Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65460

⸱

17 ноября 2023 г.

 , 
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Основной организационной единицей эукариотического хроматина является частица ядра нуклеосомы (NCP), которая состоит из ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистона. Хроматин определяется как сущность NCP и многих других белковых комплексов, включая транскрипционные факторы, ремоделирование хроматина и модифицирующие ферменты. До сих пор неясно, как эти белок-ДНК-взаимодействия организуются на уровне специфических геномных локусов на разных стадиях клеточного цикла. В основном это связано с текущими техническими ограничениями, которые затрудняют получение точных измерений таких динамических взаимодействий. В этой статье мы опишем усовершенствованный метод, сочетающий сайт-специфичную рекомбинацию с эффективным одноступенчатым протоколом аффинной очистки для выделения интересующего нас однокопийного гена в его нативном хроматиновом состоянии. Этот метод позволяет надежно обогащать целевой локус с помощью геномного хроматина, что делает этот метод эффективной стратегией для идентификации и количественной оценки белковых взаимодействий непредвзятым и систематическим образом, например, с помощью масс-спектрометрии. В дополнение к такому анализу состава, нативный хроматин, очищенный этим методом, вероятно, отражает ситуацию in vivo в отношении позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов и, следовательно, поддается дальнейшему структурному и биохимическому анализу хроматина, полученного практически из любого геномного локуса у дрожжей.

Введение

Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов1. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует с множеством других важных компонентов, таких как транскрипционные факторы, механизмы обработки ДНК и РНК, архитектурные белки, ферменты, участвующие в ремоделировании и модификации хроматина, и молекулы РНК, связанные с хроматином. Эти важнейшие механизмы, участвующие в транскрипции, репликации и репарации, требуют доступа к хроматину, который служит естественным субстратом для этих процессов. Следовательно, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих трансакций ДНК, требует точного определения коллективных изменений в структуре хроматина в конкретных областях генома, где эти механизмы сходятся и способствуют биологическим реакциям.

Несмотря на идентификацию многочисленных факторов хроматина с помощью генетики и исследований белок-белкового взаимодействия, проведение прямого, непредвзятого и всестороннего анализа взаимодействий хроматина на конкретных участках генома остается существенным препятствием 2,3. Первоначально для масс-спектрометрической идентификации ассоциированных белков 4,5,6,7 можно было выделить только очень распространенные участки генома (т.е. повторяющиеся локусы) или многокопийные плазмиды. Ряд новых подходов, основанных на прямой гибридизации зондов захвата с хроматинизированной ДНК, бесконтактном биотинилировании с использованием системы CRISPR-dCas9 или связывании последовательно-специфических белков-адаптеров с интересующим локусом, начал распутывать протеом однокопийных локусов из геномов дрожжей и млекопитающих 8,9,10. Однако все эти методы требуют сшивания формальдегида для стабилизации белок-ДНК взаимодействий и ультразвуковой обработки для солюбилизации хроматина для последующей очистки. В совокупности обе манипуляции исключают возможность последующих структурно-функциональных исследований очищенного хроматина.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали методологию, которая использует сайт-специфическую рекомбинацию для извлечения целевых хромосомных доменов из дрожжей11,12. По сути, интересующая область генома окружена сайт-специфической R-рекомбиназой из Zygosaccharomyces rouxi и одновременно включает группу из трех сайтов связывания ДНК для прокариотического транскрипционного репрессора белка LexA (LexA) в пределах одной и той же области. Дрожжевые клетки содержат экспрессионную кассету для одновременной экспрессии R-рекомбиназы и белка LexA, соединенного с меткой тандемной аффинной очистки (TAP). После индукции R-рекомбиназы фермент эффективно удаляет целевой участок из хромосомы в виде кольцевого домена хроматина. Этот домен может быть очищен с помощью белка-адаптера LexA-TAP, который связывается с сайтами связывания ДНК LexA, а также с аффинной опорой. Этот метод недавно был использован для выделения отдельных доменов хроматина, содержащих выбранные репликационные источники13-й хромосомы дрожжей.

Одним из основных преимуществ этого подхода ex vivo является то, что он позволяет проводить функциональный анализ изолированного материала. Например, репликационные исходные домены, очищенные с помощью этого метода, могут быть подвергнуты анализу репликации in vitro для оценки эффективности возбуждения исходного сырья в пробирке из нативных хроматиновых матриц in vivo . В конечном счете, биохимическая и функциональная характеристика выделенного материала может позволить восстановить ядерные процессы с использованием очищенных белков вместе с нативным хроматиновым шаблоном. Таким образом, эта методология открывает захватывающие возможности в исследовании хроматина, поскольку можно будет проследить коллективные изменения состава и структуры хроматина в определенной области генома, претерпевающей определенную хромосомную трансакцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе. В таблице 1 приведен список используемых решений, буферов и носителей.

1. Построение штамма рекомбинантных дрожжей

  1. Чтобы сконструировать рекомбинационно-компетентный штамм дрожжей, трансформируют SbfI-переваренную плазмиду K238 в штамм дрожжей с интегрированными LexA-связывающими сайтами и сайтами рекомбинации RS в интересующем локусе13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированный фрагмент рестрикции SbfI содержит необходимую экспрессионную кассету для конститутивной экспрессии белка слияния LexA-TAP и R-рекомбиназы вместе с гомологичными последовательностями хромосомы I дрожжей для геномной интеграции экспрессионной кассеты путем гомологичной рекомбинации (рис. 1).
  2. Для создания контрольного штамма берут изогенный штамм дрожжей, в котором отсутствуют интегрированные RS- и LexA-связывающие сайты, и трансформируют его с SbfI-расщепленной плазмидой K238 в тех же условиях, что и для рекомбинационно-компетентного штамма.
  3. Выберите компетентные дрожжевые клетки на основе маркера отбора LEU2 на агаровых пластинах SCD-LEU14.

2. Связывание антител IgG с эпоксидно-активированными магнитными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините антитела IgG с магнитными шариками, активированными эпоксидной смолой, в соответствии со следующим опубликованным протоколом11.

  1. Суспендировать 300 мг гранул, активированных эпоксидной смолой, в 10 мл 50% ацетона (300 мг соответствует ~5,1 ×10 10 шариков) в конической пробирке объемом 50 мл. Энергично встряхните на вихревом миксере.
  2. Центрифугируют пробирку с гранулами при 820 × г и 4 °C в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость.
  3. Промойте шарики 3 раза 20 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4). Удаляйте надосадочную жидкость после каждого этапа промывки центрифугированием, как описано в шаге 2.2.
  4. Суспендируйте шарики в 16 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) и осторожно вращайте в гибридизационной печи в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Растворите IgG кролика (100 мг) в 7 мл dH2O (конечная концентрация: 14 мг/мл).
  6. Центрифугируют суспензию IgG при 13 000 × г и 4 °C в течение 10 мин для осветления суспензии.
  7. Переложите 3,5 мл надосадочной жидкости (что соответствует 50 мг кроличьих IgG) в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
  8. Раствор IgG разбавляют 9,85 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 7,4) с последующим добавлением по каплям 6,65 мл 3 М сульфата аммония в 0,1 М фосфата натрия (рН 7,4) при осторожном перемешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте быстрого добавления сульфата аммония в раствор, так как высокая локальная концентрация соли вызовет осаждение IgG кролика.
  9. Центрифугируют раствор IgG при 820 × g и 4 °C в течение 3 мин и добавляют полученную надосадочную жидкость к суспензии магнитного шарика.
  10. Инкубируйте пробирку в течение ночи или не менее 18 ч при 30 °C при осторожном вращении в гибридизационной печи.
  11. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
  12. Промойте шарики 20 мл 100 мМ глицина-HCl (рН 2,5). Быстро удалите раствор, как описано в шаге 2.2, чтобы избежать денатурации полипептидов IgG.
  13. Промойте бусины один раз 20 мл 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8). Аспирируйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
  14. Добавьте 20 мл 0,1М раствора триэтиламина в течение 5-10 мин при осторожном вращении для инактивации остаточных реакционноспособных эпоксидных групп. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
  15. Промойте бусины 4 раза 20 мл PBS (pH 7,4) в течение 5 минут с легким вращением. Удаляйте надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2, после каждого этапа стирки.
  16. Промойте бусины 2 раза 20 мл PBS (pH 7,4) с 0,5% Triton X-100 (w/v) в течение 5 минут и 15 минут каждый при осторожном вращении в гибридизационной печи. Удалите надосадочную жидкость, как описано в шаге 2.2.
  17. Суспендировать шарики в конечном объеме 16 мл PBS (pH 7,4) с 0,02% азида натрия (w/v). Хранить в виде аликвот по 1 мл при температуре 4 °C до использования.

3. Культивирование и сбор дрожжевых клеток

  1. Высейте контрольные и рекомбинационные компетентные штаммы дрожжей с планшетов YPD в 5 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
  2. Высейте 2 мл этой культуры в 100 мл среды YPR и инкубируйте в течение ночи при 30 °C и 200 об/мин.
  3. Для каждого штамма дозируют 1 800 мл автоклавной среды YP и 200 мл автоклавного раствора рафинозы (20% по массе) в каждую из двух 5-литровых колб Эрленмейера (всего 4 л питательной среды для каждого штамма, разделенных на две колбы).
  4. Посев растущих дрожжевых клеток при наружном диаметре600 0,2 в соответствующую среду и инкубируют, как описано в шаге 3.1, в течение примерно 6 ч или до тех пор, пока клетки не достигнут желаемого наружного диаметра600 1,0. Чтобы обеспечить нормальный рост клеток, свободных от каких-либо загрязнений, проверяйте наружный диаметр с интервалом в 2 часа.
  5. Добавьте 200 мл галактозы (20% по массе), чтобы индуцировать сайт-специфическую рекомбинацию.
  6. Добавьте 110 мкл (50 нг/мл) YMCA (одновременно с галактозой, шаг 3,5), чтобы остановить клетки в фазе G1, и инкубируйте в течение 2 ч.
    Примечание: Добавление YMFA к клеткам зависит от условий эксперимента и биологического вопроса, который необходимо решить. В частности, для этого эксперимента клетки задерживаются в фазе G1 для получения однородной клеточной популяции с лицензированным репликационным происхождением; в этом процессе пререпликативный комплекс связывается с источниками в фазе G1 до начала репликации ДНК в фазе S.
  7. Переложите клеточную суспензию в центрифужные ведра объемом 1 л и центрифугируйте при температуре 6 000 × г и температуре 4 °C в течение 10 мин. Надосадочную жидкость выбросить, и повторно суспендировать клеточные гранулы в общем объеме 10-15 мл dH2O.
  8. Запечатайте шприц объемом 25 мл пробкой Луэра и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл, наполненную водой. Переложите клеточную суспензию в шприцевой узел и центрифугируйте при 2,397 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Выньте пробку Люэра из шприца и выдавите клетки в жидкий азот, чтобы сформировать клеточные «спагетти».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 4 л питательной среды обеспечивает влажную массу конечных клеточных гранул 7-10 г.
  10. Переложите спагетти с замороженными клетками в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при температуре −80 °C до дальнейшего использования.

4. Очистка локуса хроматина

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 приведен схематический обзор этапов, выполняемых в этом протоколе локус-специфической очистки хроматина.

  1. Охладите коммерческую кофемолку, измельчив 30-50 г сухого льда, энергично встряхивая кофемолку 2 раза в течение 30 секунд каждый раз. После охлаждения выбросьте порошок сухого льда.
  2. Смешайте 3 г замороженных спагетти с дрожжами с ~30-50 г сухого льда в предварительно охлажденной кофемолке.
  3. Загерметизируйте стык между крышкой и измельчителем парапленкой, чтобы предотвратить потерю порошка дрожжевых клеток во время измельчения.
  4. Измельчите смесь дрожжевых клеток и сухого льда 10 раз в течение 30 секунд каждый раз, с интервалом 30 секунд между каждым раундом (общее время: ~10 минут). Чтобы сухой лед и клеточный порошок не прилипали к стенкам кофемолки, постоянно постукивайте по стенкам кофемолки во время измельчения.
  5. Переложите полученную дрожжевую клетку-сухой порошок льда в пластиковый стакан с помощью чистой и сухой лопатки.
  6. Держите стаканы при комнатной температуре, чтобы испарился сухой лед.
  7. Как только сухой лед испарится, добавьте 2,25 мл буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы (750 мкл/г дрожжевых клеток) в порошок дрожжевых клеток.
  8. Энергично пипетируйте клеточно-буферную смесь, чтобы обеспечить полную суспензию клеток с буфером, и перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл.
  9. Возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%) из полученной клеточной суспензии (экстракты сырых клеток [CCE]). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
  10. Переложите клеточную суспензию в реакционные пробирки объемом 2 мл с низким связыванием и центрифугируйте при 21 130 × г в течение 30 мин при 4 °C, чтобы отделить клеточный мусор от сырого клеточного лизата.
  11. Смешайте надосадочную жидкость из всех пробирок в одну коническую пробирку объемом 15 мл.
  12. Возьмите образцы из надосадочной жидкости (вход [IN]) для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
  13. Уравновешивают 500 мкл суспензии магнитных шариков, связанных с IgG (для каждого штамма дрожжей), промывая 2 раза 500 мкл холодного буфера MB с 1 ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 5 мин каждый при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Удаляйте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной решетки после каждого этапа стирки.
  14. Инкубируют магнитные шарики, связанные с IgG, в 500 мкл холодного буфера MB с 1x ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 1 ч при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Выбросьте надосадочную жидкость из бусин с помощью магнитной стойки.
  15. Смешайте уравновешенную суспензию магнитных шариков с клеточным лизатом и инкубируйте при вращении при 20 об/мин в течение 2 ч при 4 °C.
  16. Перенесите полную суспензию лизата магнитных шариков в реакционные пробирки с низким связыванием.
  17. Отделите магнитные шарики, несущие интересующие кольца хроматина, от клеточного лизата с помощью магнитной стойки.
  18. Перелейте оставшуюся проточную часть (FT) из каждой пробирки в свежую коническую пробирку объемом 15 мл и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
  19. Суспендируйте магнитные шарики из каждой пробирки в 300 мкл холодного буфера MB и объедините шарики в одну реакционную пробирку. Промыть 5 раз по 10 мин каждый с 750 мкл холодного буфера MB с 1 ингибитором протеазы и фосфатазы при 4 °C при вращении при 20 об/мин. Окончательную промывку проводят 750 мкл холодного буфера MB без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
  20. Суспендировать шарики в 40 мкл холодного буфера МБ без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем элюата может быть скорректирован в соответствии с его предполагаемым последующим применением. Элюирование ТЭВ обычно эффективно работает в диапазоне 100-300 мкл.

5. Протеаза-опосредованное элюирование ТЭВ

  1. Чтобы высвободить кольцевые комплексы хроматина LexA-CBP из гранул, инкубируйте гранулы с 2 мкл 6-кратной рекомбинантной протеазы ТЭВ, помеченной His, в течение ночи при 4 °C и 450 об/мин в термомиксере.
  2. Отделите бисер от готового элюата с помощью магнитной стойки. Переложите элюат, содержащий расщепленные кольца хроматина, в новую реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
  3. Снова поместите пробирки на магнитную решетку, чтобы отделить остатки гранул от конечного элюата.
  4. Ресуспендант гранул (TB) в 750 мкл холодного буфера переменного тока и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
  5. Из окончательного элюата (TE) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%). Хранить при температуре −20 °C до дальнейшей обработки (описанной в разделе 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за малого объема конечного элюата процент образцов, собранных для анализа ДНК и белка, увеличивается, чтобы получить лучшее представление о содержании белка и ДНК в них во время анализа.

6. Элюирование денатурации

  1. Промыть шарики 2 раза в 750 мкл холодного буфера переменного тока в течение 20 минут каждый раз при 4 °C при вращении при 20 об/мин.
  2. Для извлечения оставшихся связанных комплексов LexA-хроматина проводят денатурационное элюирование, добавляя к гранулам 500 мкл 0,5М NH4OH, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Отделите гранулы от суспензии с помощью магнитной стойки и перенесите элюат в реакционную пробирку с низким связыванием.
  4. Снова инкубируйте шарики, как показано на шаге 6.2, чтобы восстановить максимальное количество локусов хроматина в элюате.
  5. Отделите шарики от суспензии с помощью магнитной стойки и соберите полученный элюат в ту же пробирку, содержащую элюат из шага 6.3.
  6. Ресуспендируйте шарики (DB) в 750 мкл dH2O и возьмите образцы для анализа ДНК (0,1%) и белка (0,05%).
  7. Из конечного элюата (ДЭ) берут образцы для анализа ДНК (0,5%) и белка (0,25%).

7. Анализ ДНК и белков

  1. Анализ ДНК
    1. Пробоподготовка
      1. К образцам ДНК добавляют 100 мкл буфера IRN и увеличивают объем dH2Oдо конечного объема 200 мкл.
      2. Добавьте 1 нг спайковой плазмидной ДНК K071.
      3. Добавьте 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
      4. Добавьте 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и 10 мкл SDS (20%) и инкубируйте в течение 1 ч при 56 °C.
      5. Добавьте 200 мкл фенола/хлороформа/изопропилового спирта (25:24:1) и тщательно перемешайте 2 раза в течение 10 секунд каждый раз.
      6. Центрифугируют образцы при 21 130 × г в течение 7 мин для разделения органической и водной фаз.
      7. Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1,5 мкл гликогена (5 мг/мл) и 2,5 100% этанола.
      8. Инкубируйте пробирки при температуре −20 °C не менее 2 ч и не более ночи до осаждения ДНК.
      9. Центрифуга при 21 130 × г, 4 °C в течение 45 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
      10. Добавьте 150 мкл 70% этанола без ресуспендирования гранулы ДНК и снова центрифугируйте при 21 130 × г при 4 °C в течение 10 мин.
      11. Высушите гранулы ДНК при комнатной температуре в течение 10-15 мин и ресуспендируйте в 40 мкл dH2O.
      12. Выполните расщепление ферментом рестрикции для линеаризации ДНК, выделенной на этапе 7.1.1.11, эндонуклеазой рестрикции HpaI. Для реакционной смеси объемом 50 мкл инкубируют 40 мкл изолированной ДНК + 2 мкл фермента HpaI + 5 мкл буфера фермента рестрикции + 3 мкл dH2O в течение ночи при 37 °C.
    2. кПЦР-анализ
      1. Разбавляют рестрикционно-расщепленную ДНК в соотношении 1:5 (10 мкл рестрикционно-расщепленной ДНК, полученной на стадии 7.1.1.12, в 40 мкл dH2O).
      2. Используйте пары праймеров, предназначенные для области ARS316, PDC1 и спайковой плазмидной ДНК.
      3. Запустите qPCR с помощью программы, приведенной в таблице 2.
      4. Анализируйте результаты кПЦР путем относительного количественного определения, используя область ARS316 и спайковую плазмидную ДНК в качестве мишеней и PDC1 (или любой другой ген или область генома) в качестве референсного локуса.
      5. Оцените процент извлечения локуса ARS316 по сравнению с PDC1 путем нормализации относительных количественных значений праймеров ARS316 и PDC1 на процент объема фракции, взятой для каждого образца. Например, умножьте 0,1% для проточного значения на коэффициент 1 000 и 0,5% для элюирования ТЭВ на коэффициент 200.
      6. Нормализуйте проценты восстановления ARS316 и PDC1 с помощью относительных количественных значений спайковой плазмидной ДНК.
      7. Оцените обогащение локуса ARS316 по общему хроматину, оценив полученные относительные количественные целевые/референсные значения с помощью уравнения (1).
        figure-protocol-1(1)
    3. Анализ Саузерн блоттинг
      1. К 20 мкл образца ДНК, расщепленного ферментом рестрикции, добавляют 5 мкл красителя с гелевой загрузкой.
      2. Прогонят образцы в 1% агарозном геле при 110 В в течение ~3 ч.
      3. Переложите гель на лоток и замочите его в растворе для депурирования при легком встряхивании на 20 минут.
      4. Смойте гель dH2O и замочите его в денатурационном растворе на 15 минут при встряхивании. Раствор для денатурации выбросьте.
      5. Замочите гель в денатурационном растворе на 15 мин при легком встряхивании.
      6. Смойте гель dH2O и промывайте его 2 раза в течение 15 минут каждый раз с помощью буфера для переноса с легким встряхиванием.
      7. Наполните лоток 1-1,5 л буфера для перекачки и поставьте его на устойчивую платформу.
      8. Отрежьте длинный кусок ватмана и положите его на платформу таким образом, чтобы два конца бумаги пропитались буфером для переноса.
      9. Отрежьте одну полоску положительной нейлоновой мембраны и четыре полоски ватмана, равные размеру геля.
      10. Положите на платформу два листа ватмана, смоченных в буфере для переноса.
      11. Положите гель лицевой стороной вниз на кусочки ватмана.
      12. Поверх геля положите положительную нейлоновую мембрану, а затем оставшиеся два кусочка ватмана, смоченные в трансферном буфере. Следите за тем, чтобы стек оставался влажным с буфером передачи.
      13. Удалите все застрявшие пузырьки воздуха, скрутив их стеклянной палочкой.
      14. Положите стопку бумажных полотенец поверх собранной стопки, а затем предмет весом 0,5 кг (например, стеклянную бутылку).
      15. Оставьте сборку для переноса на ночь при комнатной температуре.
      16. После переноса мембрану сшивают с помощью УФ-излучения с общей выходной энергией 1 200 Дж/см2.
      17. Для детектирования локуса ARS316 проводят южную блот-гибридизацию с использованием радиоактивных зондов, синтезированных с использованием референсной системы мечения ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все дальнейшие действия на льду, если не указано иное.
      18. В реакционной пробирке с низким связыванием разводят 25-40 нг ПЦР-фрагмента (зонда) в 19 мкл dH2O и инкубируют при 95 °C в течение 5 мин. Остудить сразу на льду.
      19. Добавьте в пробирку по 1 мкл 500 мкМ dCTP, 500 мкМ dGTP и 500 мкМ dTTP.
      20. Добавьте 20 мкл буфера, содержащего случайные нуклеотидные гексамеры, поставляемые в комплекте.
      21. Добавьте в пробирку 5 мкл радиоактивно меченого нуклеотида [α-32P] dATP. Выполняйте все действия, связанные с радиоактивно меченым материалом, в защищенной среде, одобренной для радиоактивности.
      22. Добавьте 1 мкл фрагмента Кленова и инкубируйте при 37 °C на термомиксере в течение 15 мин для синтеза одноцепочечной ДНК.
      23. Добавьте 5 мкл стоп-буфера, чтобы остановить реакцию.
      24. Центрифугируйте колонку исключения размера в течение 2 минут при 1 500 × g , чтобы удалить буфер хранения. Отбросьте поток и поместите колонку в новую трубку.
      25. Пропустите зондовую смесь через колонку, чтобы удалить неинкорпорированные радиоактивные нуклеотиды. Центрифуга в течение 30 с при давлении 1 500 × г для сбора зонда.
      26. Добавьте 150 мкл ДНК сперматозоидов лосося (1:100), чтобы заблокировать неспецифическое связывание зонда с мембраной.
      27. Инкубируйте смесь зондов при 95 °C в течение 5 мин для денатурации двухцепочечной ДНК.
      28. Заморозьте на льду в течение нескольких секунд и центрифугируйте в течение нескольких секунд при 500 × г , чтобы капли воды конденсировались на крышке.
      29. Кратковременно промывают южную блоттинговую мембрану буфером для гибридизации в течение 5-10 мин с ротацией.
      30. Предварительно гибридизируют мембрану с буфером для гибридизации в течение 1 ч при 55 °C с вращением. Откажитесь от буфера гибридизации.
      31. Добавьте 15 мл свежего буфера для гибридизации (предварительно подогретого до 55 °C) в мембрану вместе с подготовленным зондом. Инкубируйте мембрану в течение ночи при температуре 55 °C с вращением.
      32. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,3x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
      33. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 0,1% SDS при 55 °C с вращением.
      34. Выполните постгибридизационные промывки 2 раза по 15 мин каждая с 0,1x SSC, 1,5% SDS при 55 °C с вращением.
      35. Снимите мембрану с гибридизационной пробирки и подвергните мембрану воздействию люминографического экрана на срок до 3 дней, чтобы получить радиоактивные отпечатки на пленке.
      36. Получение изображений пленки с помощью системы лазерного сканирования с люминографической визуализацией.
  2. Анализ белков
    1. Пробоподготовка
      1. Отрегулируйте все образцы белка до их окончательных объемов (200 мкл, 100 мкл, 100 мкл, 20 мкл и 20 мкл для образцов экстракта сырых клеток, входных, проточных, гранул и элюата соответственно), добавив 1 мкл β-меркаптоэтанола, буфер для образцов PAGE LDS (1x) и dH2O.
      2. Денатурируют образцы при 95 °C в течение 5 мин.
    2. Вестерн-блоттинг-анализ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг по стандартным протоколам15,16.
      1. Загрузите 15 мкл каждого образца в каждую лунку геля SDS-PAGE толщиной 1,5 мм.
      2. Проводят иммуноокрашивание блота с использованием антител PAP (1:2 000) и LexA (1:1 000) с ночной инкубацией при 4 °C. Развести в 5% растворе сухого молока/ПБСТ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После ПАП-анализа блот может быть удален с помощью протокола мягкой стриппинга17 перед иммуноокрашиванием вторым антителом LexA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Очистка домена хроматина ARS316 ~1,4 kb была опосредована конститутивно экспрессируемым белком-адаптером LexA-TAP. В качестве отрицательного контроля мы проводили очистки с использованием изогенного штамма, экспрессирующего LexA-TAP, но не содержащего интегрированных RS и LexA-связывающих сайтов. На рисунке 3 показаны результаты анализа ДНК стандартного эксперимента по очистке, проведенного как на контрольном, так и на рекомбинационно-компетентном штамме, нацеленном на локус ARS316. После вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Идентификация факторов и хроматинового ландшафта конкретной целевой области генома по-прежнему представляет собой серьезную проблему в исследованиях хроматина18. Этот протокол описывает эффективную систему специфического удаления и очистки различных доменов хроматина из хромосом дрожжей. Насколько нам известно, чистота и выход этой одноступенчатой очистки преодолевают многие ограничения локус-специфических методов очистки хроматина, что позволяет достичь очень высокого обогащения целевых локусов п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Работа в лаборатории S.H. поддерживалась DFG через SFB1064 (идентификатор проекта 213249687), Европейским исследовательским советом (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) и Обществом Гельмгольца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>штаммы дрожжей
<сильный>контрольный штамм: MATa; ura3Δ 0; леу2 и дельта; 0; его3&Дельта; 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRSection 1, см. ссылки 13 и 14
Recombination Strat: MATa; ura3Δ 0; леу2 и дельта; 0; его3&Дельта; 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRРаздел 1, см. ссылку 13 и 14
Plasmid
K238 Секция1, см. ссылку 13
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
K071 Спайковая плазмиднаяРаздел 7.1, см. ссылку 13
Хранение: Хранить при -20 °de; C
<стронг>реагенты
ацетонCarl Roth5025.1Раздел 2
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Ацетат аммония (NH4Ac)Sigma AldrichA7262Раздел 6 и 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Раствор аммония (NH4OH) 25%Merck Millipore533003Раздел 6
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Сульфат аммонияSantaCruz Sc-29085Раздел 2
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Bacto agarBD (VWR)90000-760Раздел 3
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Bacto peptoneBD (VWR)211820Раздел 3
Хранение: Хранить при комнатной температуре
β-МеркаптоэтанолSigma Aldrich07604Раздел 7.2
Хранение: Хранить при 4 °deg; C
Комплект хемилюминесцентной подложкиThermoFisher34580Section 7.2
Хранение: Хранить при температуре 4 °°; C
Ди-натрия гидрофосфат додекагидратMerck1.06579.1000Секция 2 и 7,1<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Дитиотреитол (ДТТ)ThermoFisher15508013Секция 4<бр/> Хранение: Хранить при температуре 4 °°; C
ЭтанолMerck100983Раздел 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma AldrichED Раздел7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Галактоза (20% (по объему)SigmaAldrichG0625-1KG  /  5KGРаздел 3
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Гель загрузка красителя (6 шт)BioLabsB7024AРаздел 7.1
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
GlusoseSigma-AldrichG8270Секция<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
ГлицинCarl Roth.0079.4Секция 2<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Гликоген (5 мг/мл)ИнвитрогенAM9510Секция 7.1<бр/> Хранение: Хранить при -20 °°; C
Соляная кислота (HCl)PanReac AppliChem182109.1211Раздел 2, 4 и 7.1
Хранение: Хранение при комнатной температуре
Ацетат магния (MgAc)Bernd Kraft15274.2600/C035Раздел 4
Хранение: Хранение при комнатной температуре
Хлорид магния (MgCl2)Sigma AldrichM8266Раздел 6
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Nu PAGE LDS буфер для образцов (4x)Invitrogen2399549раздел 7.2
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1 v/v)Invitrogen15593-031Раздел 7.1
Хранение: Хранить при температуре 4 °°; C
Хлорид калия (KCl)SigmaP9541Раздел 4
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Радиоактивно меченый α-32P dATP (3,000 Ки/ммоль, 10 мКи/мл)Hartmann AnalyticSRP-203Раздел 7.1
Хранение: Хранить при 4°С; C
Система маркировки RadPrimeThermoFisher18428-011Раздел 7.1
Хранение: Хранить при температуре -20 °°;
C Рафиноза (20% (w/v) запасы)SERVA34140.03Раздел 3
Хранение: Хранение при комнатной температуре
Хлорид натрия (NaCl)MerckK53710504142Раздел 7.1
Хранение: Хранение при комнатной температуре
Цитрат натрия (Na3C6H5O7)Sigma-Aldrich71402Раздел 7.1
Хранение: Хранение при комнатной температуре
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma AldrichS5881Section 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
N-додецилсульфат натрия (SDS) (5% запаса (w/v) )Alfa Aesar A11183Section 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Одноосновной фосфат натрияSigma-Aldrich71496Section 2 and 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Sodium  азидСанта Круз  Биотехнологияsc-208393Раздел 2
Хранение: Хранить при температуре -20 °° С
  ТриэтиламинSigma Aldrich90340Секция 2<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Трис БазаChem CruzSC-3715BСекция 2 и 4<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Тритон Х-100Сигма ОлдричХ100Секция 2 и 4<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Tween-20Bernd Kraft18014332Раздел 4
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Дрожжевой экстрактBD (VWR)212720Раздел 3
Хранение: Хранить при комнатной температуре
Фактор спаривания дрожжей альфа (1 &m; г/мл акций )  BiomolY2016.5Section 3
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
Дрожжи Синтетическая среда Добавки без LEUCINESigma AldrichY1376Раздел 1, см. ссылку 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)NEBR0105SРаздел 7.1
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; Коктейль из
ингибиторов протеазы и фосфатазы C (100x)ThermoFisher Scientific78446Section 4
Хранение: Хранить в4 ° C
Proteinase K (10 мг/мл)SERVA33756Section 7.1
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; С
РНКаза А (10 мг/мл) ThermoFisherEN0531Section 7.1
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
протеаза TEV (10000 U/&микро; L)NEBP8112SSection 5
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
Materials
bcMag Эпоксидные активированные магнитные шарикиBioclone Inc.FC-102Секция 2<бр/> Хранение: Хранить при температуре 4 °°; C
Сухой ледСекция 4
Центрифужные пробирки с низким связыванием 2,0 млEppendorf22431102Секция 4
Microspin  G-25 КолонкиЦитива27-5325-01Раздел 7.1<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
Парапленка MerckP7793Секция 4
Положительная нейлоновая мембранаBiozol11MEMP0001Секция 7.1<бр/> Хранение: Хранить при комнатной температуре
ПВДФ Передаточная мембрана Immobilon-MerckMilliporeIPVH00010Секция 7.2<бр/> Хранение: Хранить в комнате температура
SDS-PAGE гель 4-12% бис-трис (15 лунок, 1,5 мм)Invitrogen  NP0336BOXРаздел 7.2
Хранение: Хранить при температуре 4 °deg;
C Шприц (25 мл) с люэровским фитингомHenke Sass Wolf4200-000V0Раздел 3
Ватман Бумага (Grade 3MM CHR Целлюлозный Западный Промокательный ЛистCytiva3030-917Раздел 7.1
Хранение: Хранить при комнатной температуре
<сильные>Антитела
Anti-LexA, кроличий поликлональный IgG, антитела к ДНК-связывающей областиMerck Millipore06-719Section 7.2
Хранение: Хранить при температуре -20 °°°; C
Goat Anti-rabbit IgG (H+L), конъюгат пероксидазы хренаInvitrogenG21234Раздел 7.2
Хранение: Хранить при -20 °°; Антитело к
пероксидазе C Антипероксидаза (ПАП) вырабатывается у кроликов для обнаружения TAP-меченых белковSigma AldrichP1291-500ULРаздел 7.2
Хранение: Хранить при температуре -20 °°; C
Антитела IgG кроликаSigmaI5006-100MGСекция 2<бр/> Хранение: Хранить при температуре 4 °°;
Капсюли CPrimers (10 & микро; M)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCTCTSection 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT, раздел 7.1
<сильно>ПЦР фрагмент из геномной ДНК дрожжей в качестве матрицы   для амплификации ARS316 (для южного блота): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                                                                  rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAATРаздел 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGTРаздел 7.1
Оборудование
КофемолкаGastroback42601Секция 4
колба ДьюараNAL GENE4150-2000Секция 3
Магнитный штатив DynaMag TM-2Invitrogen12321DСекция 4, 5 и 6
Гибридизационная печьHybaid Mini10Ri418Секция 2
МикроцентрифугаEppendorf5424RСекция 4 и 7.1
УФ-сшивательAnalytikjena95-0174-02Секция 7.1
ДНК Бумаги)

Ссылки

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674(2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111(2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.