Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Манипуляция Tuina для уменьшения воспаления и потери хряща у крыс с остеоартритом коленного сустава

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65451

⸱

30 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол манипуляций Tuina, выполненных на крысах с остеоартрозом коленного сустава, вызванным гипсом. Основываясь на предварительных результатах, он предположил, что эффективность метода основана на уменьшении воспаления и потери хряща.

Аннотация

Клинические испытания показывают, что манипуляция Tuina эффективна при лечении остеоартрита коленного сустава (KOA), в то время как для выяснения ее механизма необходимы дальнейшие исследования. Поэтому манипуляции на животных моделях остеоартроза коленного сустава имеют решающее значение. Этот протокол обеспечивает стандартный процесс манипуляций с Туиной на крысах КОА и предварительное исследование механизма Туина для КОА. Метод манипуляций с прессом и разминанием (разновидность манипуляции Туйна, которая относится к надавливанию и разминанию определенного участка поверхности тела) применяется на 5 акупунктурных точках вокруг коленного сустава крыс. Сила и частота манипуляций стандартизировались с помощью записей давления пальцами, а положение крысы во время манипуляции подробно описано в протоколе. Эффект манипуляции можно измерить с помощью болевых тестов и микроскопических данных синовиальной и хрящевой оболочки. Крысы с КОА показали значительное улучшение болевого поведения. Воспалительная инфильтрация синовиальной ткани была снижена в группе Туйна, а экспрессия фактора некроза опухоли (ФНО)-α была достоверно ниже. По сравнению с контрольной группой, апоптоз хондроцитов был меньше в группе Туина. В этом исследовании представлен стандартизированный протокол манипуляций с Туиной на крысах с КОА и предварительное доказательство того, что терапевтические эффекты Туина могут быть связаны с уменьшением воспаления синовиальной оболочки и отсроченного апоптоза хондроцитов.

Введение

Остеоартроз коленного сустава (КОА) – это дегенеративное заболевание, которое в основном проявляется болью в суставах. Фиброз, растрескивание, изъязвление и потеря суставного хряща являются основными причинами этого заболевания1. КОА имеет высокую распространенность и может оказывать глубокое влияние на повседневную жизнь пациентов, вызывая инвалидность в тяжелых случаях. Среди людей в возрасте 45-84 лет распространенность КОА увеличивается с возрастом, а распространенность среди людей в возрасте 85 лет и старше составляет 15%, с преобладанием у женщин 2,3%. Кроме того, KOA может стать серьезным экономическим бременем как для отдельного человека, так и для общества. Опрос показал, что прямые расходы на здравоохранение на душу населения достигают 8 858 долларов США ± 5 120 долларов СШАв год. Со старением общества КОА стала глобальной проблемой здравоохранения и серьезной социальной проблемой, а также актуальной проблемой для научных исследований.

Научно обоснованные исследования показали эффективность манипуляций Туина при лечении КОА5. Манипуляция Туина может облегчить боль и улучшить дисфункцию у пациентов с КОА, механизм которой связан с противовоспалительным действием 6,7. Ученые обнаружили, что манипуляции Туина эффективно ингибируют экспрессию воспалительных факторов интерлейкина (ИЛ)-β и 5-гидрокситриптамина и замедляют дегенерацию суставного хряща у кролика моделиКОА 8. Было высказано предположение, что Туина может способствовать кровообращению и метаболизму в месте поражения, что помогает устранить воспалительные факторы, такие как IL-1, IL-6 и фактор некроза опухоли (TNF)-α, тем самым облегчая клинические симптомы КОА9. Кроме того, пассивное движение сустава с помощью манипуляций Туина может способствовать проникновению и диффузии синовиальной жидкости в суставной хрящ и улучшает метаболизм питательных веществ в тканях10. Другие исследования показали, что манипуляции Туина могут эффективно улучшать биомеханические показатели у пациентов с КОА11. Манипуляции, применяемые к мягким тканям, могут улучшить распределение нагрузки по конечностям и улучшить функцию равновесия12,13. В то же время при некоторых манипуляциях с выравниванием суставов выравнивание нижних конечностей также может быть скорректировано для коррекции аномальной походки14,15.

Механизм действия манипуляций Туина при лечении КОА еще предстоит изучить, а потому необходимо экспериментальное исследование. Ключом к применению Tuina на экспериментальных животных является стандартизация методов моделирования, фиксации животных и вмешательства16. Метод моделирования определяет, может ли подопытное животное проявлять признаки заболевания. Между тем, соответствующие методы фиксации могут облегчить вмешательство манипуляции Туйна и лучше отразить эффект Туины. Стандартизация методов вмешательства является самой сложной частью манипуляции Туйна. В 2010 г. в базовой системе китайских стандартов акупунктуры упоминались стандарты акупунктурных точек для экспериментальных животных, обеспечивающие возможность проведения операций иглоукалывания и туйна в экспериментах на животных17. Тем не менее, по-прежнему существуют трудности со стандартизацией манипуляций с Туйной. Существует несколько видов манипуляций Туина18. Выбор конкретной манипуляции в основном зависит от заболевания, подлежащего лечению, и терапевтических теорий, которые предпочитает исполнитель. В исследовании Туйна для КОА больше внимания было уделено манипуляциям с точечным нажатием (нажатие на определенные акупунктурные точки большим пальцем или локтем), манипуляциям Ичичичань (манипуляция с надавливанием большим пальцем) и манипуляциям с нажимом и разминанием (что относится к надавливанию и разминанию определенной области поверхности тела пальцем или ладонью)19. Манипуляции с прессом и разминанием являются одной из наиболее широко используемых манипуляций Туины, которая сочетает в себе надавливание и разминание для перемещения подкожной клетчатки20. Манипуляции с прессом и разминанием, применяемые к акупунктурным точкам, могут улучшить кровообращение и облегчить боль и представляют собой терапевтический эффект Туйна на КОА19.

В этом протоколе будет подробно описана операция манипуляций с прессом и разминанием на крысах с КОА, включая выбранные акупунктурные точки, интенсивность и частоту манипуляций и положение тела крысы, чтобы обеспечить ориентир для будущих исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование прошло проверку этики животных, проведенную экспериментальным комитетом по этике животных больницы интегрированной традиционной китайской и западной медицины Юэян при Шанхайском университете традиционной китайской медицины (YYLAC-2022-166).

1. Подготовка и группировка экспериментальных животных

  1. Подготовка животных
    1. Выращивание в общей сложности 10 здоровых самок крыс с SPF SD весом 200-220 г при комнатной температуре (18-21 °C), влажности 40%-50%, 12 ч: 12 ч, колебания циркадного ритма. Проводить эксперименты на животных, связанные с болью, в строгом соответствии с соответствующими положениями этических норм и рекомендаций по отношению к животным.
  2. Группировка животных
    1. Случайным образом разделите крыс на группу Туина и контрольную группу. Лечить крыс группы Туйна прессом и разминающими манипуляциями в течение 21 дня после лепки. Поместите крыс контрольной группы в ту же комнату Туйна и поместите их в черный матерчатый мешок одновременно, пока группа Туйна проходит лечение.

2. Моделирование животных

  1. Обезболивание животного
    1. Используйте изофлуран для газовой анестезии. Поместите крысу в индукционную коробку с индукционной концентрацией 3%. Покачайте коробку после того, как уложите крысу, и подтвердите анестезию, когда крыса перевернется, не пытаясь вернуться в положение лежа.
    2. Извлеките крысу из индукционной коробки и зафиксируйте ее нос в анестезирующей маске. Отрегулируйте концентрацию изофлурана до 2% для поддержания анестезии. Подтвердите анестезию, когда крыса не реагирует на пощипывание лап. Наносите глазную мазь на крыс, чтобы предотвратить сухость, когда крысы находятся под наркозом, так как веки не могут быть закрыты.
  2. Метод моделирования21
    1. Используйте бритвенный станок, чтобы удалить волосы с правой задней конечности. Поместите медицинский ватный диск между правой лодыжкой и тазобедренным суставом крысы. Правый коленный сустав при разгибании на 180° равномерно зафиксируйте 5-6 слоями влажной гипсовой повязки. По спирали оберните гипсовую повязку, начиная от лодыжки и закрывая 1/3 предыдущей. Используйте фен, чтобы высушить и затвердеть штукатурку.
    2. Наружно оберните пластырь основным материалом для зубных протезов после того, как гипсовая повязка высохнет и затвердеет, чтобы зафиксировать гипс и предотвратить его разгрызание.
    3. Смешайте базовые материалы зубного протеза, чтобы сделать его липким, и приклейте смесь к внешней стороне пластыря (смесь не должна превышать край бинта, рисунок 1). После того, как смесь станет твердой, выключите наркозный аппарат и подождите, пока животное проснется естественным путем. Наблюдайте за крысами, чтобы предотвратить несчастные случаи анестезии до того, как крысы проснутся.
    4. Закрепите пластырь соответствующим образом на правой задней конечности крысы, так как тугая фиксация ограничивает кровообращение, в то время как неплотная фиксация имеет тенденцию отваливаться. Наблюдайте за кровообращением в терминальной конечности. При обнаружении отека конечной конечности или покраснения лица немедленно отрежьте часть пластыря, чтобы помочь восстановить кровообращение. Переделайте гипс, если он сломан и не поддерживает разгибание нижних конечностей.
    5. Снимают гипс через 3 недели непрерывной иммобилизации. Хирургическими ножницами отрежьте основной материал зубного протеза снаружи и наложите гипсовую повязку. Промойте нижнюю конечность крысы солевым раствором и высушите марлей. При наличии местных поражений кожи стерилизовать йодофором.
  3. Проверка модели22
    1. Проверка на основе рентгеновского излучения
      1. Провести рентгенологическое исследование правого колена через 1 день после окончания моделирования. Сделайте переднезаднюю рентгенограмму в положении лежа на спине со сгибанием бедра под углом 30°, разгибанием колена под углом 0° и отведением бедра под углом 15°. Держите коленную чашечку прямо перед коленом и поставьте трубку радиатора на расстоянии 110 мм от коленного сустава.
      2. Сделайте боковые рентгенограммы в положении правого бокового пролежня со сгибанием правого бедра под углом 30° и разгибанием правого колена под углом 0°. Сделайте сгибание бедра левой конечности под углом 70° и сгибание колена под углом 45° и поставьте трубку радиатора на расстоянии 110 мм от коленного сустава. Установите параметры детектирования: напряжение экспозиции 50 кВ, ток 250 мА, доза экспозиции 32 мА и время экспозиции 128 мс.
      3. Сравните с обычным рентгеновским снимком крыс, убедитесь, что смоделированный рентгеновский снимок коленного сустава показывает более узкую суставную щель с гиперплазией остеофитов по краю.
    2. Международное общество исследования остеоартрита (OARSI)баллы 23
      1. Поместите крысу в бокс для эвтаназии и вводите CO2 со скоростью 30%-70% объема клетки в минуту. Прекратите перфузию CO2 после того, как обнаружите, что крыса неподвижна, не дышит, а зрачок расширен. Понаблюдайте еще 2 минуты, чтобы подтвердить смерть.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вывих шейки матки может быть выполнен после эвтаназии на основеCO2 в качестве вторичной формы для подтверждения смерти. Зафиксируйте крысу на столе и возьмитесь за ее хвост одной рукой. Надавите на голову крысы большим и указательным пальцами другой руки. Подтвердите смерть, услышав звук треска, и крыса теряет движение и сердцебиение одновременно.
      2. Зафиксируйте крысу в положении лежа на спине иглой шприца на пенопластовой доске с согнутой правой задней конечностью в отведении и наружном вращении. Защипните кожу вокруг коленного сустава хирургическими ножницами. Обнажите мышцы вокруг коленного сустава, разрезав кожу, а затем разрезав подкожную фасцию.
      3. Срежьте костными ножницами диафиз бедренной и большеберцовой костей и удалите правый коленный сустав. Аккуратно удалите лишние мягкие ткани, такие как мышцы и связки, за пределы сустава.
      4. Зафиксируйте сустав в 4% параформальдегиде на 24-48 ч при 4 °С. Декальцинируйте сустав в 10% растворе муравьиной кислоты в течение 3 дней до тех пор, пока костную ткань не можно будет легко проткнуть иглой.
      5. Поместите и обрежьте декальцинированную ткань в вытяжной шкаф и перенесите ее в ящик для обезвоживания в дегидратационной машине. Добавляют 75% этанола в течение 4 ч, затем 90% этанола в течение 2 ч, затем 95% этанола в течение 1 ч, абсолютного этанола в течение 30 мин, еще одного раунда свежего абсолютного этанола в течение 30 мин, спиртового бензола в течение 5-10 мин, ксилола в течение 5-10 мин, еще одного раунда свежего ксилола в течение 5-10 мин, воска в течение 1 ч, еще одного раунда свежего воска в течение 1 ч, и заключительный раунд свежего воска в течение 1 ч для обезвоживания и погружения в прозрачный воск.
      6. Затем поместите салфетку в машину для встраивания. После того, как парафин застынет, разрежьте восковой блок на восковые ломтики по 4 мкм и разровняйте срез в теплой воде. Поместите ломтик на предметное стекло и высушите. Храните его при комнатной температуре.
      7. Осмотрите образец хряща и оцените его в соответствии с оценкой степени гистопатологии хряща ОА (Таблица 1)23. Если оценка крыс после моделирования значительно выше, чем у нормальных крыс, моделирование прошло успешно.

Таблица 1. Оценка степени гистопатологии хряща ОА. Степень – это глубина проникновения в хрящ. Общий балл = Оценка x Постановка. 0 для нормальных суставов, 24 для тяжелого артрита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Крысы обездвижены в гипсе. После обезболивания крыс их правые нижние конечности были обмотаны гипсовыми бинтами, зафиксированы в гиперэкстензионном положении, а снаружи покрыты слоем материала основы протеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Манипуляция Туина

  1. Область применения
    1. Выберите в общей сложности 5 акупунктурных точек на правой задней конечности крыс, включая ST34, ST35, SP10, EX-LE4 и BL40 (рис. 2). Найдите акупунктурные точки в соответствии с принципами позиционирования акупунктурных точек в 24.
  2. Позиция для применения
    1. Разрежьте черную ткань в пакет размером 9 см х 15 см с одним боковым отверстием и затяните отверстие веревкой. Перед манипуляцией Туина осторожно потяните крысу за хвост, чтобы она зарылась в мешок и выставила задние конечности наружу.
    2. Одной рукой удерживайте крысу в положении лежа, держа ее за хвост и заднюю лапу, в то время как другой рукой применяет манипуляции с надавливанием и разминанием на определенную акупунктурную точку (рис. 3).
  3. Манипуляция Туина
    1. Выполняйте манипуляции с прессом и разминанием на 5 акупунктурных точках на правой задней конечности в течение 2 минут каждая. Положите большой палец исполнителя на выбранную акупунктурную точку, чтобы выполнять ритмичные нажимы и разминания, сводя кожу и подкожную клетчатку вместе круговыми движениями.
    2. Используйте записи давления пальцев (единицы в ньютонах), чтобы обеспечить постоянную интенсивность и частоту манипуляций. Поддерживайте интенсивность в пределах 3-5 Н и частоту 2 Гц (рисунок 4). Применяйте манипуляцию один раз в сутки в течение 21 дня.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Положение акупунктурных точек. SP10 расположен на 5 мм выше внутреннего коленного сустава у крыс. ST34 расположен на 5 мм выше наружного коленного сустава у крыс. EX-LE4 расположен в медиальной части связки коленного сустава у крыс. ST35 расположен в латеральной части связки коленного сустава у крыс. BL40 расположен в средней точке поперечной подколенной полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Манипуляции Туины, применяемые на крысах. Крыс держали в черном мешке с обнаженными задними конечностями. Исполнитель держал хвост крысы левой рукой, в то время как правая рука выполняла манипуляцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Запись давления пальцами. Устройство, регистрирующее силу и частоту нажатия пальца, используется для обратной связи в режиме реального времени об интенсивности и частоте в процессе манипуляций Tuina. (A) Датчик давления и передаточное оборудование. (Б) Запись давления пальцами. (C) Сила, зарегистрированная во время манипуляций с Туйной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

4. Тесты болевого поведения

  1. Протестируйте болевое поведение до и после моделирования, а также через 1 день после (D1), через 7 дней после (D7), через 14 дней после (D14) и через 21 день после (D21) манипуляции Tuina, включая механический порог отмены и тесты латентности отведения лапы.
  2. Механический порог изъятия (MWT)
    1. Поместите крыс в кабину из прозрачного закаленного стекла размером 20 см x 10 см x 20 см, расположенную на сцене высотой 40 см, которая состоит из проволочной решетки с апертурой размером 10 мм x 10 мм. Поддерживайте температуру в помещении на уровне 23 °C ± 2 °C.
    2. Помещайте крыс в поведенческую лабораторию не менее чем на 2 часа в день во время фазы поведенческого теста, чтобы избежать вмешательства в результаты теста из-за отсутствия адаптации животных к окружающей среде в начале формального теста. Поместите крыс в поведенческую лабораторию на 30 минут до начала формального теста, чтобы облегчить их адаптацию к окружающей среде и уменьшить отвлекающие факторы.
    3. Используйте электронные волокна фон Фрея для измерения MWT. Стимулируйте крысу волокном в центре лапы и убирайте волокно, когда крыса показывает очевидные движения, такие как поднятие ноги и избегание. В этот момент машина может автоматически регистрировать максимальное значение давления (Н).
    4. Следующую стимуляцию начинают у той же крысы не менее чем через 15 с после текущей стимуляции. Не превышайте 5 с во время каждой стимуляции, чтобы предотвратить сенсибилизацию к тактильным раздражителям в лапах крыс. Повторите испытание 5 раз до тех пор, пока разница между тремя последовательными измерениями не станет незначительной (в пределах 10 Н).
    5. Удалите значения с большими отличиями (максимальное и минимальное значения) и возьмите среднее из оставшихся трех значений в качестве механического порога вывода.
  3. Задержка вывода лапы (PWL)
    1. Поместите крыс в небольшой отсек из прозрачного закаленного стекла размером 20 см х 10 см х 20 см. Накройте верхнюю часть отсека прозрачной стеклянной крышкой с вентиляционными отверстиями. Поддерживайте температуру прозрачной стеклянной пластины на уровне 28-30 °С, на которой размещен отсек.
    2. Поселите крыс в этой среде не менее чем на 30 минут, чтобы они акклиматизировались перед началом каждого официального теста. Если крысы мочатся или испражняются в отсеке, вовремя протрите его впитывающей бумагой, чтобы не повлиять на последующую передачу тепла световым излучением.
    3. Сфокусируйте прожектор на центре лапки крысы и нажмите кнопку Старт . Нажмите кнопку «Стоп », когда крыса демонстрирует очевидное поведение, такое как втягивание лапы или облизывание лапы, и запишите время в этот момент. Время облучения прожектором не должно превышать 20 с во избежание повреждения кожи крысы.
    4. Следующее облучение проводят на той же крысе не менее чем через 10 минут, чтобы предотвратить сенсибилизацию. Измерьте 5 раз на каждой крысе.
    5. Удалите значения с большими различиями (максимальное и минимальное значение). Возьмем среднее арифметическое оставшихся значений в качестве PWL.

5. Подготовка образцов

  1. Выполните эвтаназию мыши, как описано в. 2.3.2.1.
  2. Препарирование синовиальной оболочки
    1. Зафиксируйте крысу в положении лежа на спине иглой шприца на пенопластовой доске с согнутой правой задней конечностью в отведении и наружном вращении. Защипните кожу вокруг коленного сустава хирургическими ножницами и обнажите мышцы вокруг коленного сустава крыс, разрезав кожу, а затем разрезав подкожную фасцию.
    2. Возьмите связку надколенника за ориентир, чтобы обнажить группы мышц над связкой надколенника. Осторожно надрежьте конец связки надколенника (на бугристости большеберцовой кости) и найдите синовиальную оболочку, когда связка защемлена снизу вверх.
    3. Аккуратно срежьте синовиальную ткань офтальмологическими ножницами и смойте кровь и синовиальную жидкость предварительно охлажденным физиологическим раствором. Зафиксируйте синовиальную оболочку в 4% параформальдегиде не менее чем на 48 ч после впитывания воды с поверхности ткани чистой марлей.
    4. Подготовьте образец, как показано на шагах 2.3.2.5 - 2.3.2.6. Выполните оценку, как описано на шаге 2.3.2.7.
  3. Проведение окрашивания гематоксилином и эозином
    1. Депарафинизацию в воду с ксилолом на 20 мин, замените еще одним порцией свежего ксилола на 20 мин, затем обработайте безводным этанолом в течение 5 мин, замените еще одним портом, свежим безводным этанолом на 5 мин, затем добавьте 90% этанола по объему в течение 5 мин, 80% этанола по объему в течение 5 мин, 70% этанола по объему в течение 5 мин, и, наконец, дистиллированная вода в течение 5 мин.
    2. Погружают предметное стекло в раствор для окрашивания гематоксилином на 3-8 мин. Снимите предметное стекло и смойте пятно дистиллированной водой. Переместите его в жидкость дифференциации (1% солянокислый спирт) почти на 30 с, чтобы предметное стекло поблекло до бледно-голубого цвета. Промойте его дистиллированной водой и поместите в раствор для окрашивания эозина на 1-3 минуты.
    3. Обезвоживайте предметное стекло 95% объемной долей этанола в течение 5 минут, замените еще одним раундом свежего 95% этанола в течение 5 минут, затем безводным этанолом в течение 5 минут, замените еще одним раундом свежего безводного этанола в течение 5 минут.
    4. Сделайте предметное стекло прозрачным, добавив ксилол на 5 минут, замените его другим кусочком свежего ксилола на 5 минут, а затем запечатайте нейтральной смолой.
  4. Терминально-дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное мечение конца зуба (TUNEL) на хряще
    1. Обезвоживайте образец хряща в безводном этаноле, 90% этаноле, 85% этаноле и 75% этаноле до завершения депарафинизации. Замочите в PBS на 5 минут. Добавить 3%H2O2 по каплям на 10 мин.
    2. Добавить рабочий раствор протеиназы К по каплям и переваривать при 37 °С в течение 10 мин. Добавьте 20 мкл этикетировочного буфера на срез, чтобы он оставался влажным, и стряхните лишнюю жидкость после приготовления рабочего раствора. Добавьте 20 мкл рабочего раствора к каждому предметному стеклу и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C во влажном боксе.
    3. Добавьте по каплям 50 мкл раствора для укупорки и закройте на 30 минут. Затем добавьте по каплям 50 мкл разбавленного биотинилированного антитела к дигоксину (в разведении 1:100) и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч во влажном боксе. Добавьте по каплям 10 мкл разбавителя антител SABC (разведение 1:100) и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч во влажной камере.
    4. Добавьте раствор для проявления краски DAB (по 50 мкл реагентов А, В и С в 1000 мкл дистиллированной воды) по каплям на 10-15 мин. Развитие цвета завершается, когда он становится коричневато-желтым зернистым.
    5. Повторно окрасить гематоксилином в течение 3 с. После градиентного обезвоживания и прозрачной обработки высушите при комнатной температуре и тщательно заклейте предметное стекло нейтральной резинкой. Следите за тем, чтобы не оставалось пузырей и перелива клея.
  5. Иммуногистохимический анализ IL-1β и TNF-α
    1. Регулярно депарафинизируйте предметные стекла в ксилоле и увлажняйте их градиентным спиртом. Инактивируют эндогенную пероксидазу в срезах с 3%Н2О2. Поместите держатель предметного стекла в цитратный буфер с температурой 95 °C (pH 6,0) и инкубируйте на водяной бане при температуре выше 95 °C более 20 минут. Достаньте инкубационный бокс и оставьте при комнатной температуре минимум на 20 минут.
    2. Инкубируйте 5% обычную козью сыворотку с PBS в течение 10 минут при 37 °C и стряхните лишнюю жидкость. Добавьте 150 мкл антитела I капля за каплей и дайте постоять при 37 °C в течение 1 часа, затем храните ночь при 4 °C. На следующий день разогреть при температуре 37 °C в течение 45 минут.
    3. Постирайте 3 раза с PBS по 5 минут каждый. Покройте ткань предметного стекла 3% БСА и запечатайте ее при температуре 37 °C на 30 минут. Добавьте по каплям 150 мкл антитела II и дайте постоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Промойте 3 раза PBS в течение 5 минут каждый и добавьте по каплям 150 мл жидкости для проявления цвета DAB. Наблюдайте за степенью окрашивания под микроскопом до тех пор, пока образец не станет коричневато-желтым даже невооруженным глазом.
    4. Сразу же смойте PBS в течение 10 минут. Снова окрасьте гематоксилином, обезвоживайте в градиентном спирте, сделайте предметные стекла прозрачными в ксилоле и запечатайте нейтральной камедью.
  6. Статистический анализ
    1. Иммуногистохимически окрашенные срезы с положительной экспрессией ассоциированного белка имеют желтый или коричневато-желтый цвет. Оценивают интенсивность положительной экспрессии с помощью программы Image J для каждой группы иммуногистохимических срезов и используют критерии оценки средней оптической плотности (АОД), рассчитанной по IOD, деленной на площадь.
    2. Используйте аналитическое программное обеспечение для статистического анализа. Используйте t-критерий, если данные соответствуют нормальному распределению, и хи-квадрат, и непараметрический критерий, если они не соответствуют нормальному распределению. Анализ данных повторных измерений с помощью обобщенных оценочных уравнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тесты болевого поведения
Результаты МВТ показали, что МВТ правой задней конечности после моделирования была достоверно ниже, чем до (стр<0,05). По сравнению с контрольной группой, MWT крыс была достоверно повышена после Tuina (p<0,05; Рисунок 5 и таблица 2).

figure-results-1
Рисунок 5

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании представлен протокол манипуляций Туина на крысах с КОА. С помощью тестов болевого поведения и гистоморфологических данных было высказано предположение, что такая серия манипуляций с Туйной, примененная к крысам с КОА, может уменьшить воспаление синовиальной оболочки и апоптоз хряща, что может быть референсом манипуляций Туина на животных моделях КОА.

Существует несколько критически важных процедур во время протокола. Во-первых, важно выбрать подходящий метод индуцирования м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Шанхайского проекта строительства критически важных клинических специальностей (номер гранта: Shslczdzk04001); Парусная программа Шанхайской комиссии по науке и технике (номер гранта: 22YF1444300); Проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (номер гранта: 2021LK091).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
абсолютный этанолSupelcoPHR1070Для изготовления образца
ALMEMO измерительный приборahlborn2450-1Для испытания порога механического вывода
Антидигоксиновое антителоSigma-AldrichSAB4200669Для окрашивания HE IHC или TUNEL
Anti-IL-1 betaabcamab283818Для окрашивания HE IHC или TUNEL
DAB Набор подложекSolarbioDA1010Для окрашивания HE IHC или TUNEL
Материалы основы для протезовShanghai New Century20000356Для изготовления моделей
eosinbioswamp PAB180016 Для окрашивания HE IHC или TUNEL
Запись давления пальцамиСучжоу Чансянь Оптоэлектронная технологияCX1003wДля манипуляций Туина
раствор муравьиной кислотыSigma-Aldrich695076Для декальцинации
H2O2Sigma-Aldrich386790-MДля окрашивания HE IHC или
TUNEL гематоксилинбиоболот PAB180015Для окрашивания HE IHC или TUNEL
IsofluraneShanghai Yuyan Scientific Instrument CompanyS10010533Для газовой анестезии
нейтральные смолыbioswamp PAB180017Для окрашивания HE IHC или TUNEL
Параформальдегид Фикс РастворSigma-Aldrich100496Для гистологии
PBSSigma-AldrichP3813Для окрашивания HE IHC или TUNEL
Подошвенный испытательный аппаратIITC Life Science/Для отведения лапы Латентный тест
пластырь Париж повязкаWANDE20150023Для моделирования
Протеиназа Ксигма-Олдрич124568для окрашивания ГЕ ИГХ или TUNEL
TNF альфа моноклональное антителоProteintech60291-1-igдля окрашивания ХЭ ИГХ или TUNEL
TUNEL ServicebioGDP1042Для окрашивания HE IHC или
TUNEL WaxSigma-Aldrich327204Для изготовления образца
ксилолаShanghai Sinopharm Group100092Для изготовления образца

Ссылки

  1. Joint Surgery Group of Chinese Orthopaedic Association, Chinese Association of Orthopaedic Surgeons, National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese Journal of Orthopaedics. Chinese Osteoarthritis Treatment Guidelines (2021 Edition). Chinese Journal of Orthopaedics. 41 (18), 24(2021).
  2. David, S., et al. Epidemiology of knee osteoarthritis in general practice: a registry-based study. BMJ Open. 10 (1), 031734(2020).
  3. Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, Socioeconomic, and Geographic Disparities in the Epidemiology of Knee and Hip Osteoarthritis. Rheumatic Disease Clinics of North America. 47 (1), 1-20 (2021).
  4. Wang, K., Dong, X., Lin, J. H. Investigation of Medical Costs of Disease In Patients With Osteoarthritis of the Knee Joint. National Medical Journal of China. 97 (1), 4(2017).
  5. Perlman, A., et al. Efficacy and Safety of Massage for Osteoarthritis of the Knee: a Randomized Clinical Trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
  6. Xing, H., et al. Therapeutic massage for knee osteoarthritis: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Acupuncture and Tuina Science. 19 (5), 354-363 (2021).
  7. Seo, B. R., et al. Skeletal muscle regeneration with robotic actuation-mediated clearance of neutrophils. Science translational medicine. 13 (614), (2021).
  8. Wu, J. H., Zhang, C., Dong, S. J., Yin, H. Effects of Massage with #34;Relaxing Tendons" Technique on the Interleukin-1B and 5-hydroxytryptamine Levels in the Joint Fluid of a Rabbit Knee Osteoarthritis Model. Chinese General Practice. 21 (6), 688-693 (2018).
  9. Luo, R. The effects of IL-1B,IL-6,IL-13,IL-26,TNF-a by patellar manipulations on rabbit knee osteoarthritis model. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine. , (2017).
  10. Qiu, F., Li, C., Wu, X., Liu, Y., Zhang, X. Effect of Massage on the Function of Foot-Yangming Meridian-Muscle in Patients with Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 36 (3), 649-655 (2021).
  11. Yang, B., Li, S. Research Progress of Massage in Improving Biomechanical Indexes of Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 37 (12), 2571-2576 (2022).
  12. Li, C., Qiu, F., Ding, J., Hu, G., Zhang, X. Curative Observation of Retaining of Heated Needle at Trigger Points Combined with Manipulation for Muscles along Meridians in Treating Knee Osteoarthritis. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 37 (11), 2157-2162 (2020).
  13. Ding, X., Zhang, X., Hou, Y., Zhao, Z., Ye, X. Effect of massage manipulation on joint stiffness of knee osteoarthritis patients based on "spine-pelvis-knee" holistic diagnosis and treatment pattern. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. 55 (08), 54-57 (2021).
  14. Fu, Y., Gong, L., Li, Y. The clinical studies of Rolling combined with Pulling Manipulation on Early and Middle-term. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (07), 958-962 (2020).
  15. Jiang, J., Hu, X., Tang, R., Qiu, F., Huang, L. Change of lower limb force line in treating knee osteoarthritis with manipulation. Journal of Changchun University of Chinese Medicine. 34 (01), 129-132 (2018).
  16. Liang, Y., et al. Some issues on animal experiments standardization of acupuncture and moxibustion. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 25 (09), 2299-2300 (2014).
  17. Guo, Y., Liu, Y., Liu, Q., Chen, Z., Zhao, X. Basic System of Chinese Acupuncture Standard. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 31 (6), 549-550 (2011).
  18. YAN, X., Yan, J. Study on the Standardization of Classification of Tuina Manipulation. Acta Chinese Medicine. 32 (5), 875-878 (2017).
  19. Aikebaier, G., Lu, X., Liu, J., Liu, l, Wang, S. Analysis on Manipulation and Acupoint Selection Laws of Massage for Treatment of Knee Osteoarthritis Based on Data Mining Technology. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 29 (5), 23-29 (2022).
  20. Gong, L., Wuquan, S., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  21. Qian, J., Xing, X., Liang, J. Two Methods to Establish Rat Model of Osteoarthritis of the Knee. Research and Exploration in Laboratory. 33 (11), 23-27 (2014).
  22. Liu, J., et al. Experimental study of a modified Videman method for replicating knee osteoarthritis on rabbit. Rehabilitation Medicine. 30 (03), 212-219 (2020).
  23. Moskowitz, R. W. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 1-2 (2005).
  24. Shen, M., Li, Z., Shen, J. Preliminary Exploration of Experiment Teaching on Experiment Acupuncture Science. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 7 (02), 130-131 (2009).
  25. Jeong, J., et al. Anti-osteoarthritic effects of ChondroT in a rat model of collagenase-induced osteoarthritis. BMC complementary and alternative medicine. 18 (1), 131(2018).
  26. Hulth, A., Lindberg, L., Telhag, H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report. Acta orthopaedica Scandinavica. 41 (5), 522-530 (1970).
  27. Tawonsawatruk, T., Sriwatananukulkit, O., Himakhun, W., Hemstapat, W. Comparison of pain behaviour and osteoarthritis progression between anterior cruciate ligament transection and osteochondral injury in rat models. Bone & Joint Research. 7 (3), 244-251 (2018).
  28. Zhou, Q., et al. Cartilage matrix changes in contralateral mobile knees in a rabbit model of osteoarthritis induced by immobilization. BMC musculoskeletal disorders. 16, 224(2015).
  29. Zeng, J., et al. Establishment and identification of experimental rabbit model of knee osteoarthritis. Chinese Journal of Clinical Research. 29 (5), 679-682 (2016).
  30. Shang, P., et al. Comparison with two kind osteoarthritis animal models reduced by plaster immobilization in extend excessive position and bend excessive position respectively. Orthopaedic Biomechanics Materials and Clinical Study. (1), 11-14 (2006).
  31. He, Y., et al. Evaluation of the effect of improved cast immobilization method on rabbit knee osteoarthritis model. Chinese Imaging Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 18 (2), 198-219 (2020).
  32. Pengfei, S., et al. Possible mechanism underlying analgesic effect of Tuina in rats may involve piezo mechanosensitive channels within dorsal root ganglia axon. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (6), 834-841 (2018).
  33. Wang, Y. Mechanisms of Massage Mediating Chondrocyte Apoptosis in Knee Osteoarthritis Through Piezo 1/JAK2 Signaling Pathway. Shandong University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  34. Liu, J. Effect of Massage on TLR4/MyD88 Signal Transduction Pathway in Rat Knee Osteoarthritis Model. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  35. Yu, S., Zhou, J., Pang, X. Advances in induced animal models of knee osteoarthritis. Journal of Guangxi University of Chinese Medicine. 25 (5), 50-55 (2022).
  36. Tan, Q., et al. Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. 26 (11), 1714-1719 (2022).
  37. Zhang, Z., et al. A Review of Massage Therapy for Knee Osteoarthritis. Henan Traditional Chinese Medicine. 39 (1), 146-149 (2019).
  38. Gong, L., Sun, W., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  39. Chen, C., Zhang, H. Research on the rules of acupoint selection for the treatment of knee osteoarthritis with massage based on data mining. Hainan Medical Journal. 29 (18), 2617-2619 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синовиальное воспалениетест на болевое поведениеопределение положения акупунктурных точекапоптоз хондроцитовтрансдукция механического сигналаметод нажимающего разминанияиммобилизация крыс
Манипуляция Tuina для уменьшения воспаления и потери хряща у крыс с остеоартритом коленного сустава
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.