Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Клеточный скрининг лекарственных препаратов на наличие ингибиторов аутофагии, связанной с 4B цистеин-пептидазой

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65464

⸱

30 июня 2023 г.

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2Department of Human Medicine, Medical School Berlin

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.

Аннотация

Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.

Введение

Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы 1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям 2,3,4. Аутофагия также была идентифицирована как клеточная стрессовая реакция, связанная с несколькими заболеваниями, такими как нейродегенеративные расстройства, патогенные инфекции и различные виды рака. Функция аутофагии при раке сложна и зависит от типа, стадии и состояния опухоли. Он может подавлять опухолегенез путем аутофагической деградации поврежденных клеток, но также может способствовать выживанию прогрессирующих опухолей, улучшая выживаемость клеток во время стрессовых условий, таких как гипоксия, недостаток питательных веществ и цитотоксическое повреждение 2,4,5,6.

Несколько исследований показали, что ингибирование аутофагии обеспечивает преимущества в качестве противоопухолевой стратегии. Таким образом, ингибирование критических этапов, таких как образование аутофагосом или его слияние с лизосомой, может быть эффективным методом борьбы с раком 2,4,5,6. Растущее количество доказательств показало, что ATG4B участвует в определенных патологических состояниях, и он привлек внимание как потенциальная противораковая мишень 2,3,4. Например, было замечено, что клетки колоректального рака и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-положительные клетки рака молочной железы имели значительно более высокие уровни экспрессии ATG4B, чем соседние нормальные клетки 2,4. В клетках рака предстательной железы ингибирование ATG4B приводило к специфической для клеточной линии восприимчивости к химиотерапии и лучевой терапии7. В последнее время появились убедительные доказательства того, что протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) особенно уязвима к ингибированию ATG4B. Например, на генетически модифицированной мышиной модели было показано, что периодическая потеря функции ATG4B снижает рост опухоли PDAC и увеличивает выживаемость 3,4. В целом, ATG4B имеет высокую гиперэкспрессию при некоторых типах рака, связан с прогрессированием опухоли и связан с резистентностью к терапии рака 2,4,8.

Цистеиновые протеазы ATG4 у млекопитающих имеют четыре члена семейства, ATG4A-ATG4D. Эти белки проявляют некоторую целевую селективность по отношению к семейству белковLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 и могут иметь дополнительные функции, не связанные с их протеазной активностью 12,13. Кроме того, ATG4 функционирует в регуляции нового типа посттрансляционной модификации — ATG8-илирования белков11,12. В то время как ATG4B и его основной субстрат LC3B являются наиболее широко изученными, вырисовывается картина, которая предполагает сложную роль каждого члена подсемейства в регуляции аутофагических и неаутофагических процессов. Это также подтверждается сложной сетью посттрансляционных модификаций, которые регулируют активность ATG4B посредством фосфорилирования, ацетилирования, гликозилирования и нитрозилирования 9,10,11,12,13.

Несколько известных ингибиторов ATG4B были опубликованы 2,4,14,15. Несмотря на то, что они пригодны в качестве исследовательских инструментов, их фармакодинамический профиль, селективность или эффективность пока не позволяют разрабатывать их в качестве кандидатов на доклиническую стадию 4,16. В целом, существует острая необходимость в выявлении более мощных и селективных соединений. Часто эти соединения являются хорошими биохимическими ингибиторами функции белка, но их эффективность в клеточных анализах низкая. Существует несколько тестов для мониторинга активности ATG4B, включая биохимические методы и клеточные анализы4. Ранее мы разработали простой, основанный на люминесценции, высокопроизводительный анализ для мониторинга активности ATG4B в клетках 8,17. В этом анализе используется белок люциферазы из Gaussia princeps (GLUC), который стабилен и активен во внеклеточной среде и может быть индуцированно высвобожден из клеток в ответ на протеолитическую активность ATG4B18,19.

В этой репортерной конструкции dNGLUC связан с актиновым цитоскелетом клеток. Между β-актиновым якорем и dNGLUC может быть введен протеаза-специфический линкер, что делает секрецию зависимой от расщепления линкера. Мы использовали полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC, чтобы иметь возможность контролировать расщепление LC3B17,18,19. Хотя механизм секреции dNGLUC плохо изучен, он специфичен для мониторинга активности ATG4B, не зависит от общей аутофагии, как это происходит в нокаут-клетках ATG5, и опосредован нетрадиционными механизмами, не требующими классического сигнального пептида 4,18,19. Мы успешно использовали этот репортер для скрининга малых молекул и библиотек миРНК, а также идентифицировали новые регуляторы активности ATG4B, такие как протеинкиназыAkt 8. В этой статье описывается подробный протокол использования этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа показан на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе.

1. Производство ретровирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмидой, кодирующей ActinLC3dNGLUC, является pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Для производства вируса с высоким титром используйте малое число пассажей клеток (в идеале меньше, чем P20).

  1. Культивирование клеток HEK293T в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) при 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%CO2 до их слияния на 80%-90% перед посевом для трансфекции.
  2. За сутки до трансфекции высевают клетки в 6-луночный планшет с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 2 мл/лунку полной питательной среды. Инкубируют тарелку в течение ночи в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя при использовании реагента для трансфекции на липосомальной основе. Этот протокол описывает использование реагента на нелипосомальной основе. Перед началом трансфекции дайте реагенту для трансфекции ДНК, ДНК и среде уравновеситься до комнатной температуры (~15 мин).
  3. Для каждой трансфекции добавляйте 200 мкл безсывороточной среды в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. В каждую пробирку добавьте следующее количество плазмид: 1 000 нг pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 нг GagPol; 100 нг VSV-G.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмид и объем среды, указанные здесь, относятся к 12-луночной планшету. При использовании планшета другого типа отрегулируйте объем среды и количество плазмиды для достижения конечной концентрации 5 нг/мкл плазмиды переноса, 4,5 нг/мкл плазмиды упаковки и 0,5 нг/мкл плазмиды оболочки. Используйте любую упаковочную плазмиду, содержащую гены, экспрессирующие gag и pol, и любую плазмиду оболочки, содержащую ген, экспрессирующий VSV-G.
  4. Встряхните флакон с реагентом для трансфекции ДНК в течение 30 с. Пипеткой 4 мкл реагента для трансфекции вводят непосредственно в среду, содержащую разбавленную ДНК. Аккуратно перемешайте, осторожно наклоняя тюбик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь кончиками к стенкам пластиковых трубок. Не поднимайте и не опускайте пипетки и не вихрите.
  5. Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при комнатной температуре.
  6. Во время инкубации реакции удалите старую среду из 6-луночного планшета и замените ее 2 мл/лунку свежей среды, не содержащей сыворотки.
  7. Добавляйте каждый трансфекционный комплекс в каждую лунку по каплям.
  8. Осторожно встряхните или покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей поверхности лунки.
  9. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
  10. Через 24 ч старую среду заменить свежей полной средой (2 мл/лунку) и вернуть клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%СО2 в течение 72 ч.
  11. Через 72 ч соберите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 мин при 4 000 × г при 4 °C для удаления мертвых клеток и мусора. Для дальнейшей очистки используйте большой шприц объемом 60 мл, чтобы пропустить надосадочную жидкость через фильтр 0,20 мкм. Немедленно приготовьте одноразовые аликвоты объемом 300 мкл и храните при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте цикла замораживания-оттаивания, чтобы поддерживать максимальную активность продукта.

2. Ретровирусная трансдукция

  1. За день до трансдукции клеток высевают клетки-мишени средней плотности (PANC1 при 1 × 10 5 клеток/лунку) в 12-луночный планшет в 1 мл/лунку среды с добавлением 10% FBS и 1% P/S. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой5 % CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая плотность клеток должна быть определена заранее, так как разные типы клеток имеют разную способность к прикреплению. В идеале используйте плотность ячеек для получения 40%-50% слияния.
  2. Извлеките замороженные аликвоты ретровируса из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте на льду перед каждым использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте повторно неиспользованные аликвоты.
  3. В конической пробирке объемом 50 мл приготовьте смесь вирусной надосадочной жидкости и полибрена в конечной концентрации 8 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие объемы относятся к трансдукции 12-луночного планшета, содержащего конечный объем 500 мкл/лунка. Окончательный объем вирусной надосадочной жидкости может быть оценен путем тестирования ряда вирусных разведений в присутствии полибрена. Можно использовать более высокие или более низкие разведения в зависимости от желаемых уровней экспрессии трансгена и размера используемого сосуда.
  4. Удалите старую среду из 12-луночной пластины и добавьте 500 мкл смеси в каждую лунку. Инкубируют клетки с вирусной надосадочной жидкостью в течение ночи при температуре 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите две лунки с полной средой (без вирусной надосадочной жидкости) для использования в качестве контроля для отбора.
  5. Замените вируссодержащую среду свежей полной питательной средой (1 мл/лунку). Поместите клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%СО2 на 48 ч.

3. Объединенный отбор и поддержание популяции

  1. Замените питательную среду селективной средой (полная питательная среда с конечной концентрацией пуромицина 1 мкг/мл). Следите за ростом клеток и меняйте субстратик каждые 2-3 дня. При слиянии расширяют в чашку с 6 лунками, а затем в чашку для культуры тканей диаметром 10 см.
  2. Держите клетки в селективной среде, по крайней мере, до тех пор, пока контрольные (нетрансдуцированные) клетки полностью не погибнут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения успешных результатов рекомендуется определить оптимальные концентрации пуромицина до начала экспериментального проекта. Для этого постройте кривую убийства пуромицина, чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для уничтожения нетрансдуцированных клеток в период от 3 до 10 дней.
  3. После того, как клетки будут выращены в селекционной среде, разверните клетки на полную питательную среду и заморозьте исходные аликвоты для экспериментального проекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите номер прохода и избегайте работы с объединенными популяциями из замороженного поголовья с номерами проходов выше пяти. Перед проведением анализа регулярно проверяйте наличие микоплазменного загрязнения. В идеале перед каждым анализом следует использовать свежую партию клеток, чтобы получить максимальный сигнал люциферазы.
  4. Поддерживайте клетки в селективной среде и засейте достаточное количество клеток, чтобы достичь желаемой плотности за день до анализа.

4. Составное сложение

ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека малых молекул Selleckchem состоит примерно из 4000 соединений, расположенных в восемь рядов и 10 столбцов в пятидесяти 96-луночных планшетах с концентрацией 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).

  1. Эквивалент 30 мкл соединения в соответствующую лунку планшета-источника, совместимого с наноразмерным акустическим дозатором жидкости. Используйте полипропиленовую пластину на 384 лунки (пластина 384PP). Храните эти пластины запечатанными и храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол скрининга, описанный здесь, рассчитан в общей сложности на 10 пробирных планшетов в день; фиксированная концентрация 10 мкМ использовалась в качестве окончательной концентрации анализа вместе с 24-часовым инкубационным периодом.
  2. Разморозьте библиотечные пластины при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тарелка полностью разморожена и уравновешена до комнатной температуры. Температурный градиент на пластине может повлиять на работу с жидкостью.
  3. Дозируйте 50 нл/лунку в 384-луночный планшет с помощью наноразмерного акустического дозатора жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранные в программе исходные и конечные пластины совпадают с теми, которые использовались для этого шага.
  4. Создайте программу дозирования в электронной таблице.
  5. Откройте программное обеспечение.
  6. Откройте новый протокол. На вкладке «Протокол » выберите следующие параметры: Формат образца планшета, 384PP; Тип образца пластины, 384PP_DMSO2; и тип целевой пластины, CellCarrier-384 Ultra PN (Рисунок 2A).
  7. В разделе Pick List (Список выбора) выберите опцию импорта (рис. 2B), чтобы импортировать электронную таблицу, содержащую программу дозирования (рис. 2C).
  8. Выберите опцию Run protocol (рисунок 2D), проверьте правильность отображаемой информации и нажмите кнопку Run.
  9. В новом окне под названием Run status (Состояние выполнения) (рисунок 2E) нажмите Start (Пуск) и следуйте инструкциям, отображаемым в окнах приглашений (Рисунок 2F,G).

5. Посев клеток

  1. Трипсинизацию клеток из колбы для клеточных культур или чашек Петри для клеточных культур и нейтрализуют трипсин, добавляя ФБС-содержащие среды.
  2. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 390 × г на 5 мин при комнатной температуре. Затем осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной питательной среды.
  3. Выполните подсчет ячеек.
  4. Готовят клеточную суспензию с 4,6 × 107 клеток в 230 мл полной питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем и плотность клеток указаны для 10 384-луночных планшетов плюс мертвый объем из двух 384-луночных планшетов.
  5. Дозируют 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 384-луночного планшета, приготовленного в разделе 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Посев клеток можно выполнять как вручную, так и с помощью дозатора сыпучих материалов.
  6. Клетки инкубируют при 37 °С в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2 в течение 24 ч.

6. Получение клеточной надосадочной жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь роботизированная платформа для работы с жидкостями выполняет работу с жидкостями с помощью многоканального манипулятора на 96 наконечников. Если автоматизация работы с жидкостями недоступна, протокол можно адаптировать к формату с низкой пропускной способностью с помощью многоканальных пипеток.

  1. Сконфигурируйте рабочую станцию автоматизации лаборатории, как показано на рисунке 3.
  2. Поместите одноразовую стопку с 96 наконечниками в положение P1 (Рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стопка из 96 наконечников состоит из восьми одноразовых стоек. При использовании многоканального манипулятора для 96-луночных наконечников 384-луночный планшет разделен на четыре квадранта. Таким образом, каждой стопки наконечников достаточно для переноса надосадочной жидкости из двух пробирных планшетов в две пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты. Весь пакет наконечников необходимо заменять после каждого прогона двух пластин.
  3. Установите пробирные планшеты в положения P2 и P4 (Рисунок 3A).
  4. Поместите пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты в положения P3 и P5 (Рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гибкая и функциональная роботизированная платформа была адаптирована для этого анализа, и была написана специальная программа (рис. 3B).
  5. Получите подсказки из позиции P1.
  6. Аспирировать 10 мкл надосадочной жидкости из планшета в положении P2 и перенести в пустую сплошную черную пластину в положении P3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники должны быть расположены на соответствующей глубине внутри лунок для аспирации надосадочной жидкости, не нарушая монослой клеток на дне лунки.
  7. Опустите наконечники в отходы в положение P6 (Рисунок 3A).
  8. Повторите шаги 6.5-6.7 для остальных лунок пластины в положении Р2, а затем повторите те же действия для перевода надосадочной жидкости из положения Р4 в положение Р5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно соберите надосадочную жидкость и распределите ее по соответствующим лункам в пустую сплошную черную пластину (Рисунок 3C, D). Поскольку секретируемый dNGLUC очень стабилен в среде клеточной культуры, планшеты можно запечатать и хранить до 7 дней при 4 °C в темноте.

7. Люциферазный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: dNGLUC, используемый в репортере, демонстрирует кинетику вспышки с быстрым затуханием сигнала. Из-за быстрого затухания люминесценции после добавления субстрата (целентеразина) планшетный ридер должен быть настроен на измерение сигнала люминесценции в надосадочной жидкости; Закачивайте субстрат в лунку и считывайте ее через несколько секунд. По этой причине используйте планшетный считыватель, способный контролировать люминесценцию и оснащенный инжектором подложки, чтобы гарантировать, что время между этапами впрыска и считывания будет одинаковым для всех образцов. Настройки, используемые на считывателе пластин, можно найти на рисунке 4.

  1. Готовят нативный коэлентеразин в виде исходного раствора 1 мг/мл в подкисленном метаноле (от 10 мкл 3 М HCl до 1 мл метанола).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с метанолом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. Перед началом анализа приготовьте свежий рабочий раствор субстрата.
  2. Инициализируйте инжекторный насос (Рисунок 5A).
  3. Промойте трубку деионизированной водой (Рисунок 5B-D).
  4. Промойте трубку метанолом.
  5. При промывке трубки приготовьте рабочий раствор субстрата, разбавив субстрат 1:100 (для одной 384-луночной планшета добавьте 220 мкл из исходного раствора субстрата в 21,8 мл 1x фосфатно-солевого буфера [PBS]).
  6. Промойте насосно-компрессорные трубки рабочим раствором субстрата (рисунок 5B-D).
  7. Загрузите пластину в считыватель и запустите измерение, используя настройки, описанные на рисунке 4.
  8. Повторите шаги 7.6-7.7 для всех пробирных планшетов.
  9. После того, как все пробирные планшеты будут готовы, промойте трубки метанолом.
  10. Промойте трубку деионизированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага получаются необработанные значения люциферазы, которые коррелируют с клеточной активностью ATG4B. Для нормализации до номеров клеток необходимы следующие шаги, подсчет количества клеток в каждой лунке с помощью флуоресцентной микроскопии.

8. Фиксация и окрашивание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить вручную с помощью многоканальной пипетки или с помощью дозатора для сыпучих материалов.

  1. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (в 1x PBS) в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с параформальдегидом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. По возможности выполняйте этот шаг в защитном кожухе.
  2. Постирайте три раза с 1 x PBS.
  3. Окрасьте ядра препаратом Hoechst 33342, разбавленным 1:5 000 в 1x PBS, в течение 15 минут.
  4. Постирайте три раза с 1 x PBS.

9. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте получение изображения с помощью автоматизированного микроскопа. В качестве альтернативы получению изображений для определения количества клеток также может быть определена внутриклеточная активность люциферазы. Существуют преимущества и недостатки в отношении того, нормализуется ли количество клеток или внутриклеточная активность люциферазы, что обсуждается ниже. Мы обнаружили, что определение количества клеток является менее инвазивным и приводит к меньшей вариабельности, чем определение внутриклеточных значений люциферазы.

  1. Запустите операционное программное обеспечение микроскопа (рисунок 6).
  2. На вкладке "Настройка " выберите правильный стандартный тип пластины. Если тип пластины не задан, введите размеры пластины вручную.
  3. Загрузите планшет в микроскоп, нажав на опцию «Извлечь и загрузить ».
  4. Затем выберите объектив 20x Air (числовая апертура [NA]: 0,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что воротник объектива установлен на правильное значение, что обеспечивает правильную фокусировку на различных типах пластин.
  5. В разделе «Выбор канала» выберите Hoechst 33342.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки канала по времени, мощности и высоте должны быть оптимизированы в соответствии с типом используемой пластины.
  6. В окне "Определить компоновку" выберите все лунки из пластины и четыре поля из колодки.
  7. В разделе «Онлайн-задания» выберите соответствующую папку для передачи данных в аналитическое программное обеспечение.

10. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение для анализа изображений может быть использовано для сегментации и подсчета клеточных ядер по полученным изображениям. Здесь мы опишем шаги по использованию специального онлайн-программного обеспечения, совместимого с несколькими файлами автоматических микроскопов.

  1. Запустите программное обеспечение для анализа изображений.
  2. Перейдите на вкладку Image Analysis , чтобы начать сегментацию изображения (рисунок 7A).
  3. На вкладке Input Image нажмите на знак + , чтобы добавить новый стандартный блок (рисунок 7A).
  4. В списке выберите опцию Find Nuclei (рисунок 7A) и выберите Hoechst 33342 в качестве опции канала (рисунок 7B).
  5. Визуально осмотрите сегментированные объекты на изображении и выберите наиболее точный метод сегментации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента мы использовали метод C (рис. 7C). Каждый вариант метода имеет подкатегории, которые можно настроить для получения наилучшей сегментации.
  6. Затем перейдите на вкладку Define Results (рисунок 7C) и выберите Standard Output в качестве опции Method .
  7. В подкатегории выберите Nuclei-number of objects и Object count (рисунок 7C).
  8. Сохраните конвейер анализа с помощью параметра Сохранить анализ на диск или Сохранить анализ в базе данных .
  9. На вкладке Пакетный анализ выберите данные для анализа из дерева.
  10. В разделе Метод выберите конвейер анализа, сохраненный на шаге 10.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно загрузить файл скрипта из-за пределов указанного программного обеспечения или загрузить существующий анализ, сохраненный в базе данных.
  11. Нажмите кнопку Run Analysis , чтобы начать анализ (рисунок 7D). В конце этого рабочего процесса генерируются два набора данных: необработанные значения люциферазы из надосадочной жидкости и номер ячейки в каждой лунке. Используйте оба для нормализации значения люциферазы на клетку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В предыдущей публикации8 мы успешно использовали этот анализ для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы ATG4B. Здесь мы опишем протокол и репрезентативные результаты этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью. На рисунке 8 показан пример анализа исходных данных как для клеточных ядер, так и для люминесценции. Типичный результат измерения люминесценции изображен на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преимущества этого анализа заключаются в том, что он является чувствительным, высококоличественным и неинвазивным, поскольку он может обнаруживать dNGLUC без лизиса клеток. В данной работе представлен подробный протокол генерации стабильной к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании в рамках гранта MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, гранта MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (ссылка на грант 2018RIF_15) и схемы поддержки терапевтического ускорения UCL при финансовой поддержке MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Плазмида, кодирующая ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), была получена у доктора Робина Кеттелера (Robin Ketteler) (Факультет медицины человека, Берлинская медицинская школа).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
50 & микро; L Одноразовые наконечники - нефильтрованные, чистые, вложенные 8 стеков (пассивный стек)Tecan30038609Одноразовый штатив с 96 наконечниками
BioTek MultiFloBioTekдозатор для сыпучих материалов
CoelenterazineSanta Cruz Biotechnologysc-205904субстрат
Columbus Программное обеспечение для анализа изображенийPerkin ElmerВерсия 2.9.1программное обеспечение для анализа изображений
DPBS (1x)Gibco14190-144
Echo Qualified 384-луночный полипропиленовый микропланшет, прозрачный, нестерильныйBeckman Coulter001-14555384PP планшет
EnVision IIPerkin Elmerсчитыватель люминесцентных пластин
Express pick Library (96-луночный)-L3600-Z369949-100&микро; LSelleckchemL3600Selleckchem
FMK9AMedChemExpressHY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384-луночные планшетыGreiner Bio-One781076сплошные черные 384-луночные планшеты
Harmony Imaging программное обеспечениеPerkin ElmerVersion 5.1программное обеспечение для визуализации
Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат - 10 мг/мл раствор в водеThermoFisherH3570Hoechst 33342
Labcyte серии Echo 550 с программным обеспечением Echo Cherry PickНаноразмерный акустический дозатор жидкостиLabcyte/Beckman Coulter
деионизированная водаMilli-Q Система
скрининга с высоким содержанием Opera Phenixавтоматизированный микроскопPerkin Elmer
Раствор параформальдегида 4% в PBSSanta Cruz Биотехнологияsc-281692
PhenoPlate 384-лунка, черная, оптически прозрачная, плоскодонная, обработанная культурой тканей, крышкиPerkin Elmer6057300CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUCПолучено от доктора Робина Кеттелера (факультет медицины человека, Медицинская школа Берлина)
Полибреновая инфекция / трансфекционный реагентMerckTR-1003-Gполибрен
Пуромицина дигидрохлорид, 98%, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisherJ61278.MEPuromycin
Tecan Freedom EVO 200 роботроботизированная платформа для работы с жидкостямиTecan
X-tremeGENE HP ДНК Реагент для трансфекции ДНК RocheMerck6366244001реагент для трансфекции ДНК
водная Tecan

Ссылки

  1. Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
  2. Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649(2019).
  3. Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
  4. Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53(2019).
  5. Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
  6. Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
  7. Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
  8. Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).
  9. Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
  10. Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
  11. Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
  12. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
  13. Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
  14. Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
  15. Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
  16. Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
  17. Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
  18. Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64(2008).
  19. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14(2014).
  20. Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ингибирование ATG4Bбелки аутофагииклеточный скринингвысокопроизводительный скрининглюциферазный анализнизкомолекулярные ингибиторырезистентность к терапии ракаактивность ATG4Bпосттрансляционная регуляциянокаут-линии клеток
Клеточный скрининг лекарственных препаратов на наличие ингибиторов аутофагии, связанной с 4B цистеин-пептидазой
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.