Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Крупномасштабное производство клеток на основе растворимых пористых микроносителей GMP-класса

5.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65469

⸱

7 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для достижения крупномасштабного производства адгезивных клеток с помощью полностью закрытой системы на основе растворимых микроносителей GMP-класса. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека, клеток HEK293T и клеток Vero было валидировано и соответствовало как количественным требованиям, так и критериям качества для индустрии клеточной и генной терапии.

Аннотация

Исследователи в области клеточной и генной терапии (ВКТ) уже давно сталкиваются с серьезной проблемой эффективного и крупномасштабного размножения клеток. Чтобы устранить основные недостатки двумерной (2D) планарной системы культивирования, мы разработали инновационную платформу автоматизированного закрытого промышленного производства клеток (ACISCP) на основе растворимого и пористого микроносителя GMP-класса для 3D-культивирования адгезивных клеток, включая мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (hMSCs), HEK293T клетки и клетки Vero. Для достижения крупномасштабного расширения было проведено двухступенчатое расширение с помощью биореакторов с перемешиванием объемом 5 л и 15 л с получением 1,1 x10 10 гМСК с общим расширением в 128 раз в течение 9 дней. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. По сравнению с 2D планарной культурой нет существенных различий в качестве МСК, собранных из 3D-культуры. Мы также применили эти растворимые пористые микроносители к другим популярным типам клеток в секторе CGT; В частности, HEK293T клетки и клетки Vero культивировались до пиковой плотности клеток 1,68 x 10 7 клеток/мл и 1,08 x 107 клеток/мл соответственно. В этом исследовании представлен протокол использования платформы биотехнологической инженерии, использующей характеристики растворимых микроносителей класса GMP и передового закрытого оборудования для производства адгезивных клеток в промышленных масштабах.

Введение

За последние два десятилетия индустрия CGT стала свидетелем экспоненциального роста. Ожидается, что эволюция лекарственных средств нового поколения позволит лечить и излечивать многочисленные рефрактерные заболевания1. С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) продукта CGT Kymriah в 2017 году исследования и разработки, связанные с CGT, в мире продолжали расти быстрыми темпами, при этом FDA отмечает, что количество активных заявок на новые экспериментальные препараты для CGT увеличилось до 500 в 2018году. Прогнозировалось, что к 2030 году количество одобренных продуктов CGT, вероятно, составит 54-74 в СоединенныхШтатах.

Несмотря на то, что быстрый рост исследований и инноваций в области CGT является захватывающим, все еще существует большой технологический разрыв между лабораторными исследованиями и производством в промышленных масштабах, который мог бы доставить эти перспективные лекарства для охвата такого количества пациентов, которое необходимо, по доступным ценам. Нынешние процессы, принятые для этих клинических испытаний, были разработаны в лабораториях для проведения небольших экспериментов, и необходимы значительные усилия для совершенствования и внедрения инновацийв производство CGT. Существует множество типов продуктов CGT, большинство из которых основаны на живых клетках, которые могут быть аллогенными, аутологичными, инженерными или натуральными. Эти живые лекарства намного сложнее, чем мелкомолекулярные соединения или биологические препараты, что делает крупномасштабное производство серьезной проблемой 4,5,6. В этой работе мы демонстрируем крупномасштабный протокол производства клеток для трех якорно-зависимых клеток, которые широко применяются в CGT. К ним относятся мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (МСК), которые используются для клеточной терапии, а также клетки HEK293T и Vero, которые используются для производства вирусов для генной инженерии конечного терапевтического клеточного продукта. Клетки, зависящие от якорения, обычно культивируются на планарных системах, которые требуют ручной обработки. Однако ручные методы культивирования требуют значительного количества труда и подвержены загрязнению, что может поставить под угрозу качество конечного продукта. Кроме того, отсутствует поточный контроль процесса, что приводит к существенной вариабельности качества между партиями7. Если взять в качестве примера терапию стволовыми клетками, то с многообещающим портфелем из более чем 200 кандидатов на терапию стволовыми клетками, по оценкам, для удовлетворения потребностей клинического применения потребуется 300 триллионов МСКв год8. Таким образом, крупномасштабное производство терапевтических клеток стало необходимым условием для проведения этих терапевтических вмешательств с такойвысокой потребностью в клетках.

Чтобы избежать неудач планарных систем, были предприняты усилия по разработке крупномасштабных производственных процессов в биореакторах с перемешиванием с обычными нерастворимыми микроносителями 10,11,12,13, но они страдают от сложных процедур подготовки и низкой эффективности сбора клеток 14. Недавно мы разработали инновационный растворимый микроноситель для экспансии стволовых клеток, стремясь обойти проблемы, связанные с забором клеток из обычных нерастворимых коммерческих микроносителей15. Этот новый, коммерчески доступный 3D-растворимый пористый микроноситель 3D-класса GMP, 3D TableTrix, продемонстрировал большой потенциал для крупномасштабного производства клеток. Действительно, 3D-культура, основанная на этих пористых микроносителях, потенциально может воссоздать благоприятную биомиметическую микросреду для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, миграциии активации. Пористые структуры и взаимосвязанные пористые сети микроносителей могут создавать большую площадь клеточной адгезии и способствовать обмену кислорода, питательных веществ и метаболитов, тем самым создавая оптимальный субстрат для клеточной экспансии in vitro 17. Высокая пористость этих растворимых пористых микроносителей 3D-класса GMP позволяет крупномасштабно расширять хМСК, а способность клеток полностью растворяться позволяет эффективно собирать эти расширенные клетки18. Он также является продуктом класса GMP и был зарегистрирован в качестве фармацевтического вспомогательного вещества в Китайском центре оценки лекарственных средств (регистрационные номера: F20210000003 и F20200000496)19 и FDA Соединенных Штатов (FDA, США; Номер главного дела о наркотиках: 35481)20.

Здесь мы проиллюстрируем автоматизированную систему производства ячеек закрытого промышленного масштаба (ACISCP)18, использующую эти диспергируемые и растворимые пористые микроносители для hMSC, HEK293T cell и расширения клеток Vero. Мы добились успешного двухуровневого расширения МСК (128 кумулятивных расширений за 9 дней) из биореактора объемом 5 л в биореактор объемом 15 л и, наконец, получили до 1,1 x 1010 МСК из одной партии продукции. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. Кроме того, мы оценили качество продуктов hMSC для подтверждения соответствия. Мы также продемонстрировали применение этих растворимых микроносителей для масштабного производства двух других типов ячеек крепления, ячеек HEK293T и клеток Vero, которые широко применяются в отрасли CGT. Пиковая плотность клеток HEK293T клеток достигала 1,68 x 10 7 клеток/мл, тогда как пиковая плотность клеток Vero достигала 1,08 x 107 клеток/мл. Система ACISCP может быть адаптирована для культивирования различных адгезивных клеток, и потенциально она может стать мощной платформой, способствующей ускорению индустриализации CGT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человеческая пуповина была получена из пекинской больницы Цинхуа Чангэн. Все процедуры и протоколы, касающиеся получения, выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (ВЦМСК), проводились с информированного согласия и с одобрения Комитета по этике Пекинской больницы Цинхуа Чангэн (регистрационный номер 22035-4-02), а процедуры и протоколы соответствовали Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздним поправкам или сопоставимым этическим стандартам.

1. Монослойная культура мМСК, HEK293T-клеток и клеток Vero

  1. Выделяют первичные УКМСК человека из желе Уортона в соответствии с описанным методом21. Используйте безсывороточную (SF) питательную среду hMSC для выделения и отрастания первичных UCMSC, собирайте клетки на пассаже 2 и криоконсервируйте в качестве основного банка клеток (MCB).
  2. Инокуляцию 6 x10,5 человеческих UCMSC (предпочтительно клетки пассажа 2 или пассажа 3) в одну колбу T75 (т.е. плотность посева на 2D планарных сосудах составляет 8 000 клеток/см2) для монослойной культуры с 15 мл полной питательной среды SF hMSC. Обеспечьте равномерный высев, двигая колбу в виде восьмерки. Культивирование при 37 °C в 5%-ном инкубаторе клеточных культурCO2 до слияния 80%-90%.
  3. Для сбора урожая сцедите питательную среду и дважды промойте клетки 3-5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Затем добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C в течение 1-2 мин до тех пор, пока большинство клеток не станут круглыми и не отделятся от колбы, как это наблюдается под светлопольным инвертированным микроскопом с 4-кратным объективом. Добавьте 3 мл питательной среды SF hMSC для прекращения пищеварения.
  4. Переложите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 179 x g в течение 5 мин. Сцедите надосадочную жидкость, дважды промойте клеточную гранулу PBS и ресуспендируйте примерно в 3-5 мл питательной среды SF hMSC для посева на микроносители в биореакторах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте жизнеспособность клеток и убедитесь, что они жизнеспособны на >90%. Подготавливайте ячейки только после того, как все подготовительные работы для биореакторов будут завершены (шаги 2.1-3.6).
  5. Для монослойной культуры HEK293T клеток и клеток Vero посев по 2 x 10 6-3 x 106 клеток в каждую колбу T75 и культивирование с DMEM, содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% сыворотки новорожденных телят (NBS) соответственно.
  6. Выполните шаги 1.3-1.4 для сбора клеток. Ресуспендировать в 3-5 мл DMEM, содержащего 10% FBS.

2. Подготовка биореактора с перемешиванием перед посевом клеток

  1. На 1-й день тщательно промойте стеклянный сосуд проточной деионизированной (DI) водой один раз.
  2. Разберите все нержавеющие трубки и крыльчатки с головки, погрузите их в деионизированную воду и обработайте ультразвуковой очистительной машиной при 40 кГц и 60 °C в течение 1 часа для тщательной очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка и процедуры будут одинаковыми для расширения первого уровня в биореакторе объемом 5 л и расширения второго уровня в биореакторе объемом 15 л. Параметры биореактора объемом 15 л приведены в скобках. Если в скобках не указаны параметры, то эти параметры одинаковы для биореакторов объемом 5 л и 15 л.
  3. Тщательно убедитесь, что все уплотнительные кольца целы и на месте, а затем установите разобранные детали обратно на головку в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости замените все изношенные или порванные уплотнительные кольца перед сборкой. Изношенные уплотнительные кольца нарушают герметичность и, следовательно, стерильность сосуда.
  4. Добавьте 7 л (18 л для биореактора 15 л) 0,5 М раствора NaOH в сосуд объемом 5 л и поместите напорную пластину со собранными трубками на край сосуда, чтобы погрузить пробирки в раствор NaOH. Дайте настояться в течение 12 ч или в течение ночи, чтобы удалить эндотоксины из пробирок и стеклянного сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 7 л (18 л), так как это максимальный объем стеклянного сосуда объемом 5 л (15 л). При работе с раствором NaOH надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты, так как он вызывает коррозию.
  5. Снимите накладку и перелейте раствор NaOH в подходящую бутылку для отходов. Утилизируйте в соответствии с лабораторными правилами безопасности. Тщательно промойте сосуд, головную пластину и ее части деионизированной водой, не содержащей эндотоксинов, или водой для инъекций, чтобы удалить остатки щелочи.
  6. Добавьте 2 л (5 л) PBS в сосуд, соберите все детали и прикрутите головную пластину к металлическому каркасу сосуда в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Установите комплект расходных деталей закрытой системы на соответствующие детали/трубки/порты из нержавеющей стали (SS) на головке в соответствии с инструкциями производителя. Зажмите все зажимы Роберта на трубках, а также рекомендуется усилить зажимом гемостатами. Оставьте одну из трубок с вентиляционным фильтром 0,22 мкм на конце, который соединен с конденсатором, незажатой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наденьте силиконовые трубки на наконечники гемостатов, чтобы не проткнуть силиконовые трубки. Зажимайте только силиконовые трубки и избегайте зажима трубок C-flex, входящих в этот комплект. Если оставить одну трубку на конденсаторе незажатой, это позволит снизить давление во время автоклавирования.
  8. Приготовьте 250 мл 0,1 М раствора NaOH в автоклавируемой стеклянной бутылке GL 45 объемом 500 мл и установите многопортовую завинчивающуюся крышку GL 45 с двумя портами. Подсоедините силиконовую трубку длиной 180 мм, размером 0,13 x 0,25 дюйма (внутренний диаметр x внешний диаметр) к одному из портов на нижней стороне крышки; Длина должна быть достаточно большой, чтобы просто коснуться дна бутылки.
  9. Подсоедините еще один кусок силиконовой трубки, длиной на 500 мм длиннее предыдущего, к тому же порту на верхней стороне крышки, а другой конец подсоедините к отверстию для капельной подачи на верхней панели сосуда объемом 5 л. Подсоедините вентиляционный фильтр 0,22 мкм к другому порту на завинчивающейся крышке.
  10. Выполните двухточечную калибровку датчика pH в соответствии с инструкциями производителя. Затем вставьте датчики pH, растворенного кислорода (DO) и количества живых клеток в сосуд в соответствующие порты PG13,5 и плотно прикрутите к накладке.
  11. Выполните проверку герметичности полностью собранного сосуда в соответствии с инструкциями производителя. Поддерживайте давление 0,4 бар ± 0,01 бар не менее 30 мин. Медленно сбросьте давление после того, как система пройдет испытание. Если испытание на герметичность не удалось, внимательно найдите места утечки и укрепите резервуар в сборе.
  12. Автоклавируйте полностью собранный сосуд с помощью комплекта расходных материалов при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C в течение 60 минут. После автоклавирования проверьте все вентиляционные фильтры, чтобы убедиться, что они целы и сухие. Снимите все гемостаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр для отвода влажного воздуха не будет эффективно фильтровать газ и может нарушить стерильность сосуда во время культивирования клеток. Замените вентиляционные фильтры, если они влажные, и снова автоклавируйте весь сосуд.
  13. Перенесите автоклавный сосуд в чистое помещение и дождитесь полного остывания до комнатной температуры. Вставьте датчик температуры в трубку защитной гильзы и подсоедините кабели для двигателя, датчика pH и датчика растворенного кислорода от контроллера к соответствующим частям сосуда. Плотно оберните термомат вокруг сосуда.
  14. Разжмите зажимы Robert на гибких трубках конденсатора выхлопных газов, кольцевого разбрызгивателя, отверстия для капельной подачи NaOH и отверстия для накладки воздуха. Включите контроллер, авторизуйтесь и введите в систему параметры, перечисленные в таблице 1 , согласно инструкции производителя. Эти пробирки не следует зажимать ни в коем случае в процессе культивирования.
  15. Нажмите « Пуск» и назовите эксперимент для запуска биореактора. Дайте биореактору поработать с этими настройками не менее 12 часов или в течение ночи, чтобы насытить PBS кислородом, чтобы позже выполнить одноточечную калибровку зонда растворенного кислорода.
  16. Откалибруйте объемную скорость перекачки жидкости насоса 1 и насоса 2 на контроллере биореактора. Установите силиконовую трубку размером 0,13 дюйма x 0,25 дюйма на каждый насос отдельно, при этом один конец трубки погрузите в бутылку с водой, а другой конец трубки вставьте в мерный цилиндр.
  17. Установите скорость вращения насоса на 300 об/мин и время 1 мин. Обратите внимание на количество воды, подаваемой в мерный цилиндр для обоих насосов. Эти номера понадобятся для последующих шагов.
  18. Приготовьте 500 мл питательной среды SF hMSC в соответствии с инструкциями производителя и замените крышку флакона со средой для клеточных культур одноразовой крышкой контейнера C-Flex EZ Top и совместимой крышкой. Выполняйте замену колпачка в шкафу биобезопасности (BSC).
  19. Приварите выпускную трубку на бутылке со средой к входной трубке C-flex на бутылке 10 г предварительно стерилизованных микроносителей W01 для МСК. Установите секцию трубки на насос 1 контроллера биореактора, установите вращение насоса на 300 об/мин и закачайте всю питательную среду из флакона во флакон с микроносителями. Храните эти микроносители при температуре 4 °C до использования на 0-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроносители должны быть подготовлены в 1-й день. Для культуры в биореакторе объемом 15 л подготовьте в общей сложности четыре бутылки (т.е. 40 г с 4 x 500 мл среды SF).

3. Посев, культивирование и сбор урожая клеток в 5-литровом биореакторе с перемешиванием

  1. На день 0 выполните одноточечную калибровку, а именно 100%, для датчика растворенного кислорода на контроллере биореактора в соответствии с инструкциями производителя. Биореактор с перемешиванием теперь готов к культивированию клеток.
  2. Подготовьте стеклянную бутылку объемом 2 л (5 л) для сбора отходов, установите на нее завинчивающуюся крышку GL 45 Multiport Connector с двумя портами, с 30 мм, 0,25 дюйма x 0,44 дюйма C-Flex, подключенными к обоим портам, и автоклавом для стерилизации. Приварите трубку C-flex от одного из отверстий от бутылки для отходов к трубке для сбора урожая на верхней пластине сосуда биореактора с помощью трубчатого сварочного аппарата.
  3. Временно остановите контроль температуры, pH и растворенного кислорода на контроллере биореактора, установите силиконовую трубку, прикрепленную к трубке для сбора урожая, на перистальтический насос 2 в правильном направлении потока жидкости и полностью распределите весь PBS из емкости в бутылку для отходов. Выньте трубку из насоса, запечатайте и отсоедините бутылку для отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда снимайте зажимы Robert на гибких трубках, участвующих в потоке жидкости на каждом этапе. Зажмите обратно после завершения перекачки жидкости перед герметизацией и отсоединением. Зажим ближе к боковой стороне оголовья. Разжатие и зажим должны выполняться на всех последующих этапах, если не указано иное.
  4. Приготовьте 7 л (30 л) полной среды SF hMSC и замените каждую оригинальную крышку флакона одноразовой крышкой контейнера C-Flex EZ Top и совместимой крышкой. Приварите одноразовый фильтрующий модуль к одному из портов одноразового мешка для хранения объемом 10 л (50 л). Выполните операцию по замене колпачков внутри BSC.
  5. Отфильтруйте и перенесите питательную среду в мешок для хранения, по одной бутылке за раз, приварив флаконы с питательной средой к другому концу капсульного фильтра и используя насос на контроллере биореактора. Обозначьте как мешок для корма.
  6. Приварите одно выпускное отверстие от загрузочного мешка к трубке C-flex на подающей трубке верхней пластины и установите трубку для насоса 1 на контроллере биореактора. Приварите другое выпускное отверстие от загрузочного мешка к спускной трубке и установите трубку для насоса 2 на контроллере биореактора в правильном направлении потока жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите секцию на линии потока жидкости, изготовленную из силиконовой трубки, на насосе для лучшей стойкости к износу по сравнению с трубками C-Flex. Убедитесь, что трубки установлены в правильном направлении.
  7. Установите скорость насоса 1 на 300 об/мин и остановите насос после дозирования 1 л (5 л) среды из мешка для корма в емкость, исходя из скорости дозирования объема, указанной в шаге 2.17. Снова запустите контроль температуры, pH и растворенного кислорода с теми же настройками, что описаны в шаге 2.14.
  8. Запечатайте и отсоедините трубку, соединяющую мешок для корма с подающей трубкой на верхней пластине. Приварите трубку C-Flex от бутылки с дисперсными микроносителями, приготовленными на шаге 2.18, к подающей трубке и перекачайте все содержимое из бутылки в сосуд. Запечатайте и отсоедините пустую бутылку суспензии микроносителя. Продезинфицируйте всю поверхность бутылки 75% этанолом и поместите в BSC для использования в качестве бутылки для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При герметизации и отсоединении одноразовых принадлежностей оставляйте более длинный кусок трубки C-Flex со стороны накладки, так как на следующих этапах на одной и той же трубке будет выполнено несколько этапов сварки и разъединения.
  9. Убедитесь, что температура, отображаемая на контроллере, достигает устойчивого состояния 37 °C, что обычно занимает около 30 минут, прежде чем приступать к подготовке семенных клеток, как показано на шагах 1.3-1.4. Ресуспендировать 2,5 x 108 чМСК в 500 мл среды SF и перенести в пустую бутылку, ранее содержащую суспензию микроносителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные клетки для расширения биореактора объемом 15 л должны быть подготовлены в соответствии с этапом 3.21 с целью посева 1,0 x 109 ячеек в 500 мл.
  10. Приварите трубку C-Flex от бутылки, содержащей клеточную суспензию, к загрузочному отверстию на верхней пластине и перекачайте все содержимое из бутылки в сосуд, чтобы инициировать инокуляцию клеток к микроносителям. Закройте и отсоедините пустую бутылку. Приварите подающее отверстие от загрузочного мешка к подающей трубке на передней пластине.
  11. Отрегулируйте настройки перемешивания на контроллере, чтобы разрешить прерывистое перемешивание для повышения эффективности посева hMSC, установив следующие параметры: V1 = 35 (30) об/мин/5 мин; V2 = 0 об/мин/25 мин; количество циклов = 12 (24); Конечная скорость перемешивания = 35 (30) об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость перемешивания может быть отрегулирована до 40 (35) об/мин или 45 (40) об/мин, если в процессе культивирования наблюдается неравномерное распределение или осаждение микроносителей.
  12. Настройте автоматический режим пополнения и замены среды на контроллере биореактора в интерфейсе Medium Exchange. Задайте параметры культивирования hMSC, как указано в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе снимите зажимы Роберта с гибких трубок, участвующих в потоке жидкости, особенно для подающей и выпускной трубок. Держите их незажатыми на протяжении всего процесса культивирования.
  13. Возьмите пробы через пробоотборную трубку, подключив одноразовые пакеты для отбора проб через разъемы Люэра в желаемые моменты времени, обычно один раз в день, и аликвотируя 10 мл каждый раз в мешок для отбора проб. Аликвотируйте 2-3 мл образца в первый мешок для отбора проб, выбросьте, а затем каждый раз аликвотируйте фактические 10 мл образца в новый мешок для отбора проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный образец объемом 2-3 мл может быть жидкостью, оставшейся в пробирке от предыдущего момента отбора проб, и может не точно отражать состояние в сосуде. Всегда выполняйте эти действия с дополнительными асептическими мерами, дезинфицируя разъемы Луэра до и после создания или разрыва соединений 75% этанолом.
  14. Переложите отобранные образцы в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Выполните следующие испытания на образцах.
    1. Возьмите 200 мкл суспензии микроносителей, насыщенной клетками, и окрасьте с помощью Calcein-AM/PI Cell Double Staining в соответствии с инструкциями производителя. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом.
    2. Осаждение микроносителей происходит под действием силы тяжести, что обычно занимает 5-10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и проверьте концентрацию глюкозы глюкометром в соответствии с инструкциями производителя. Постройте график уровня глюкозы.
    3. Инкубируют осажденные микроносители, насыщенные клетками, со свежеприготовленным 3-5 мл раствора для переваривания 1 мг/мл при 37 °C в течение 20-30 мин до полного растворения микроносителей. Подсчитайте количество клеток после окрашивания с помощью AO/PI с помощью автоматизированного анализатора флуоресцентных клеток. Постройте кривую роста клеток. Коррелируйте с кривой роста живых клеток в реальном времени, генерируемой на контроллере.
  15. На 4-й или 5-й день культивирования приготовьте 50 мл (200 мл) раствора для переваривания в дозе 30 мг/мл. Соотношение рабочей массы между раствором дигеста и растворимыми микроносителями колеблется от 3:20 до 5:20. Стерильный фильтр с капсульным фильтром 0,22 мкм и далее разбавить в 500 мл (2 л) сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) с кальцием и магнием. Переложите в одноразовый пакет для хранения объемом 3 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте раствор для переваривания только непосредственно перед забором клеток. Старайтесь стремиться к тому, чтобы по крайней мере 1,0 x 10 9-1,2 x 109 клеток для расширения первого уровня и 1,0 x10 клеток для расширения второго уровня. Если клетки растут быстрее, собирайте урожай на 4 день; Если нет, собирайте урожай на 5-й день. Не рекомендуется выходить за пределы 5-го дня.
  16. Установите скорость перемешивания на 0 на контроллере, чтобы микроносители осели, что обычно происходит в течение 20 минут. Отключите протокол автоматического обмена сред и остановите контроль температуры, pH и растворенного кислорода на контроллере биореактора. Вручную запустите насос 2 при 300 об/мин на контроллере и выдавите надосадочную жидкость в режим подачи, чтобы оставить около 1 л (2 л) суспензии культуры в сосуде (используя скорость дозирования объема, указанную в шаге 2.17, или измеряя по градуировочным меткам на корпусе сосуда). Запечатайте и полностью отсоедините мешок для корма.
  17. Приварите пакет со свежеприготовленным раствором для переваривания из шага 3.15 к подающей трубке и перекачайте все содержимое в сосуд. Запустите скорость перемешивания с 45 (40) об/мин. Убедитесь, что регулятор температуры по-прежнему поддерживает температуру на уровне 37 °C. Микроносители растворяются в течение 40-60 минут. Берут 1 мл образца стерильным шприцем с замком Люэра через 30 мин и в дальнейшем каждые 5-10 мин наблюдать под светлопольным микроскопом для проверки растворения микроносителей.
  18. После того, как микроносители растворятся, приварите один мешок для хранения объемом 3 л (два мешка для хранения объемом 3 л для биореактора объемом 15 л) к трубке для сбора урожая и полностью откачайте клеточную суспензию с помощью насоса 2 при 300 об/мин. Приготовьте 1 л (3,5 л) физиологического раствора, содержащего 1% сывороточного альбумина человека (HSA) в качестве буфера для промывки, и 500 мл полной среды SF (500 мл буфера для криоконсервации клеток, в качестве примера взята рецептура из 10% диметилсульфата (ДМСО) и 90% среды SF) в отдельных одноразовых пакетах для хранения, используя методы и аксессуары, упомянутые в предыдущих шагах для других жидкостей.
  19. Включите систему обработки клеток, установите одноразовый комплект для обработки клеток на прибор в соответствии с инструкциями производителя, приварите мешки с клеточной суспензией, промывочным буфером и средой SF (буфер для криоконсервации) к набору для обработки одноразовых ячеек и внимательно следуйте всем инструкциям, отображаемым в пользовательском интерфейсе, чтобы инициализировать и проверить целостность и правильную установку набора.
  20. После завершения установки введите в программное обеспечение параметры, перечисленные в таблице 3 для промывки клеток с промывочным буфером и ресуспензией в среде SF (буфер криоконсервации), чтобы начать процесс промывки и ресуспензии. Вся процедура будет выполняться автоматически с несколькими ручными контрольными точками.
  21. Возьмите пробу клеток из камеры центрифуги, как указано в системе обработки клеток, и рассчитайте плотность клеток с помощью автоматизированного анализатора клеток в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте объем ресуспензии для плотности 2 x 10,6 клеток/мл или максимального общего объема 250 мл.
  22. Запечатайте и отсоедините пакет для переноса клеток от одноразового набора для обработки клеток после того, как система отсосет клетки из камеры. При необходимости отрегулируйте плотность клеток до 2 x 10,6 клеток/мл с полной средой SF в большем пакете для переноса клеток/пакете для хранения. Это будут затравочные ячейки для расширения второго яруса в 15-литровом биореакторе.

4. Состав, заполнение и отделка ячеек

  1. Начинайте подготовку 15-литрового биореактора за 1 день до забора клеток из 5-литрового биореактора. Полностью выполните шаги, описанные в разделах 2 и 3 протокола, за исключением параметров для 15 л, указанных в скобках.
  2. Повторно суспендируйте клетки в 250 мл буфера для криоконсервации, а затем запечатайте и отсоедините пакет для переноса клеток от одноразового набора для обработки клеток после того, как система отсосет клетки из камеры.
  3. Перенесите 2 000 мл буфера для криоконсервации вместе с 250 мл ресуспендированных клеток с этапа 4.2 в мешок для переноса клеток объемом 3 л. Приварите этот пакет для переноски к одноразовому комплекту расходных материалов Fill&Finish.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный объем используемого здесь буфера для криоконсервации должен определяться спецификацией рецептуры и расчетом общего количества клеток в соответствии с результатами подсчета, полученными на шаге 3.21
  4. Соберите одноразовый комплект расходных деталей Fill&Finish с системой наполнения ячейки и включите систему предварительного охлаждения в соответствии с инструкциями производителя. Следуйте инструкциям на системе и установите 20 мл / пакет, всего 20 пакетов на партию. Запечатайте и отсоедините эти пакеты от комплекта и следуйте стандартным процедурам криоконсервации. Используйте криогенные мешки.
  5. Приварите новый комплект из 20 пакетов для криоконсервации к одноразовому комплекту для заполнения и отделки и повторяйте процедуру заполнения и отделки до тех пор, пока все клетки не будут аликвотированы. Следуйте стандартным процедурам для криоконсервации этих клеток.

5. Характеристика качества клеток

  1. Берут пробы собранных МСК из растворимых микроносителей и используют систему обработки клеток для характеризации методом проточной цитометрии для определения идентичности клеток в соответствии с методами, описанными в литературе18.
  2. Разморозьте криоконсервированные клетки и переложите их на обычные 2D-колбы или микропланшеты для дальнейшей характеристики клеточных характеристик, включая морфологию клеток и способность к дифференцировке трех линий, следуя методам, описанным в литературе18.

6. HEK293T расширение на микроносителях G02 в биореакторе с перемешиванием

  1. Подготовьте биореактор объемом 5 л, как указано в шаге 2. Для HEK293T клеток культивируют клетки со стерильными микроносителями G02 вместо W01. Процесс культивирования аналогичен описанному в разделе 3 протокола, хотя некоторые параметры отличаются, как будет подробно описано в следующих шагах. Установите в биореактор специальную перфузионную трубку взамен дренажной трубки, так как перфузия необходима для культивирования HEK293T клеток.
  2. В отличие от протокола, подробно описанного в разделе 3 протокола, готовят 20 г микроносителей G02 (т.е. две бутылки) в DMEM с 10% FBS для 5-литрового биореактора, при этом объем культуры на 0-й день устанавливается равным 3,5 л (т.е. конечная концентрация около 5,71 г/л). Дозируют 2 л среды в сосуд перед двумя флаконами с микроносителями G02 и высевают 500 мл 1,75 x 109 HEK293T клеток (т. е. при конечной плотности 5 x 105 клеток/мл).
  3. Проводят режим перемешивания и режим обмена среды (в зависимости от количества среды, которое необходимо заменить в день, выраженного в объеме культуры в день, CVD), который отличается от раздела 3 протокола и подробно описан в таблице 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активируйте насос 1 и насос 2 вручную, чтобы оба могли непрерывно перекачивать для перфузии. Регулируйте скорость насоса каждый день, чтобы она соответствовала скорости перфузии на основе калибровки скорости дозирования объема насосов. Обычно это будет однозначный диапазон. Для HEK293T клеток используйте свежую среду в качестве корма и полностью выбрасывайте отработанную среду в мусорную бутылку, в отличие от МСК, для которых среда циркулирует.
  4. Для расширения второго яруса до биореактора объемом 15 л используйте перенос HEK293T ячеек из шарика в гранулу вместо полного растворения микроносителей, как это используется с МСК. В частности, прекратите перемешивание для осаждения микроносителей после достижения желаемой плотности клеток, а затем отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости из перфузионной трубки, подайте PBS в 3 раза больше объема оставшейся суспензии для промывания микроносителей и повторите три раза. Аспирируйте и выбросьте как можно больше PBS при окончательной стирке.
  5. Введите 3,5 л 1x рекомбинантного трипсина, чтобы отделить клетки от микроносителей, в то время как микроносители G02 останутся нетронутыми. Установите температуру 37 °C и скорость перемешивания 60 об/мин. Прекратите отслоение в течение 45 мин, когда отслоится более 80% клеток, при равном количестве полной среды.
  6. Перекачка непосредственно из порта сбора урожая в подготовленный резервуар объемом 15 л для расширения второго яруса.

7. Расширение клеток Vero на микроносителях V01 в биореакторе с перемешиванием

  1. Микроносители V01 получают путем переноса лиофилизированных микроносителей в сосуд биореактора вместе с PBS до концентрации 20 мг/мл. Соберите и простерилизуйте сосуд, как указано в разделе 2 протокола, но вместо этого в автоклаве в течение 30 минут.
  2. После стерилизации микроносители V01 естественным образом оседают. Замените надосадочную жидкость на основной DMEM два раза, используя дренажную и питательную трубки, и добавьте полный DMEM, содержащий 10% NBS, в 50%-75% объема сосуда, прежде чем перейти к разделу протокола 3 для посева и культивирования клеток.
  3. В отличие от протокола, подробно описанного в разделе 3 протокола, используйте 24 г микроносителей V01 для культуры клеток Vero объемом 4 л (т. е. конечная концентрация 6 г/л) и инокуляция 500 мл клеток 4 x 109 клеток Vero (т. е. при конечной плотности 1 x 106 клеток/мл).
  4. Выполните шаги 6.3-6.6 для параметров процесса культивирования и перехода на расширение второго уровня в биореакторе с перемешиванием объемом 15 л.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Платформа ACISCP представляет собой полностью закрытую систему, в которой используется ряд биореакторов с перемешиванием для расширения масштабирования, система обработки клеток для автоматизированного сбора и составления клеточных формулировок, а также система наполнения клеток (рис. 1). Адгезивные клетки прикрепляются к пористым микроносителям, которые могут быть диспергированы в биореакторе, таким образом достигая суспензионного культивирования адгезивных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как иммунотерапия, так и терапия стволовыми клетками используют живые клетки в качестве лекарств; Однако их конечные продукты не должны очищаться или стерилизоваться так же, как малые молекулы или вирусы. Таким образом, принцип качества по проектированию (QbD) всегда должен иметь в виду и применяться на практике к процессу химического производства и контроля (CMC) при производстве клеток23. Полностью закрытая система культивирования клеток, а также система обработки и система наполнения предпочтит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Y.D. является научным консультантом, а H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. и X.Y. являются сотрудниками Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Другие авторы не имеют коммерческого, имущественного или финансового интереса к продуктам или компаниям, описанным в этой статье. Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального научного фонда выдающихся молодых ученых (82125018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин ЭДТАBasalMediaS310JVИспользуется для сбора 2D-клеток.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500Это реагент, который специфически растворяет микроносители 3D TableTrix.
3D FloTrix MSC Serum Free MediumCytoNiche BiotechRMZ112Это среда без сыворотки и животного происхождения для роста и поддержания мезенхимальных стволовых клеток в 2D планарной культуре, а также в 3D культуре на микроносителях 3D TableTrix.
3D FloTrix Модуль фильтрации одноразовогоCytoNiche BiotechR020-00-10Этот модуль содержит 0,22 μ М капсульные фильтры используются для фильтрации питательной среды и перевариваемого раствора.
Одноразовый пакет для хранения 3D FloTrix (10 л)CytoNiche BiotechR020-00-03Используется в качестве мешка для корма для биореактора объемом 5 л.
3D FloTrix Одноразовый мешок для хранения (3 л)CytoNiche BiotechR020-00-01Используется в качестве мешков для посева клеток или переноса.
3D FloTrix Одноразовый мешок для хранения (50 л)CytoNiche BiotechR020-00-04Используется в качестве мешка для корма для биореактора объемом 15 л.
3D FloTrix vivaPACK Одноразовый наполнитель & Набор расходных материалов для финишной отделкиCytoNiche BiotechPACK-01-01Это стандартный набор, адаптированный к системе розлива и финишной обработки 3D vivaPACK.
3D FloTrix vivaPACK система наполнения и финиша для клетокCytoNiche BiotechvivaPACKДанная система представляет собой закрытое устройство для работы с жидкостями, с функциями автоматического смешивания и отвода газов. Клетки, ресуспендированные в буфере для криоконсервации, могут быть быстро и равномерно аликвотированы в 20 мешков на партию.
3D FloTrix vivaPREP PLUS система обработки клетокCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSДанная система представляет собой устройство на основе центрифуги непрерывного действия. Клетки могут быть сконцентрированы, промыты и ресуспензированы при полностью закрытых процедурах.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Одноразовый набор для обработки клетокCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00Это стандартный набор, адаптированный для 3D обработки клеток vivaPREP PLUS.
3D FloTrix vivaSPIN  биореактор 15 лCytoNiche BiotechFTVS15Этот биореактор включает в себя контроллер, стеклянный резервуар для перемешивания объемом 15 л и ассессора. Имеется специальная перфузионная трубка.
3D FloTrix vivaSPIN  биореактор 5 лCytoNiche BiotechFTVS05В этом биореакторе используется контроллер, стеклянный резервуар для перемешивания объемом 5 л и асессоры. Имеется специальная перфузионная трубка.
3D FloTrix vivaSPIN Закрытая система расходных материалов (10/15 л)CytoNiche BiotechR020-10-10Это стандартный комплект трубок, адаптированный к биореактору 3D vivaSPIN 15 л, содержащий мешки для отбора проб.
3D FloTrix vivaSPIN Закрытая система расходных материалов (2/5 л)CytoNiche BiotechR020-05-10Это стандартный комплект трубок, адаптированный к биореактору 3D vivaSPIN 5 л, содержащий мешки для отбора проб.
3D TableTrix микроносители G02CytoNiche BiotechG02-10-10gЭти пористые и разлагаемые микроносители подходят для HEK293T клеточной культуры. Они поставляются предварительно стерилизованными в упаковке 10 г/бутылка с трубками C-Flex для сварки с трубками на биореакторах.
3D TableTrix микроносители V01CytoNiche BiotechV01-100-10gЭти пористые и разлагаемые микроносители подходят для адгезивных клеточных культур, они поставляются в виде нестерилизованных микроносителей, которые необходимо автоклавировать в PBS перед использованием. Они особенно подходят для производства вакцин
3D TableTrix микроносители W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (одноразовая упаковка);
W01-200 (таблетки)Эти		пористые и разлагаемые микроносители подходят для адгезивных клеточных культур, особенно для клеток, которые необходимо собирать в качестве конечных продуктов. Они поставляются предварительно стерилизованными в упаковке 10 г/бутылка с трубками C-Flex для сварки с трубками на биореакторах. Продукт получил 2 квалификации для фармацевтических вспомогательных веществ от CDE с регистрационными номерами [F20200000496; F20210000003]. Он также получил квалификацию DMF для фармацевтических вспомогательных веществ от FDA с регистрационным номером [DMF:35481]
APC anti-human CD45 AntibodyBioLegend368512Используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК
Набор для двойного окрашивания Calcein-AM/PIDojindoC542Набор для двойного окрашивания Calcein-AM/PI используется для одновременного флуоресцентного окрашивания жизнеспособных и мертвых клеток. Этот набор содержит растворы Кальцеина-АМ и Йодида пропидиума (ПИ), которые окрашивают жизнеспособные и мертвые клетки соответственно.
Крышка для EZ Top Крышка контейнера для контейнеров NALGENE (500 мл)Saint-GobainCAP-38приведены только для примера, аналогичные продукты доступны у различных поставщиков, и если они имеют одинаковую функциональность, товары могут быть заменены другими брендами.
Трубки C-Flex, формула 374 (0,25 дюйма x 0,44 дюйма)Saint-Gobain374-250-3Используется для сварки и разъединения труб.
Пакет для заморозки CryoMACS 50Miltenyi Biotec 200-074-400Используется для расширения 3D FloTrix vivaPACK Одноразовый наполнитель и Набор расходных материалов для отделки.
Диметилсульфат (ДМСО) SigmaD2650-100mLИспользуется для приготовления раствора для криоконсервации.
Модифицированная среда Dulbecco Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJИспользуется для культивирования клеток HEK293T и Vero.
DURAN Original GL 45 Лабораторная бутылка (2 л)DWK для медико-биологических наук218016357Используется для сбора отходов из биореактора объемом 5 л.
DURAN Original GL 45 Лабораторная бутылка (5 л)DWK для медико-биологических наук218017353Используется для сбора отходов из биореактора объемом 15 л.
DURAN Original GL 45 Лабораторный флакон (500 мл)DWK медико-биологический218014459Используется для дополнительной бутылки 0,1 М NaOH.
Крышки для контейнеров EZ Top для контейнеров NALGENE (500 мл)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Бренды и каталожные номера приведены только для примера, аналогичные продукты доступны у различных поставщиков, и если они имеют одинаковую функциональность, товары могут быть заменены другими брендами.
Фетальная бычья сыворотка (FBS) высшего качестваWisent086-150Используется для культивирования HEK293T клеток.
Антитело к CD14 человека FITCBioLegend301804Используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
Антитело FITC к CD34BioLegend343504используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
Антитело FITC к человеческому CD90 (Thy1)BioLegend328108Используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
Проточная цитометрияBeckman CoulterCytoFLEXИспользуется для оценки идентичности клеток.
Флуоресцентный клеточный анализаторAlit life scienceCountstar Rigel S2Используется для подсчета клеток. Жизнеспособность клеток можно рассчитать путем окрашивания красителями AO/PI.
GL 45 Винтовая крышка для многопортового разъема с 2 портами DWK Life Sciences292632806Brands и каталожные номера приведены только для примера, аналогичные продукты доступны у различных поставщиков, и если они имеют одинаковую функциональность, товары могут быть заменены другими брендами.
ГлюкометрSinocare6243578Используется для определения концентрации глюкозы в клеточной культуральной среде и надосадочной жидкости.
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), с кальцием и магниемGibco14025092используется для приготовления раствора для дигеста.
Человеческий альбумин 20% Behring (HSA)CSL BehringN/AИспользуется для приготовления буфера для стирки.
Инвертированный флуоресцентный микроскопOLYMBUSCKX53SFИспользуется для наблюдения и визуализации поля и флуоресцентной
Измерительный цилиндр Nalgene (500 мл)Thermo Scientific3662-0500PKИспользуется для калибровки объемной скорости перекачки жидкости перистальтических насосов.
Сыворотка для новорожденных телят (NBS) сверхтонкаяMINHAI BIOSC101.02Используется для культивирования клеток Vero.
Набор для адипогенной дифференцировки и характеризации мезенхимальных стволовых клеток человекаOriCell CyagenHUXUC-90031Используется для трехлинейной дифференцировки hUCMSC.
Набор для хондрогенной дифференцировки и характеризации мезенхимальных стволовых клеток человекаOriCell CyagenHUXUC-90041Используется для трехлинейной дифференцировки hUCMSC.
Набор для остеогенной дифференцировки и характеризации мезенхимальных стволовых клеток человекаOriCell CyagenHUXUC-90021Используется для трехлинейной дифференцировки hUCMSC.
ПЭ античеловеческое антитело к CD105BioLegend800504используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
Антитело к CD19 ТЭЛАBioLegend302208Используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
ПЭ античеловеческий CD73 (экто-5'-нуклеотидаза) антителоBioLegend344004используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
ПЭ античеловеческое антитело к HLA-DRBioLegend307605Используется в проточной цитометрии для оценки идентичности МСК.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Wisent311-010-CLИспользуется при автоклавировании стеклянного сосуда и микроносителей V01, а также при замене питательной среды.
Санитарно-гигиенические силиконовые трубки платинового отверждения Sani-tech (0,13 дюйма x 0,25 дюйма)Saint-GobainULTRA-C-125-2FИспользуется для перекачки раствора, приводимого в действие перистальтическими насосами.
Стерильный физиологический растворHopebiolHBPP008-500Используется для приготовления промывочного буфера.
Трипзим рекомбинантный трипсинBasalMediaS342JVЭтот реагент используется для переноса клеток HEK293T и Vero от бусины к бусинам.
Герметик для трубYingqi BiotechTube Sealer IЭтот герметик совместим как с трубками C-Flex, так и с трубками из ПВХ.
Сварочный аппарат для труб из ПВХChu BiotechTube Welder Micro IИспользуется для сварки трубок из ПВХ.
Сварочный аппарат для труб из ТЭПYingqi BiotechI-V2Используется для сварки труб из ТЭП.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLДвойная флуоресцентная жизнеспособность, с использованием акридина оранжевого (AO) и йодида пропидия (PI), является рекомендуемым методом для точного анализа жизнеспособности первичных клеток, таких как PBMC, и стволовых клеток в образцах, содержащих мусор.
использования .Бренды и каталожные номера визуализации. Сварочный аппарат для труб

Ссылки

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225(2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92(2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722(2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178(2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176(2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765(2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636(2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70(2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GMP
Крупномасштабное производство клеток на основе растворимых пористых микроносителей GMP-класса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.