Методическая статья

Выравнивание синхронизированных данных временных рядов с использованием характеризирующей модели синхронизации клеточного цикла для перекрестных сравнений

DOI:

10.3791/65466

⸱

9 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одна из проблем анализа синхронизированных экспериментов с временными рядами заключается в том, что эксперименты часто различаются по продолжительности восстановления после синхронности и периоду клеточного цикла. Таким образом, измерения из разных экспериментов не могут быть проанализированы в совокупности или легко сравниваться. Здесь мы описываем метод выравнивания экспериментов, позволяющий проводить фазовые сравнения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование клеточного цикла часто зависит от синхронизации клеточных популяций для измерения различных параметров во временном ряду, когда клетки пересекают клеточный цикл. Однако даже в аналогичных условиях повторные эксперименты демонстрируют различия во времени, необходимом для восстановления после синхронности и прохождения клеточного цикла, что предотвращает прямые сравнения в каждый момент времени. Проблема сравнения динамических измерений в экспериментах усугубляется в мутантных популяциях или в альтернативных условиях роста, которые влияют на время восстановления синхронности и/или период клеточного цикла.

Ранее мы опубликовали параметрическую математическую модель под названием «Характеристика потери синхронизации клеточного цикла» (CLOCCS), которая отслеживает, как синхронные популяции клеток высвобождаются из синхронности и прогрессируют в клеточном цикле. Полученные параметры из модели затем могут быть использованы для преобразования экспериментальных точек времени из синхронизированных экспериментов с временными рядами в нормализованную шкалу времени (точки линии жизни). Вместо того, чтобы представлять время, прошедшее в минутах от начала эксперимента, шкала линии жизни представляет собой прогрессию от синхронности до входа в клеточный цикл, а затем через фазы клеточного цикла. Поскольку точки линии жизни соответствуют фазе средней клетки в синхронизированной популяции, эта нормализованная временная шкала позволяет проводить прямые сравнения между экспериментами, в том числе с различными периодами и временем восстановления. Кроме того, модель использовалась для согласования экспериментов по клеточному циклу между различными видами (например, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe), что позволяет проводить прямое сравнение измерений клеточного цикла, что может выявить эволюционные сходства и различия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерения временных рядов, выполненные на синхронизированных популяциях клеток по мере их продвижения по клеточному циклу, являются стандартным методом исследования механизмов, контролирующих прогрессию клеточного цикла 1,2,3,4,5,6,7,8 . Возможность проводить сравнения между экспериментами по синхронизации/выпуску временных рядов жизненно важна для нашего понимания этих динамических процессов. Использование повторных экспериментов для подтверждения результатов может повысить уверенность в воспроизводимости выводов. Кроме того, сравнения между условиями окружающей среды, между мутантами и даже между видами могут раскрыть много новых идей о регуляции клеточного цикла. Однако межэкспериментальная вариабельность восстановления после синхронности и скорости прогрессирования клеточного цикла ухудшает способность проводить сравнения от момента времени к моменту времени между репликами или между экспериментами с измененным временем клеточного цикла. Из-за этих проблем реплики часто не включаются в полные временные ряды (например, Spellman et al.4). Когда собираются реплики для всех временных рядов, данные не могут быть проанализированы в совокупности, а для анализа используется одна реплика, а другие реплики часто сводятся к дополнительным цифрам (например, Orlando et al.8). Кроме того, трудно сравнивать эксперименты с различными характеристиками восстановления или прогрессирования клеточного цикла. Измерения меньших интервалов между интересующим событием и ориентиром клеточного цикла (например, появлением почек, вступлением в S-фазу или началом анафазы) могут помочь уменьшить количество ошибок, если эти знаковые события отслеживаются 1,2,3,9,10,11,12. Однако тонкие, но важные различия могут остаться незамеченными или скрытыми при использовании этих специальных методов. Наконец, одноклеточный анализ позволяет анализировать прогрессирование клеточного цикла, не полагаясь на синхронизацию или выравнивание13, хотя крупномасштабные измерения в одноклеточных исследованиях могут быть сложными и дорогостоящими.

Чтобы преодолеть эти трудности, мы разработали модель «Характеристика потери синхронизации клеточного цикла» (CLOCCS), чтобы помочь в анализе измерений временных рядов, сделанных на синхронизированных популяциях14,15. CLOCCS — это гибкая математическая модель, которая описывает распределение синхронизированных клеток по фазам клеточного цикла по мере того, как они освобождаются от синхронности и продвигаются по клеточному циклу. Структура процесса ветвления позволяет модели учитывать асимметричные качества материнских и дочерних клеток после деления, как это наблюдается у S. cerevisiae, но при этом по-прежнему полезна для организмов, которые делятся путем деления, таких как S. pombe. Модель может принимать входные данные из различных типов измерений для определения фазы клеточного цикла. Он может принимать данные фазы почкования, которые включают измерения процента отпочковавшихся клеток с течением времени, что позволяет оценить количество клеток за пределами фазы G114,15. Модель также может принимать проточные цитометрические данные, которые измеряют содержание ДНК, что позволяет оценить ориентировочные переходы от G1 к S, от S к G2 и от M к G115. Флуоресцентные морфологические маркеры также могут быть использованы для идентификации фазы клеточного цикла. Флуоресцентная маркировка миозиновых колец, ядер и тел веретенообразных полюсов (SPB) может быть использована для определения фазы клеточного цикла, и они были включены в модельCLOCCS 11; Однако эти измерения не будут описаны в этом протоколе. Кроме того, индекс септации использовался в качестве входных данных для моделирования данных из S. pombe14. Таким образом, модель может быть использована для анализа клеточного цикла в различных организмах и может быть дополнительно расширена.

CLOCCS - это параметрическая модель, которая позволяет сделать полный байесовский вывод о нескольких параметрах из входных данных (например, процент почкования, содержание ДНК). Эти параметры включают время восстановления после синхронии, продолжительность периода клеточного цикла (оценивается отдельно для материнских и дочерних клеток) и среднее положение клеток в клеточном цикле в каждый момент времени. Эти параметры представляют собой поведение средней клетки в популяции, что позволяет исследователю сопоставлять каждую временную точку с положением клеточного цикла, выраженным в виде точки спасательного круга. Преобразование в точки линии жизни зависит от параметров CLOCCS лямбда (λ) и mu0 (μ0)14,15. Параметр λ соответствует среднему периоду клеточного цикла материнских клеток. Однако из-за задержки мать-дочь14,15 это не средний период клеточного цикла всей популяции, включающий как материнские, так и дочерние клетки. CLOCCS дополнительно выводит параметр дельта (δ), который соответствует задержке матери и дочери и, таким образом, позволяет рассчитать средний период клеточного цикла всей популяции. Наконец, поскольку каждый эксперимент начинается после освобождения от синхронизации клеточного цикла, время, необходимое для восстановления после метода синхронизации, представлено параметром CLOCCS μ0. CLOCCS подгоняет модель под входные данные о фазе клеточного цикла, а затем выводит эти параметры с помощью алгоритма Монте-Карло со случайным блужданием цепи Маркова14,15. Сопоставляя несколько экспериментов с общей шкалой времени жизненного цикла клетки, можно проводить прямые фазовые сравнения между репликами или экспериментами, в которых время восстановления или периоды клеточного цикла не идентичны 8,14,15.

Поскольку синхронизированные популяции теряют синхронность с некоторой скоростью в течение временных рядов14,15,16,17, изменчивость скорости потери синхронности также может препятствовать количественным сравнениям между экспериментами. Определяя местоположение популяций и дисперсию в их распределении, CLOCCS учитывает различия в показателях потери синхронности. Этот мощный инструмент позволяет проводить конкретные и подробные сравнения между экспериментами, тем самым предоставляя возможность напрямую проводить релевантные сравнения не только между репликами, но и между условиями окружающей среды, мутантами и даже видами, которые имеют совершенно разные сроки клеточного цикла14,15.

В этой статье описывается метод, использующий CLOCCS для оценки параметров путем подгонки данных из экспериментов с синхронными временными рядами / выпуском, сопоставления данных с общей шкалой жизненного цикла, а затем проведения соответствующих сравнений между репликами или экспериментами. Выравнивание линии жизни позволяет проводить прямые фазовые сравнения в этих экспериментах, что позволяет агрегировать и сравнивать репликации, а также проводить более релевантные сравнения между экспериментами с разными сроками восстановления и периодами клеточного цикла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор фазы клеточного цикла и экспериментальных данных

  1. Синхронизируйте клетки по отношению к клеточному циклу, используя желаемый метод синхронизации (например, центробежную элютриацию, как описано в Leman et al.18, или остановку феромонов спаривания, как описано в Rosebrock 19; как Leman et al.18, так и Rosebrock 19 также включают способы высвобождения из синхронии). Начните отбор проб по всему временному ряду, убедившись, что временной ряд имеет длину не менее двух полных периодов клеточного цикла, и, в оптимальном варианте, соберите не менее 10 образцов за клеточный цикл. В каждый момент времени соберите образец для данных о фазе клеточного цикла (почкование или проточная цитометрия) и образец для экспериментальных данных, как описано ниже.
  2. Если вы используете данные о почковании в качестве данных о фазе клеточного цикла, соберите данные о почковании для выравнивания CLOCCS.
    1. Выборка по всему временному ряду. Для каждого момента времени собирайте клетки и фиксируйте их, смешивая 200 мкл ультразвуковой культуры клеток с 200 мкл фиксирующего раствора, как описано в Leman et al.18.
    2. Для стандартного почкования подсчитывайте не менее 200 клеток в каждый момент времени с помощью микроскопа с проходящим светом с 40-кратным объективом и гемоцитометра. Добавьте образец клеток из шага 1.2.1 в гемоцитометр и разбавьте, если плотность препятствует подсчету. Запишите количество отпочковавшихся и нераспустившихся клеток в каждый момент времени. Рассчитайте процент распустившихся ячеек и постройте график для каждого момента времени на кривой почкования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие методы уточнения информации о фазе клеточного цикла, но они не описаны в данном протоколе. Другие методы описаны в файле readme CLOCCS и в предыдущей работе11.
  3. При использовании данных о содержании проточной цитометрической ДНК в качестве данных о фазе клеточного цикла соберите данные окрашивания ДНК проточной цитометрии для выравнивания проточного цитометрического CLOCCS.
    1. Выборка по всему временному ряду. Для каждого момента времени соберите ячейки и исправьте их, как описано в Haase and Reed20.
    2. Окрашивают ДНК и анализируют с помощью стандартного проточного цитометрического анализа. Рекомендуемый протокол окрашивания для S. cerevisiae описан в Haase and Reed20.
  4. Соберите связанные омиксы или связанные экспериментальные данные. Стандартные транскриптомные данные собирают, как описано в Leman et al.18 и Kelliher et al.21,22. Убедитесь, что данные связаны с точками времени, содержащими данные о фазе клеточного цикла, чтобы обеспечить выравнивание по течению. Для оптимального выравнивания убедитесь, что каждый момент времени, содержащий экспериментальные данные, также имеет связанные с ним фазовые данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные данные могут принимать различные формы. Традиционно мы используем метод выравнивания, описанный для выравнивания транскриптомных экспериментов временных рядов. Однако любой тип данных, связанных с временными точками, может быть выровнен (т. е. протеомика22).

2. Установка необходимого программного обеспечения

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе предполагается, что Conda, Java 19 и Git уже установлены (Таблица материалов).

  1. Загрузите репозиторий CLOCCS_alignment, введя в терминал следующую команду:
    git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Создайте среду Conda с помощью файла conda_req.yml, введя следующую команду в терминал в папке, где был клонирован репозиторий CLOCCS_alignment:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Использование CLOCCS для параметризации экспериментов

  1. Дважды щелкните файл cloccs_v2023.jar в папке CLOCCS в репозитории CLOCCS_alignment и дождитесь открытия графического интерфейса пользователя. Этот экран позволяет вводить параметры для запуска CLOCCS и отображает результаты после запуска.
  2. Введите общие настройки.
    1. Установите Sim Anneal, Burn In и Iterations , введя текст в соответствующие поля ввода текста. Sim Anneal (имитация отжига) определяет хорошие значения начальных параметров, Burn In ищет апостериорные моды, а заключительный этап позволяет сделать все апостериорные выводы. Более высокие значения увеличивают время выполнения, но также повышают точность.
    2. Введите условия эксперимента, указав температуру в градусах Цельсия и метод синхронизации с помощью текстового поля « Температура » и раскрывающегося меню «Синхронизация». Метод, соответственно.
    3. При необходимости настройте дополнительные параметры в меню «Дополнительные параметры». Расширенные настройки позволяют установить априоры для каждого из параметров («mu0», «sigma0», «sigmav», «lambda», «bud.start», «bud.end»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о дополнительных настройках можно найти в файле readme.txt в папке CLOCCS репозитория CLOCCS_alignment.
  3. Введите параметры для использования с подающими надежды данными.
    1. Выберите подходящий вариант из выпадающего меню « Тип модели ». Параметр по умолчанию «Бутон» предназначен для стандартной информации о почковании дрожжей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие более продвинутые параметры также существуют в выпадающем меню: Mutant для информации о почковании для мутантов, которые проходят несколько циклов почкования без деления, BudSSLSMR для информации о почковании и дополнительной информации о полюсе веретена и информации о кольцах миозина, а также BudNucDivNeck для информации о почковании и дополнительной информации о делении и ядре шейки почки. Эти расширенные параметры описаны в файле readme CLOCCS и в предыдущей работе11,14,15.
    2. Импортируйте данные с помощью панели «Импорт данных », введя текст в поля ввода текста или загрузив файл, нажав кнопку « Выбрать файл ». В первом столбце указываются моменты времени. В оставшихся двух столбцах указываются данные о почковании, и могут быть выбраны любые из следующих параметров: количество нераспустившихся ячеек (No Bud), количество отпочковавшихся ячеек (Bud) или общее количество ячеек (Total).
  4. Введите настройки для использования с проточными цитометрическими данными. Для каждого эксперимента выполните шаг 3.3 или 3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточные цитометрические данные и данные почкования можно использовать вместе. Хотя ранее мы описали их совместноевыполнение 15, для этого инструмента они должны быть запущены независимо друг от друга, а затем сравнены.
    1. Преобразуйте файлы .fcs в правильный входной формат CLOCCS для проточной цитометрии, следуя инструкциям в дополнительном файле 1 (также находится в репозитории CLOCCS_alignment как CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Выберите пункт «Поток» в раскрывающемся меню «Тип модели».
    3. Импортируйте данные с помощью панели «Импорт данных». Нажмите « Выбрать файл» и выберите файл, созданный на шаге 3.4.1.
    4. Выберите моменты времени, для которых должна быть построена проточная цитометрическая подгонка CLOCCS, выбрав моменты времени в поле «Время для примерки ».
  5. После того, как все входные данные будут выбраны для почкования или проточной цитометрии, нажмите кнопку «Применить », а затем нажмите кнопку «Образец » в верхней части экрана.
  6. Просмотрите кривую почкования или графики проточной цитометрии с прогнозируемыми соответствиями, выбрав вкладку «Прогнозируемые посадки ». Эта вкладка открывается по умолчанию сразу после предыдущего шага.
  7. Просмотрите гистограммы параметров для каждого параметра, выбрав вкладку «Гистограммы параметров », а затем выбрав вложенную вкладку, соответствующую интересующему параметру, из следующих вариантов: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end и т. д.
  8. Просмотрите график апостериорной оценки, выбрав вкладку «Задняя оценка ».
  9. Просмотрите настройки и измените их, выбрав вкладку « Настройки »; просмотреть журнал предыдущих запусков, выбрав вкладку Журнал .
  10. Получите параметры CLOCCS из подгонки, выбрав вкладку «Задние параметры ». Результирующая таблица будет иметь следующий вид: каждая строка состоит из параметра, причем последняя строка является апостериорной. Столбцы состоят из прогнозируемого параметра для среднего значения, нижнего доверительного интервала 2,5%, верхнего доверительного интервала 97,5% и коэффициента принятия.
    1. Запишите параметры, используемые для выравнивания для каждого эксперимента: время восстановления после синхронии (μ0) и средний период клеточного цикла материнских клеток (λ).
    2. Рассчитайте период клеточного цикла, вычислив среднее значение периода материнской клетки (λ) и периода дочерней клетки (λ + δ), где δ — задержка, специфичная для дочерней клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите раздел 3 со всеми экспериментами, которые будут включены в сравнения.

4. Преобразование точек времени в точки жизни с помощью функций преобразования Python и параметров CLOCCS

ПРИМЕЧАНИЕ: Для преобразования между точками времени и точками линии жизни требуются две формулыпреобразования 21. Реализация Python для преобразования и визуализации данных доступна в репозитории CLOCCS_alignment и описана ниже.

  1. Активируйте среду Conda, введя в терминал следующую команду: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Откройте интерактивную записную книжку Python, введя в терминале следующую команду: jupyter notebook
  3. Создайте новую записную книжку Python в нужной папке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример записной книжки был включен для демонстрации стандартного использования и может быть найден в Alignment/JOVE_example.ipynb в репозитории выравнивания CLOCCS_.
  4. Импортируйте файл Python, содержащий функции выравнивания, выполнив следующую команду в первой ячейке:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
    1. Замените путь к CLOCCS_alignment репозиторию на path_to_repo.
  5. При использовании данных о почковании в качестве данных фазы клеточного цикла импортируйте кадр данных, содержащий процент почкований в каждый момент времени, выполнив следующую команду в новой ячейке:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Подставьте соответствующий путь к файлу и имя файла. Если файл является файлом .csv, удалите sep ="\t"
  6. Если вы используете данные о почковании в качестве данных фазы клеточного цикла, выровняйте данные почкования по шкале времени точки жизни, введя следующую функцию в новую ячейку:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, временные точки, param_mu0, param_lambda)
    1. Для временных точек замените список временных точек, которые будут индексом budding_df кадра данных.
    2. Для param_mu0 и param_lambda замените эксперимент изученными параметрами из многообещающего запуска CLOCCS в разделе 3.
  7. При использовании данных проточной цитометрии импортируйте данные проточной цитометрии, выполнив следующую команду в новой ячейке:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. Для flow_input_folder подставьте соответствующий путь к папке, содержащей FCS-файлы проточной цитометрии.
  8. При использовании данных проточной цитометрии создайте таблицу преобразования между точками времени и точками линии жизни для каждого эксперимента, введя следующую команду в новую ячейку:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(временные точки, param_mu0, param_lambda)
    1. Вместо временных точек замените список временных точек из данных проточной цитометрии.
    2. Для param_mu0 и param_lambda замените эксперимент изученными параметрами проточной цитометрии, выполненной CLOCCS в разделе 3.
  9. Импортируйте кадр данных, содержащий экспериментальные данные, в записную книжку, выполнив следующую команду в новой ячейке:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Подставьте соответствующий путь к файлу и имя файла. Если файл является .csv файлом, удалите sep = "\t".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать для любых табличных данных. Экспериментальные данные должны просто иметь временные точки в виде столбцов или индекса фрейма данных. Примеры данных можно найти в репозитории CLOCCS_alignment.
  10. Выровняйте экспериментальные данные по шкале времени точки жизни, введя следующую функцию в новую ячейку:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, временные точки, param_mu0, param_lambda, интерполяция, нижняя часть, верхняя часть)
    1. Для временных точек замените список временных точек в качестве индекса или столбцов экспериментального data_df из предыдущего шага.
    2. Вместо param_mu0 и param_lambda заменить значения, полученные в разделе 3 из CLOCCS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут быть получены из любого запуска CLOCCS, выполненного для любого из принятых типов данных фазы клеточного цикла.
    3. При необходимости замените интерполяцию на True или False или оставьте поле пустым (по умолчанию — False).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если задано значение False, данные не будут интерполироваться. Если задано значение True, точки линии жизни будут округлены и интерполированы, чтобы заполнить значения между точками линии жизни, так что в диапазоне точек линии жизни есть точка на целое число. Это позволяет лучше сравнивать наборы данных.
    4. При необходимости замените lowerll и upperll на None или целочисленные значения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если задано значение «Нет», все точки линии жизни после интерполяции сохраняются. Когда указываются целые числа , данные усекаются так, что точки линии жизни варьируются от нижнего до верхнего. Это позволяет сравнивать наборы данных с разными нижними или верхними слоями.
  11. Загрузите набор данных, выровненный по линии жизни, введя следующую команду в новую ячейку: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Повторите шаги 4.5-4.11 со всеми экспериментами, которые будут включены в сравнения.

5. Сравнение кривых почкования и данных проточной цитометрии

  1. Постройте почкующиеся кривые перед выравниванием с помощью функции служебных программ Python, введя следующую команду в новую ячейку:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
    1. Подставьте список, содержащий кадры данных всех желаемых кривых почку, для построения графика для list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. При желании замените список меток на условные обозначения - [Эксперимент 1, Эксперимент 2, Мутант] на leg_list. Если нет, исключите или замените Нет.
    3. Замените время на str_type.
    4. При необходимости замените str_title строковым заголовком Comparison Budding Curves . Если нет, замените Нет или исключите.
  2. Постройте кривые почкования после выравнивания с помощью функции служебных программ Python, следуя инструкциям на шаге 5.1, но со списком выровненных кривых, замененных на list_of_budding_curves, и с линией жизни вместо point_type вместо времени.
  3. Чтобы построить график данных проточной цитометрии, нанесите связанные данные из файлов .fcs в соответствующие точки линии жизни с помощью преобразователя, созданного на шаге 4.8.
  4. Преобразуйте точки линии жизни в фазу клеточного цикла с помощью таблицы преобразователя (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно построить, следуя инструкциям в шаге 5.1, но с фазой для point_type вместо времени.

6. Сравнение экспериментальных данных

  1. Определите список генов, который будет нанесен на линейные графики, на основе литературной информации или генов, представляющих интерес для исследования.
  2. Используйте предоставленный plot_linegraph_comparison в файле служебных программ Python для выполнения сравнения линейных графиков с исходным, выровненным или выровненным и интерполированным кадром данных, введя следующую команду в новую ячейку:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
    1. Подставьте список кадров данных экспериментов, подлежащих сравнению, на list_of_dfs.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кадры данных могут быть невыровнены или выровнены; Однако соответствующие point_type должны быть введены на шаге 6.2.4.
    2. Замените список заголовков для каждого кадра данных в том же порядке, что и список кадров данных для list_for_legend.
    3. Замените список имен генов (которые должны быть включены в индекс кадров данных), которые будут нанесены на график для genelist.
    4. Замените тип точки на str_type. Используйте линию жизни (по умолчанию — шкала точки линии жизни) или фазу (шкала линии жизни фазы ячейки) для выровненных кадров данных на шаге 6.2.1 или время для невыровненных кадров данных на шаге 6.2.1.
    5. Замените str_title необязательным строковым заголовком.
  3. Определите список генов, которые будут включены в тепловую карту, используя литературу или алгоритмы для определения верхних периодических генов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного сравнения тепловых карт данные должны быть выровнены, интерполированы и скорректированы по временной шкале на шаге 6.2; Он должен иметь одинаковое начальное и конечное значение линии жизни для каждого эксперимента.
    1. Запустите алгоритмы периодичности для определения верхних периодических генов23,24 или используйте желаемые альтернативные методы для определения списка генов (т.е. результаты литературы).
    2. Импортируйте файл списка генов .csv или .tsv в записную книжку с помощью следующей команды в новой ячейке:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Подставьте соответствующий путь к файлу и имя файла. Если файл является файлом .csv, удалите sep="\t".
  4. Используйте предоставленную функцию plot_heatmap_comparison в файле служебных программ Python, чтобы выполнить сравнение тепловой карты на выровненном, интерполированном и выровненном по фазам кадре данных, введя следующую команду в новую ячейку:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
    1. Замените list_of_dfs списком выровненных кадров данных сравниваемых экспериментов.
    2. Замените список заголовков для каждого кадра данных в том же порядке, что и список кадров данных для list_for_legend.
    3. Замените список имен генов (которые должны быть включены в индекс кадров данных), которые будут нанесены на график для genelist.
    4. Замените str_title необязательным строковым заголовком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый кадр данных в списке - это тот, который будет использоваться для упорядочивания генов на тепловой карте. Гены будут упорядочены по максимуму в первом периоде для этого кадра данных, и тот же порядок будет использоваться для последующих кадров данных в списке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этапы, описанные в приведенном выше протоколе и в рабочем процессе на рисунке 1 , были применены к пяти экспериментам с синхронизированными временными рядами с клеточным циклом, чтобы продемонстрировать два репрезентативных сравнения: между репликациями с различными методами синхронизации (спаривание феромона и центробежная элютриация18) и платформами секвенирования (секвенирование РНК [RNA-seq] и микрочип), а также в экспериментальных условиях. Было проведено несколь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе представлен метод более точной и количественной оценки данных экспериментов временных рядов на синхронизированных популяциях клеток. Метод использует изученные параметры из CLOCCS, байесовской модели вывода, которая использует входные данные о фазе клеточного цикла, такие как данные о почковании и данные о содержании проточной цитометрической ДНК, для параметризации каждого эксперимента14,15. CLOCCS использует входные данные о фазе клеточного цикл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С. Кампионе и С. Хаазе были поддержаны финансированием Национального научного фонда (DMS-1839288) и Национальных институтов здравоохранения (5R01GM126555). Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Хуаруи Чжоу (Huarui Zhou) из Университета Дьюка за комментарии к рукописи и за бета-тестирование протокола. Мы также благодарим Фрэнсиса Мотту (Francis Motta) из Атлантического университета Флориды (Florida Atlantic University) и Джошуа Робинсона (Joshua Robinson) за помощь в работе с кодом Java.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2x PBSдля фиксирующего раствора. Описано в Leman 2014.
4% формальдегиддля фиксирующего раствора.
100% этанолДля фиксации проточной цитометрии. Описано в Haase 2002.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Проточный цитометрДля протокола проточной цитометрии.
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Микроскопдля подсчета клеток и почек.
Миникондаhttps://docs.conda.io/en/latest/
протеазыДля протокола проточной цитометрии. Описано в Haase 2002.
РНКазы Адля протокола проточной цитометрии. Описано в Haase 2002.
SYTOX Краситель на основе зеленых нуклеиновых кислотInvitrogenS7020для окрашивания проточной цитометрией. Описано в Haase 2002.
ТрисрН 7,5
Раствор Раствор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи