Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение метаболического фенотипа клеток почек, полученных с помощью биопсии

639 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает уникальный метод проведения метаболического профилирования клеток почек, полученных с помощью биопсии. Представленный подход был оптимизирован на здоровых взрослых самцах свиней и имеет потенциал для улучшения оценки жизнеспособности почкового аллотрансплантата в режиме реального времени. Этот метод также может помочь раскрыть новую биологию множественных заболеваний почек, основанных на метаболизме.

Аннотация

Трансплантация почки является оптимальным методом лечения терминальной стадии заболевания почек; Тем не менее, трансплантированные почки часто теряются преждевременно, с потерей до 50% трансплантата через 10 лет после трансплантации. Одной из основных причин преждевременной потери трансплантата является травма, полученная трансплантатом во время трансплантации, известная как ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ). Отсроченная функция трансплантата (DGF), определяемая как потребность в диализе в первую неделю после трансплантации, является проявлением тяжелого ИРИ, который демонстрирует функциональные и гистологические признаки острого повреждения почек (ОПП). В то время как механизмы, управляющие ОПП, остаются неясными, накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что измененная метаболическая функция в аллотрансплантате опосредует ОПП и может быть причиной DGF. Таким образом, расшифровка и мониторинг метаболических основ ИРИ улучшит наши возможности по диагностике и профилактике ОПП. В данной статье описан уникальный метод оценки митохондриального дыхания (по скорости потребления кислорода), гликолизу (скорости внеклеточного закисления) и внутриклеточному уровню АТФ в суспензиях почечных клеток, полученных с помощью пункционной биопсии. Методология была оптимизирована на здоровых взрослых самцах свиней и валидирована на модели аутотрансплантации свиней. Представленный подход имеет потенциал для улучшения оценки жизнеспособности аллотрансплантата почки в режиме реального времени в клинике. Профилирование метаболизма в биопсии, полученной от пациента, также может открыть новую биологию в других заболеваниях почек, основанных на метаболизме.

Введение

Трансплантация почки является оптимальным методом лечения терминальной стадии заболевания почек 1,2,3,4; Тем не менее, пересаженные почки часто теряются преждевременно, с потерей до 50% трансплантата через 10 лет после трансплантации5. У пострадавших пациентов наблюдается повышенная заболеваемость и смертность, что создает серьезную экономическую нагрузку на системы здравоохранения6. Основной причиной преждевременной потери трансплантата является травма, полученная трансплантатом во время трансплантации, известная как ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ). ИРИ является неизбежной травмой, вызванной уменьшением кровотока с последующей реперфузией7. Ишемия характеризуется накоплением сукцината в тканях, который приводит к обратному потоку электронов в митохондриальной дыхательной цепи, что приводит к образованию супероксида и последующему повреждению на ранних этапах реперфузии. IRI в трансплантированных органах увеличивает риск первичной нефункции, отсроченной функции трансплантата (DGF), отторжения и некачественных исходов трансплантата 8,9. DGF, определяемая как потребность в диализе в первую неделю после трансплантации9, является проявлением тяжелого IRI10. Гистологически ИРИ-ассоциированная ДГФЛ проявляется в виде острого тубулярного некроза (ОТН) и повреждения микроциркуляторного русла. Функционально отмечается снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и диуреза, признаки острого повреждения почек (ОПП) в аллотрансплантате11. Несмотря на его важность, в настоящее время не существует методов лечения ишемии-реперфузионно-ассоциированного посттрансплантационного ОПП. Отсутствие методов лечения связано с неполным пониманием механизмов заболевания и отсутствием маркеров для выявления пациентов с самым высоким риском дисфункции трансплантата в критические временные точки, в которых повреждение может быть обратимым.

Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что измененный энергетический метаболизм в аллотрансплантате опосредует ОПП и может лежать в основе DGF 13,14,15. Клетки почек вырабатывают энергию с помощью двух основных механизмов: митохондриального дыхания и гликолиза16. При ИРИ реперфузия приводит к митохондриальной дисфункции17. Следовательно, гликолиз становится основным источником энергии 13,18,19,20. Метаболический сдвиг в IRI способствует гибели канальцевых и микрососудистых эндотелиальных клеток, что приводит к ОПП 21,22,23,24. В предыдущей работе ATN был связан с повышенной экспрессией гликолитических ферментов и изменением уровней митохондриальных белков25, что соответствует IRI в трансплантате13,18. Более того, в модели аутотрансплантации почки свиньи ишемия с последующим хранением в холоде приводила к снижению уровня митохондриальных белков почек и увеличению экскреции лактата26. В целом, эти результаты подтверждают клиническую важность мониторинга метаболического фенотипа почковых аллотрансплантатов еще до трансплантации, поскольку основные метаболические особенности в аллотрансплантате могут быть предикторами дисфункции аллотрансплантата27.

Разработаны клинические модели прогнозирования краткосрочного риска отторжения и потери аллотрансплантата28,29. Тем не менее, эти модели не имеют достаточной точности и не учитывают молекулярные особенности трансплантата 30,31,32. Недавние исследования были направлены на удовлетворение этой неудовлетворенной потребности путем выявления молекулярных паттернов на тканевом уровне, которые связаны с худшими исходами трансплантата, такими как дисфункция аллотрансплантата и отторжение 13,14,15,25,33,34. Эти исследования основаны на стационарных молекулярных измерениях гена 33,34,35, белка25,26 и уровня метаболита 13,14, что оставляет неполную картину метаболического фенотипа аллотрансплантата. Этот пробел в знаниях отчасти связан с невозможностью измерить метаболическую функцию и энергетическое состояние образцов, полученных из почек, в определенный момент времени. Разработка стандартизированного протокола для определения метаболического фенотипа клеток почек, полученных с помощью биопсии, который потенциально может быть транслирован в исследование образцов пациентов, является оправданной. В данной статье описан уникальный рабочий процесс для оценки митохондриального дыхания (по скорости потребления кислорода), гликолиза (скорости внеклеточного закисления) и внутриклеточного уровня АТФ в суспензиях почечных клеток, полученных из биопсии. Методология была оптимизирована с использованием кернов биопсии почек от здоровых взрослых самцов свиней. Чтобы облегчить будущую клиническую реализацию, биопсийные ядра были получены с помощью иглы 18 G, как и в стандартных клинических протоколах забора почечных трансплантатов36,37. Наконец, полезность реализации протокола в дискриминационных экспериментальных условиях была подтверждена на модели аутотрансплантации свиней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными Института общих исследований Торонто (номер протокола использования животных: 3652). Уход за животными осуществлялся в соответствии с Национальным обществом медицинских исследований и Руководством по уходу за лабораторными животными, Национальный институт здравоохранения (NIH), Онтарио, Канада. В этом исследовании использовались пять 3-месячных самцов йоркширских свиней, весом около 30 кг каждая. Протокол данной методики подразделяется на следующие этапы: (1) Диссоциация ядер биопсии одной почки в клеточные суспензии; (2) Метаболическое профилирование клеток почек, полученных с помощью биопсии; и (3) Измерение содержания АТФ в клетках почек, полученных в результате биопсии. Все образцы биопсии, собранные для измерения метаболической функции или содержания АТФ, были диссоциированы в течение 3 ч после извлечения в боксе биобезопасности. Рабочий процесс методологии показан на рисунке 1. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Диссоциация единичных ядер биопсии почки на клеточные суспензии

  1. Соберите три биопсийных ядра ткани из коры головного мозга почек с помощью коаксиальной иглы (т.е. наружной направляющей иглы и внутренней биопсийной иглы)38. Для клинической трансляции рекомендуется использовать биопсийный пистолет 18 G39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении биопсии коры головного мозга соблюдайте угол наклона игольчатого пистолета для биопсии (~45 °C) и глубину прокола (~20 мм).
  2. Осторожно поместите каждый биопсийный керн в пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл RPMI 1640, на лед.
    1. Фрагментируйте ткань биопсии на небольшие кусочки (длиной ≤2 мм) с помощью скальпеля на чашке Петри диаметром 6 см, помещенной на лед. С помощью ультратонкого пинцета с тонким концом поместите фрагменты ткани из каждой биопсии в отдельную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл диссоциативной среды.
      Диссоциативная среда состоит из среды RPMI 1640, содержащей 0,1 мг/мл ДНКазы I, 10 мг/мл коллагеназы и 2990 ЕД/мл нейтральной протеазы из Bacillus polymyxa. Доказано, что диссоциация биопсии почек человека с использованием этой композиции сред максимизирует жизнеспособность клеток и сохраняет репрезентацию редких и хрупких клеточных популяций40.
  3. Дайте диссоциации произойти в течение 30 минут при температуре 37 °C (нагревательный блок) с прерывистым перемешиванием (рекомендуется закручивание трубок каждые 5 минут).
  4. После диссоциации отфильтровать клеточные суспензии через 35 мкм пробирки с защелкивающимся фильтром.
  5. Промойте ситечко 100% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в соотношении 1:1.
  6. Объедините три суспензии почечных клеток, полученных с помощью биопсии, в одну пробирку объемом 15 мл.
  7. Гранулируйте клетки центрифугированием (400 x g, 5 мин, 4 °C) и повторно суспендируйте их в 1 мл RPMI 1640, содержащем 10% FBS. Эта клеточная суспензия обычно дает 0,8-1,2 ×10-6 клеток.

2. Метаболическое профилирование клеток почек, полученных с помощью биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап метаболического профилирования включает в себя измерение гликолиза (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) в анализаторе метаболической функции, а также внутриклеточных уровней АТФ с использованием коммерческого набора.

  1. Гидратация и калибровка рабочей пластины картриджа
    1. За сутки до забора образца добавьте 200 мкл ddH2O в каждую лунку рабочей пластины картриджа анализатора метаболических функций.
    2. Инкубируйте вспомогательную пластину картриджа в инкубаторе без CO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
    3. В день забора образца удалите ddH2O с помощью аспирации с помощью пастеровской пипетки, подключенной к вакуумной системе, и добавьте 200 μL калибровочного раствора (pH = 7,4) в каждую лунку рабочей пластины картриджа.
    4. Инкубируйте рабочую пластину Cartridge в инкубаторе безCO-2 при температуре 37 °C в течение ночи.
  2. Нанесение клеточного покрытия и получение пробирных сред и стрессорных соединений для измерения метаболических функций
    1. Добавьте 100 мкл RPMI с 10% FBS в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа метаболической функции.
    2. Отделите небольшую аликвоту (например, 10 мкл) клеточной суспензии (полученной на этапе 1) в другой пробирке и окрасьте клетки с помощью трипанового синего красителя для определения жизнеспособности.
    3. С помощью счетной камеры определить концентрацию живых клеток (трипановый синий отрицательный)41 в исходной суспензии.
    4. Засейте клетки в каждую из исследуемых лунок планшета для анализа метаболической функции с плотностью 1,0 х 105 живых клеток/лунка. Этот номер ячейки был определен после оптимизации (см. раздел «Репрезентативные результаты»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не засеивайте клетки ни в один из четырех углов планшета для анализа метаболической функции, так как они используются в качестве заготовок.
    5. Дайте клеткам прилипнуть, инкубируя планшет для анализа метаболической функции в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 в течение ночи (~16 часов).
    6. На следующий день подтвердите под микроскопом, что клетки находятся на минимальном слиянии 70%-80% (здоровый монослой клеток важен для оптимального определения параметров метаболической функции).
    7. Разморозьте аликвоту (40-50 мл) безфеноловой базальной среды при температуре 37 °C в течение не менее 15 минут.
    8. Приготовьте 35 мл исследуемой среды, добавив 2 мМ глутамина (350 μл), 1 мМ пирувата (350 μл) и 5,55 мл глюкозы (385 μл) в 33,915 мл предварительно размороженной базальной среды.
    9. С помощью одноканальной или многоканальной пипетки аккуратно удалите среду RPMI из каждой лунки исследуемой пластины для анализа метаболической функции. Далее добавьте 100 мкл базальной среды для промывания клеток.
    10. Аккуратно удалите базальную среду и добавьте 150 мкл пробирной среды в каждую лунку, включая лунки без клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставление лунок без фильтрующего материала может повлиять на условия влажности в среде планшета и привести к непоследовательным измерениям метаболической функции (дополнительный рисунок 1).
    11. Поместите планшет для анализа метаболической функции в инкубатор безCO2 при температуре 37 °C на ~1 ч (этап акклиматизации). Отнесите картриджную пластину (предварительно инкубированную в калибровочном растворе) обратно в шкаф биобезопасности.
    12. Во время акклиматизации готовят следующие четыре раствора стрессорных соединений в исследуемых средах: 7 мкМ олигомицин (7x, для конечной концентрации 1 мкМ олигомицин); 2,4 мкМ карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон (FCCP) (8x, для конечной концентрации 0,3 μM FCCP); 450 мМ 2-дезоксиглюкозы (2-DG) (9x, для конечной концентрации 50 мМ 2-DG); 10 мкМ Ротенон и 10 мкМ антимицин А (Рот + АА) (10 раз, для конечной концентрации 1 мкМ Рот + 1 μМ АА).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин ингибирует активность АТФ-синтазы и, следовательно, прерывает цепь переноса электронов (ETC). Это снижает OCR и вызванный АТФ-синтазой приток протонов в митохондрии. В результате гликолиз становится основным источником производстваАТФ42. FCCP представляет собой цианидный препарат (отрицательный заряд), который действует как разъединитель окислительного фосфорилирования, привлекая протоны (положительный заряд) и индуцируя непрерывный приток протонов в митохондрии, что обеспечивает потребление кислорода ETC независимо от активности АТФ-синтазы43. 2-ДГ является синтетическим структурным аналогом глюкозы, в котором 2-гидроксильная группа замещена водородом, и выступает в качестве конкурентного ингибитора гликолиза44. Гниль и АК являются ингибиторами комплексов I и III электронно-транспортной цепи соответственно45. Эффекты введения каждого препарата на различных этапах анализа метаболической функции показаны на дополнительном рисунке 2.
    13. Загрузите по 25 мкл каждого препарата в соответствующий порт в верхней части каждой лунки картриджной пластины, включая лунки без ячеек. Загрузите препараты в следующей последовательности: 7x олигомицин (порт A), 8x FCCP (порт B), 9x 2-DG (порт C), 10x Rot + AA (порт D).
    14. Инкубируйте вспомогательную пластину картриджа в инкубаторе без CO2 до тех пор, пока не потребуется настроить анализ метаболической функции.
  3. Определение потребления кислорода и гликолитических норм в клетках почек, полученных в результате биопсии
    1. Убедитесь, что анализатор метаболических функций включен и подключен к программному обеспечению контроллера в дополнительном компьютере.
    2. Запустите программное обеспечение.
    3. Нажмите на кнопку Шаблон > Пусто.
    4. В первой вкладке нажимаем на кнопку Стратегия инъекций. Нажмите на каждую кнопку с буквами A, B, C или D, которые соответствуют четырем портам впрыска. Запишите название препарата, который будет вводиться через каждый порт: олигомицин (порт А), FCCP (порт В), 2-DG (порт С), Rot + AA (порт D).
    5. На второй вкладке определите все условия эксперимента. Нажмите на кнопку Добавить условие , чтобы ввести новое условие. Программное обеспечение автоматически назначит цвет для каждого условия. Нажмите на кнопку Карта тарелок и назначьте каждой лунке соответствующее экспериментальное условие, которое будет окрашено соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре угловые ячейки должны оставаться пустыми (черного цвета), так как они используются для вычитания фонового сигнала.
    6. На третьей вкладке нажмите кнопку «Инъекция» четыре раза, чтобы четыре инъекции (порты A, B, C и D) были добавлены в последовательность. Анализ может быть выполнен с использованием стандартной последовательности инъекций (A, B, C, D), количества измерений (3 базальных измерения + 3 измерения после каждой инъекции) и времени между измерениями (3 мин).
    7. В четвертой вкладке заполните поля с основной информацией об исследовании и нажмите « Выполнить». Лоток откроется, и программное обеспечение попросит пользователя вставить в картридж утилитарную пластину. Обязательно снимите зеленую крышку, прежде чем ставить тарелку на поднос.
    8. После калибровки (~15 минут) лоток снова откроется, и программное обеспечение попросит пользователя снять рабочую пластину картриджа и поместить планшет для анализа метаболической функции на лоток. Снова снимите крышку тарелки перед установкой тарелки на поднос. Утилитарную пластину картриджа можно выбросить.
    9. Анализ завершится примерно через 2 часа. По истечении этого времени сохраните соответствующий файл '.asyr'. Проанализируйте файлы .asyr вычислительно, чтобы изучить кривые ECAR и OCR. Экспортируйте данные в нужный формат.
  4. Измерение содержания ДНК для нормализации данных метаболической функции
    1. Определите количество ДНК в клетках в каждой лунке после анализа метаболической функции с помощью указанного набора для анализа пролиферации клеток (см. Таблицу материалов).
    2. Приготовьте необходимый объем 1x буфера для лизиса клеток, разбавив 20x буфер для лизиса клеток в деионизированной воде.
    3. Для получения стандартной кривой готовят 100 мкл образцов стандартной ДНК бактериофага λ (входит в набор для анализа пролиферации клеток), последовательно разведенных в буфере для лизиса клеток до концентраций в диапазоне 0 нг/мл, 12,5 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 200 нг/мл, 400 нг/мл, 800 нг/мл. Загрузите каждое разведение в разные лунки черного 96-луночного микропланшета.
    4. Приготовьте 1x раствор для связывания красителя, разбавив 400x реагент красителя в 1x буфере для клеточного лиза. Для каждой стандартной лунки кривой и лунки для анализа метаболической функции потребуется 100 μл.
    5. Распределите 100 мкл 1x раствора красителя в первую колонку, которая уже содержит стандарты. ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс до этого момента может быть начат за 30 минут до окончания прогона анализа метаболической функции.
    6. Удалите среду для анализа с планшета для анализа метаболической функции с помощью одноканальной или многоканальной пипетки.
    7. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 мкл 1x раствора для связывания красителя в каждую лунку исследуемой пластины для анализа метаболической функции. Сделайте пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы лизировать клетки, и перенесите содержимое на черную пластину.
    8. Защитите микропланшет от света и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 2-5 минут.
    9. Измерьте интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера с возбуждением на длине волны 480 нм и детектированием излучения на длине волны 520 нм.

3. Измерение содержания АТФ в клетках почек, полученных с помощью биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте количество АТФ в клетках почек, полученных в результате биопсии, используя указанный реагент для обнаружения АТФ и стандарт рекомбинантной АТФ (рАТФ) (см. Таблицу материалов).

  1. Если реагент для обнаружения АТФ заморожен, разморозьте его при температуре 4 °C в течение ночи.
  2. После получения клеточных суспензий, полученных с помощью биопсии, и подсчета клеток, планшет 1,0 x 104 живые клетки/лунка в каждую лунку белого 96-луночного микропланшета, содержащего 100 мкл среды RPMI 1640 с 10% FBS. Оставьте первый столбец микропланшета пустым, так как на следующий день он будет использоваться для загрузки стандартной кривой rATP.
  3. Инкубируйте микропланшет при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение ночи.
  4. На следующий день предварительно подогрейте реагент для обнаружения АТФ до комнатной температуры.
  5. Сгенерируйте стандартную кривую rATP. Готовят 100 мкл образцов стандарта рАТФ, серийно разведенных в PBS до следующих концентраций: 0 нМ, 0,001 нМ, 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1000 нМ.
  6. Загрузите по 50 мкл каждого стандартного образца rATP в первую колонку микропланшета.
  7. Удалите среду RPMI 1640, содержащую 10% FBS, из каждой лунки для исследования на микропланшетах с помощью одноканальной или многоканальной пипетки.
  8. Хорошо промойте каждое исследование 100 μл PBS (предварительно подогретого на водяной бане 37°C).
  9. Удалите PBS и добавьте 50 мкл нового PBS в каждую лунку для исследования.
  10. Добавьте 50 мкл реагента для детектирования АТФ как в стандартную, так и в исследовательскую лунки.
  11. Перемешать, инкубировать при 37 °C в течение 2 мин, а затем при RT в течение 10 мин.
  12. Считывание и запись люминесценции в считывателе микропланшетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рабочий процесс был протестирован на клетках почек, полученных с помощью биопсии здоровых 3-месячных самцов йоркширских свиней. Протокол диссоциации тканей и пластинирования клеток был соблюден в соответствии с вышеизложенным. После того, как клетки прилипли в течение 16 часов, OCR и ECAR были измерены в режиме реального времени в клетках почек свиньи, полученных с помощью биопсии, с использованием анализатора метаболических функций в качестве маркеров митохондриального дыхания и гликолиза соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной статье описан уникальный метод оценки метаболической функции клеток почек, полученный в результате биопсии. Протокол получения суспензий одиночных клеток из свежей биопсии почек был сопряжен с анализом метаболической функции и внутриклеточного уровня АТФ. Гликолиз оценивается путем измерения ECAR, а митохондриальное дыхание — путем измерения OCR. Для оптимизации методики была использована биопсия почек с помощью порина.

Для эффективного изучения биоэн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни один из соавторов не имеет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

AK был поддержан Фондом University Health Network Foundation (награды 579067450776, 579072310776 и 579068260776). SC-F был поддержан программой Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) (2019KPPDF637713 и 24KNIA-1291062).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-дезокси-D-глюкозаSigmaD6134Конкурентный ингибитор гликолиза
5 мл Круглое дно Пробирка из полистирола
, с Сетчатым фильтром Защелкивающаяся крышка		Falcon352235Пробирки для диссоциации
Антимицин А из  Streptomyces  sp.SigmaA8674Ингибитор комплекса III дыхательной цепи
AOF BP ПротеазаVitaCyte003-1000Фермент диссоциации
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)
фенилгидразон (FCCP)		SigmaC2920Развязка окислительного фосфорилирования
CellTiter-Glo 2.0 Анализ, 100 млPromegaG9242Измерение внутриклеточной АТФ
Коллагеназа MAVitaCyte001-2030Фермент диссоциации
CyQUANT Анализ пролиферации клеток, для клеток в культуреInvitrogenC7026Измерение внутриклеточной ДНК
D-ГЛЮКОЗА, безводная, реагент классаBioshopGLU501Метаболический субстрат
ДНКаза Iстволовая клетка07469Фермент
диссоциацииФетальная бычья сыворотка, премиум,
США, инактивированная при нагревании, 500 мл		Wisent080-450Диссоциационная медиадобавка
L-Glutamine-200 mM (100x) жидкая (100 мл)Gibco25030081Метаболический субстрат
Олигомицин АSigma75351Ингибитор АТФ-синтазы
PBS, -/-, 500 млWisent311-010-CLПромывка клеток
rATP,  10 мМ,  0?5 млPromegaP1132Измерение внутриклеточной АТФ
RotenoneSigmaR8875Ингибитор комплекса I дыхательной цепи
RPMI 1640Gibco11875119Диссоциационная среда
Seahorse Wave Controller Программное обеспечение 2.6AgilentN/AНастройка измерений метаболических функций
Seahorse Wave Настольное программное обеспечение 2.6AgilentН/ДАнализ данных метаболической функции
Seahorse XF базовая среда,   без фенола красного, 500 млAgilent103335-100Измерение метаболической функции
Seahorse XFe96 FluxPak  (20 пластин, 18 картриджей, <бр/> и 500 мл калибровочного раствора)Agilent102416-100Измерение метаболической функции
Seahorse XFe96 Анализатор метаболической функцииAgilent101991-100Измерение метаболической функции
Раствор пирувата натрия 100 мМ (100X), жидкость 100 млGibco11360070Метаболический субстрат

Ссылки

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Трансплантация почкиишемически-реперфузионное повреждениезамедленная функция трансплантатаострое повреждение почекмитохондриальное дыханиескорость потребления кислородаоценка гликолизавнутриклеточный уровень АТФ

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.