Целью данной статьи является изучение использования теста на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству для выявления антител IgG и IgM, специфичных для бешенства.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) был разработан для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Этот тест дает быстрые результаты и может быть использован для обнаружения антител к бешенству в нескольких различных сценариях. Тест на бешенство IFA особенно полезен для быстрого и раннего выявления антител для оценки иммунного ответа у пациента, у которого развилось бешенство. Несмотря на то, что другие методы посмертной диагностики бешенства имеют приоритет, этот тест может быть использован для демонстрации недавнего контакта с вирусом бешенства путем обнаружения антител. Тест IFA не дает титра вируснейтрализующих антител (VNA), но ответ на доконтактную профилактику (ДКП) можно оценить по положительному или отрицательному наличию антител. Этот тест может быть использован в различных ситуациях и может дать результаты для ряда различных целей. В этом исследовании мы использовали несколько парных образцов сыворотки крови людей, получавших ДКП и продемонстрировавших наличие у них антител к бешенству с течением времени с помощью теста IFA.
Введение
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) используется для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Это один из арсенала тестов, доступных для наблюдения за посмертным пациентом с бешенством. Это особенно полезно для раннего выявления антител для оценки иммунного ответа пациента на инфекцию бешенства. При использовании в сочетании с другими тестами, историей болезни и статусом вакцинации пациента тест IFA может помочь определить контакт с вирусом бешенства или вакциной1. Поскольку тест IFA измеряет IgM и/или IgG, значения специфических антител могут указывать на приблизительные временные рамки с момента контакта с антигеном1. Этот тест может быть полезен в перечисленных приложениях или других, которые еще не изучены.
Существует несколько серологических тестов на бешенство. Основными методами измерения нейтрализующих антител к вирусу бешенства (РВНК) являются экспресс-тест на ингибирование флуоресцентного фокуса (RFFIT), тест на нейтрализацию вируса бешенства (FAVN) или их модификации. Однако эти тесты не дифференцируют антитела IgM и IgG. Когда дифференциация изотипа антител важна для мониторинга иммунного ответа на бешенство, используются тесты на ИФА бешенства и иммуноферментный анализ на бешенство (ИФА), но они не измеряют РВНК. Несмотря на то, что тесты IFA и ELISA могут быть использованы для определения наличия антител, специфичных для бешенства, в образце существуют некоторые различия в том, как они выполняются. В тесте IFA в качестве антигенного субстрата используется живой вирус, культивируемый в клетках, в то время как типичный ИФА для выявления бешенства использует один или несколько вирусных белков. В лабораторных условиях, где вирус бешенства может быть культивирован, тест IFA может быть более простым вместо покупки или культивирования отдельных вирусных белков для ИФА. Цель тестирования и информация, полученная из результатов любого серологического анализа на бешенство, должны учитываться при принятии решения о том, какой из нихвыбрать.
IgM реагирует первым, увеличиваясь до тех пор, пока не будет наблюдаться смена класса примерно на 28-й день, после чего IgG становится преобладающим циркулирующим антителом3. Следовательно, IgM можно ожидать только в течение ограниченного периода времени после контакта с вирусом бешенства или вакцинации. Тестирование как сыворотки, так и спинномозговой жидкости (ликвора) может показать, был ли контакт через вакцинацию, при которой антитела будут видны только в сыворотке, или от вирусной инфекции, которая потенциально может показать антитела в спинномозговой жидкости1.
Установлено, что антитела к бешенству сохраняются в течение нескольких лет после доконтактной профилактики (ДКП)4. Тест IFA может быть полезным инструментом, чтобы продемонстрировать это в различные моменты времени после вакцинации или контакта.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Следующий протокол был одобрен для этичного использования образцов на людях Центром Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк для разработки анализов, номер одобрения протокола #03-019.
1. Безопасность
- Наденьте средства индивидуальной защиты (СИЗ), как минимум средства защиты глаз (очки или лицевой щиток), хирургическую маску и нелатексные перчатки.
- Убедитесь, что персонал вакцинирован против бешенства и что титр ≥0,5 МЕ/мл был продемонстрирован в течение последних 6 месяцев.
2. Подготовка антигена к предметному стеклу
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все манипуляции с вирусами, спинномозговой жидкостью и сывороткой крови в кабинете биобезопасности (BSC), используя универсальные меры предосторожности.
- Приготовьте 20 мл мышиной нейробластомы или клеток BHK-21 до концентрации 3,0 x 105 клеток/мл в минимально необходимой среде Eagle с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (EGM) и храните в холоде до использования.
- Приготовьте вирус CVS-11 путем разведения в EGM до рабочего разведения 1,0 x 106,5 50% инфекционной дозы тканевой культуры (TCID50) на миллилитр и храните в холоде до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: TCID50 определяется по методу Рида и Мюнха, опубликованному ранее5. - Очистите предметную камеру влажности и хорошо покрытые политетрафторэтиленом (ПТФЭ) предметные стекла микроскопа 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе в BSC.
- Добавьте дистиллированную воду (dH2O) на полоски впитывающей бумаги в камере предметного стекла, чтобы влажность оставалась постоянной на протяжении всей процедуры.
- Карандашом подпишите каждый слайд, который будет использоваться, номером партии, датой, типом ячейки и любой другой идентифицирующей информацией, необходимой для хранения, и поместите его в камеру слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство маркеров, ручек или этикеток не выдержат будущего этапа фиксации ацетона (шаг 2.9). - Нанесите 50 мкл вирусного разведения в каждую лунку на предметных стеклах микроскопа с помощью повторяющейся пипетки. Затем нанесите 50 мкл клеточного разведения на каждую лунку, стараясь не загрязнить наконечник пипетки вирусом, уже находящимся на лунке.
- Закройте камеру влажности и поместите ее во влажный инкубатор при температуре 34-36 °C. Оценивают инфекционность клеток через 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.8-2.12 только на одном слайде. - Извлеките предметное стекло из камеры влажности и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Вымойте предметное стекло в банке Coplin с фосфатным буфером (PBS) в течение 2 минут, затем дайте предметному стеколу высохнуть на воздухе.
- Поместите предметное стекло в банку Coplin и зафиксируйте предметное стекло в холодном ацетоне минимум на 1 час в морозильной камере с температурой -20 °C, разрешенной для легковоспламеняющихся материалов. Все процедуры заливки ацетоном и сушки на воздухе выполняйте в вытяжном шкафу.
- Дайте ацетону испариться и высохнуть. Конъюгат антител прямого действия против бешенства (ДФА), приготовленный в соответствии с инструкцией производителя, нанести на лунки предметного стекла и инкубировать в течение 30 мин во влажном инкубаторе 34-36 °С.
- Вымойте предметное стекло в банках Coplin PBS дважды по 2 минуты каждая. Высушите слайд на воздухе.
- Установите покровное стекло с 0,05 М Tris, 0,15 М NaCl (pH 9,0) и 20% глицериновым креплением и считывают предметное стекло с помощью флуоресцентного микроскопа при 200-кратном увеличении, чтобы оценить инфекционность. Если клетки не инфицированы примерно на 50%, повторяйте шаги 2.7-2.12 на следующий день до тех пор, пока не будет достигнута желаемая инфекционность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекционность клеток аппроксимируется на основе визуальной оценки соотношения отрицательных клеток к бешенству-положительным клеткам на предметном стекле. Отрицательные клетки имеют красный цвет, в то время как положительные клетки имеют зеленое флуоресцентное окрашивание. - Удалите оставшиеся предметные стекла из инкубатора и камеры влажности. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из каждой лунки, затем поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin с PBS на 1-2 минуты. Сушите предметные стекла на воздухе в течение примерно 30 минут. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования.
3. Пробоподготовка
- Подготовьте разведения сыворотки крови пациента или образца спинномозговой жидкости для исследования. Приготовьте необходимый конъюгат для правильной рабочей концентрации, разбавленный в PBS 0,05% синего Эванса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением держите конъюгат в темноте, чтобы сохранить целостность флуорофора
4. Процедура IFA
- Удалите необходимое количество подготовленных антигенных стекол, необходимых для каждого анализа, и дайте предметным стеклам полностью разморозиться и высохнуть.
- Поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin и зафиксируйте их в холодном ацетоне на срок от 2 часов до ночи в морозильной камере с температурой -20 °C, одобренной для легковоспламеняющихся материалов. Выньте предметные стекла из ацетона и дайте высохнуть на воздухе.
- Поместите предметные стекла в коробку с камерой влажности внутри BSC с впитывающими полосками, пропитанными dH2O, для поддержания влажности. Нанесите 50 мкл каждого разведения пробы, контрольного образца или PBS в предварительно определенную лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый предметный камень должен содержать соответствующее количество лунок для образцов пациента, положительный контроль, отрицательный контроль и контрольный колодец PBS. - Поместите закрытую камеру влажности во влажный инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 . Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут, затем извлеките камеру влажности из инкубатора и поместите ее в BSC.
- Используйте наконечник аспиратора, чтобы осторожно отсасывать надосадочную жидкость из каждой лунки, следя за тем, чтобы не нарушить монослой клетки. Используйте стерильную пипетку-капельницу, чтобы нанести по одной капле PBS на каждую лунку.
- Повторите тщательную аспирацию, затем поместите каждое предметное стекло в банку Coplin, наполненную PBS, и промойте дважды в общей сложности 15 минут.
- Поместите предметные стекла обратно во влажную камеру и нанесите 50 мкл соответствующего конъюгата античеловеческих антител на каждую лунку. Повторите шаги 4.4–4.6.
- Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе, установите защитный лист с монтажным материалом и считайте предметные стекла под флуоресцентным микроскопом.
5. Анализ слайдов
- Классифицируйте образцы на основе характера окрашивания и интенсивности флуоресценции в сравнении с положительными контрольными образцами с подтвержденным высоким титром антител к бешенству.
- Оценивайте образцы по шкале отрицательных, 1+, 2+, 3+ и 4+, при этом отрицательный результат показывает отсутствие флуоресцентного окрашивания, а 4+ представляет ярко-зеленую флуоресценцию цвета яблока с рисунком окрашивания, похожим на положительные контрольные образцы1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый цвет яблока относится только к антителам, меченным FITC; Цвет варьируется в зависимости от выбора флуорофора. - Присвойте образцам значение конечной точки, представленное коэффициентом разбавления, при котором образец имеет степень 1-2+. Испытайте образцы с более высоким коэффициентом разбавления, если конечная точка не была достигнута при первоначальном анализе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Все образцы сыворотки крови были взяты у пациентов примерно в те же сроки после приема ДКП. Образцы были протестированы от пяти разных пациентов в следующие моменты времени: через 2 недели после последней прививки вакцины против бешенства, через 6 месяцев после серии вакцинации против бешенства и через 18 месяцев после серии вакцинации против бешенства. Каждый образец сыворотки разбавляли сериями и классифицировали на наличие IgM и IgG, как описано в шагах протокола 5.2 и 5.3. Присвоенное значение антител представляет со...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В тесте IFA используется комплекс антиген-антитело, позволяющий визуализировать антитела, специфичные для бешенства. Клетки нейробластомы или BHK высевают на предметные стекла микроскопа с многолуночным покрытием из ПТФЭ и инокулируют лабораторным штаммом вируса бешенства CVS-11. После того, как монослой сливается и клетки достигают желаемой инфекционности примерно в 50%, предметные стекла хранятся до тех пор, пока они не будут готовы к использованию6.
Сыворотку пациент...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны Центру Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк за поддержку этого проекта.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 25x55 мм стеклянная крышка скользит | любой | ||
| ацетон | любой | ||
| античеловеческий IgG меченый конъюгат | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| античеловеческий IgM меченый конъюгат | SeraCare | 5230-0286 | |
| Аспирационный наконечник пипетки | любой | ||
| BHK-21 Клетки | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Вода для клеточной культуры | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Баночки | для любого | ||
| плода бычьей сыворотки | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Флуоресцентный микроскоп с фильтром FITC | Любой | ||
| глицерин | Sigma-Aldrich | G7893 | Монтант |
| Gullsorb Инактивирующий реагент IgM | Fisher Scientific | 23-043-158 | Инактивирующий реагент IgG |
| L-глутамин | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Минимальный Essential Media Eagle – с Эрлом s, L-глутамин и заменимые аминокислоты, без бикарбоната натрия | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Клетки нейробластомы мыши | ATCC | CCL-131 | |
| Многолуночное покрытие из ПТФЭ стеклянные слайды | Любой | ||
| PBS | Любой | pH 7,6 | |
| Пенициллин | Sigma | P-3032 | EGM |
| Бешенство Прямое флуоресцентное антитело Конъюгат | Миллипор Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100 или RU5500 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Кристаллы хлорида натрия | Sigma-Aldrich | S5886 | Монтант |
| Стерильная пипетка | Любой | ||
| Стрептомицина сульфатная соль | Sigma | S9137 | EGM |
| Тризма предустановленные кристаллы pH 9,0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Монтантный |
| триптозофосфатный бульон | BD | 260300 | EGM |
| Витаминная смесь | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Ссылки
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
