инициализация , а затем выберите счетчик (например, Введите 1).
    3. Продолжайте, нажимая на каждую колонию. Каждый клик будет отображаться на картинке и обновлять счетчик (рисунок 3). Чтобы отменить случайные щелчки, выберите Удалить.
    4. Зарегистрируйте значение, отображаемое на счетчике. Нажмите кнопку Сбросить , чтобы сбросить счетчик и открыть новое изображение для подсчета дополнительных образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшие инструкции по этому плагину можно найти на https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Автоматизированный метод подсчета
    1. Откройте изображение, содержащее mCFU на Фиджи. Выберите «Изображение» > введите > 8 бит. Это преобразует изображение в 8-битное изображение в оттенках серого.
    2. Выберите инструмент «Овал » на панели инструментов и нарисуйте овал вокруг области с колониями (рис. 4A). Овал может быть скорректирован после того, как он будет нарисован.
    3. Выберите Edit > Clear Outside, чтобы удалить все помехи из внешней области (рисунок 4B). Выберите «Изображение» > «Настроить порог >».
    4. Перемещайте ползунки в меню порога до тех пор, пока колонии не станут красными и фоновый шум не будет сведен к минимуму (рис. 4C).
    5. Выберите Применить и выйдите из окна порогового значения. Создается черно-белое изображение (рис. 4D).
    6. Выберите «Анализ» > «Анализ частиц». В окне анализа частиц укажите диапазон площади колонии (от 1 до бесконечности, измеряется в квадратах пикселей) и круговости (от 0 до 1, где 1 — идеальная окружность; Рисунок 4E).
    7. Выберите «Контуры» во всплывающем меню «Показать». Отметьте Показать результаты для получения подробных измерений для каждой колонии в окне результатов. Установите флажок «Очистить результаты», чтобы стереть все предыдущие измерения. Установите флажок Суммировать, чтобы отобразить сводные результаты измерений (рис. 4E).
    8. Запустите анализатор, нажав кнопку ОК. Появится новое окно, в котором будут отображены все выделенные колонии, которые были обнаружены и подсчитаны. В окне результатов отображаются подробные сведения о каждой колонии, а в окне сводных результатов отображается общее количество подсчитанных колоний (рис. 4F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки размера и округлости будут варьироваться в зависимости от разрешения и увеличения изображения, а также размера и формы колоний. Повторяйте процесс несколько раз, пока не будут найдены наилучшие настройки, которые обнаруживают все колонии. Дальнейшие инструкции по плагину analyze particles можно найти на странице https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

figure-protocol-5
Рисунок 3. Ручной метод подсчета mCFU с помощью плагина счетчика клеток в программном обеспечении Fiji. Синие точки обозначают колонии, на которые уже нажал пользователь. В меню справа отображается количество подсчитанных на данный момент колоний (всего 41). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-6
Рисунок 4. Автоматизированный метод подсчета мКОЕ с использованием программного обеспечения Fiji. (А, Б) Область интереса с колониями выбирается с помощью инструмента «Овальное выделение», а внешняя область удаляется с помощью команды «Очистить снаружи». (С, Г) Черно-белое изображение колоний генерируется с помощью инструмента порог. (Е, Ф) Количество колоний количественно оценивается с помощью инструмента анализа частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный здесь анализ мКОЕ увеличивает объем информации, которую можно получить из одной чашки Петри, по крайней мере, в 96 раз. На рисунке 5 показано сравнение двух методов доставки лекарственного средства для перепрофилированного использования саквинавира (SQV)31,32 в качестве препарата, направленного на хозяина для лечения туберкулеза. В этом анализе были использованы четыре различных штамма Mycobacterium tuberculosis дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Туберкулез является серьезной проблемой общественного здравоохранения, приобретающей все большее значение, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. Перебои в работе медицинских учреждений по диагностике и лечению туберкулеза во время пандемии COVID-19 оказали негативное влияние на заболеваемость новыми случаями1. Кроме того, для борьбы с этой эпидемией необходимо срочно бороться с мультилекарственными штаммами и штаммами М.тб с широкой лекарственной устойчивостью, а также с с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

DP и PJGB заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана внутренним финансированием медицинского факультета Португальского католического университета и внешним финансированием Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) в рамках грантов UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 и EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночные пластиныVWR734-2781
DSLR объектив 15-55 мм объективNikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR фотоаппаратNikonD3400
DSLR макрообъективSigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Фетальная сыворотка теленкаGibco10270106
Fiji Softwarehttps://fiji.sc/Fiji — это программное обеспечение с открытым исходным кодом, поддерживаемое несколькими лабораториями, учреждениями и частными лицами. Все необходимые плагины включены.
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-глутаминGibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
Многоканальная пипетка (0,5 - 10 &; l)МногоканальныйGilson FA10013
(20 - 200 &; l)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG Американская коллекция типовых культурATCC35734штамм TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC обогащениеBD211886
фосфатно-солевой буфер (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 среднийGibco21875091
пируват натрияGibco11360-070
Спектрофотометр UV-6300PCVWR634-6041
Квадратная чашка Петри 120 x 120 ммCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
Ультразвуковая ванна Elma P 30 HVWR142-0051
дозатор

Ссылки

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431(2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199(2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2(2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808(2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098(2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819(2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247(2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19(2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707(2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202(2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447(2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478(2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409(2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944(2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728(2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691(2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460(2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mycobacterium tuberculosisImageJ

Похожие статьи