Этот протокол включает в себя трансфекцию датчиков cAMP и bPAC-nLuc, оптогенетического белка, для точного отслеживания его клеточного распределения и реакции на световую стимуляцию. Инновационный подход к созданию карты ответа цАМФ с использованием системы точечного сканирования имеет потенциал для продвижения исследований оптогенетических белков в различных областях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Картирование клеточного распределения оптогенетического белка с помощью светостимулирующей сетки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Наша цель состояла в том, чтобы точно отследить клеточное распределение оптогенетического белка и оценить его функциональность в определенном цитоплазматическом месте. Для достижения этой цели мы провели котрансфекцию клеток с ядерными сенсорами цАМФ и разработанным в лаборатории оптогенетическим белком, бактериальной фотоактивируемой аденилатциклазой-нанолюциферазой (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc при стимуляции светом с длиной волны 445 нм или люциферазными субстратами генерирует аденозин-3',5'-циклический монофосфат (цАМФ). Мы использовали твердотельный лазерный осветитель, подключенный к системе точечного сканирования, что позволило нам создать сетчатый/матричный узор из небольших освещенных пятен (~1мкм2) по всей цитоплазме клеток HC-1. Таким образом, мы смогли эффективно отслеживать распределение bPAC-nLuc, нацеленных на ядерные технологии, и создать всеобъемлющую карту ответных мер cAMP. Эта карта точно отражала клеточное распределение bPAC-nLuc, и его реакция на световую стимуляцию варьировалась в зависимости от количества белка в освещенном пятне. Этот инновационный подход способствует расширению набора методов, доступных для исследования клеточных оптогенетических белков. Возможность картографировать его распространение и реакцию с высокой точностью имеет далеко идущие перспективы и может продвинуть вперед в различных областях исследований.
Введение
Оптогенетика, рожденная как инструмент, который произвел революцию в нейронауках, теперь является растущей областью исследований и растущей технологией, регулярно используемой многими лабораториями по всему миру и в различных областях исследований в биологии. Мы разработали bPAC-nLuc, универсальный оптогенетический белок, путем слияния светочувствительной аденилциклазы (AC) из Beggiatoa sp. (бактериальная фотоактивируемая аденилциклаза; bPAC) с нанолюциферазой (nLuc)1,2,3. При стимуляции синим светом bPAC продуцирует второй мессенджер 3',5'-циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). nLuc - это недавно разработанная маленькая люцифераза, которая в присутствии одного из своих субстратов может генерировать биолюминесценцию и активировать cAMP production4. Таким образом, этот оптогенетический белок может быть активирован временно с помощью коротких световых импульсов или устойчиво с помощью фуримазина или других субстратов люциферазы, что позволяет нам имитировать различные сигнальные паттерны цАМФ и оценивать клеточные реакции (активация факторов транскрипции, экспрессия генов, пролиферация клеток, миграция и т. д.). Последние достижения в области передачи сигналов2-го мессенджера подчеркивают важность событий, происходящих в очень ограниченных цитозольных областях (например, эндосомальная продукция цАМФ для фосфорилирования белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB) или микродомены Ca2+ для транслокации ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT) в ядро)5,6. Поэтому важно разработать последовательные и систематические стратегии для оценки, имитации и блокирования передачи сигналов из этих компартментов в живых клетках. Чтобы продемонстрировать способность bPAC-nLuc специфически активироваться в различных клеточных компартментах, мы совместно трансфицировали клеточную линию гепатомы (HC-1) с bPAC-nLuc, нацеленным на ядро, и H208, резонансным датчиком передачи энергии Фёрстера (FRET) cAMP (NLS-BPAC-NLuc; NLS-H208). Клетки HC-1, полученные из линии HTC, лишены поддающейся анализу активности AC, что приводит к очень низким базальным уровням цАМФ, что делает их идеальными для измерения предполагаемой продукции цАМФ, используя при этом преимущества полного динамического диапазона датчиков FRET7,8. Используя твердотельный лазер (445 нм, LDI-7, 89 North), подключенный к системе сканирования точек (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), мы описываем протокол систематической стимуляции очень маленьких круглых областей или пятен (~1мкм2) в отдельных клетках. Система сканирования точек была подключена к одному из бэкпортов двухдекового микроскопа, что позволило стимулировать клетки и выполнять измерения FRET одновременно по независимому световому тракту. В этом протоколе мы представляем метод, в котором программное обеспечение SysCon Geo, поставляемое с системой стимуляции Rapp OptoElectronic, используется для выполнения комплексного сканирования цитоплазмы клеток. Этот подход включает в себя создание карты реакции цАМФ путем настройки последовательности включений, которые стимулируют клетки в виде сетки (Рисунок 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток HC-1 и подготовка к визуализации
- Поддерживайте клетки HC-1 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 МЕ/л), стрептомицина (100 мг/л) и L-глутамина в 10-сантиметровых чашках и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2, в 95% увлажненном воздухе.
- Пропускайте клетки каждые 2-4 дня, как только клетки слияются на ~90%, используя разведения 1:5 или 1:10.
- Затравочные клетки для трансфекции на стеклянных покровных листах за 2 дня до эксперимента.
- Работая в стерильных условиях в капюшоне для культуры тканей с предварительно подогретыми средами и PBS, отсасывайте среду из почти сливающейся чашки клеток и аккуратно промойте 5 мл PBS.
- Аспирируйте PBS и добавьте 1 мл трипсина. Инкубировать при 37 °C в течение 3-5 минут, пока клетки не отделятся.
- Ресуспендируйте клетки в 4 мл среды и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
- С помощью гемоцитометра подсчитывают количество клеток и рассчитывают плотность клеток.
- Разбавьте клетки до плотности 1,5 х 104 ячейки/мл.
- Пипетку 2 мл клеточной суспензии на стеклянные покровные стекла толщиной 25 мм с покрытием из поли-D-лизина в 6-луночной чашке.
- Инкубируйте клетки в течение примерно 24 ч в инкубаторе до 70% слияния.
- Трансфектируют клетки с помощью трансфекционного набора в соответствии с инструкциями производителя в соотношении 0,25 г ДНК NLS-bPAC-nLuc/0,75 г ДНК NLS-H208 на 3 мкл реагента для трансфекции и 2 мкл реагента P3000, разведенного в среде Opti-MEM без фенолового красного.
- Поместите клетки в инкубатор на ~48 часов, чтобы обеспечить достаточную экспрессию bPAC-nLuc, необходимую для производства обнаруживаемых уровней cAMP.
Примечание: Минимально необходимый уровень экспрессии bPAC-nLuc будет варьироваться в зависимости от мощности системы стимуляции и параметров стимуляции. - Подготовьте ячейки на покровных листах для визуализации.
- Отсадите среду из одной лунки и дважды промойте 2 мл PBS.
- Осторожно поднимите покровный лист с помощью щипцов и поместите его в камеру визуализации.
- Добавьте 1 мл Opti-MEM с недостаточным феноловым красным в камеру визуализации. Клетки также могут быть визуализированы в HBSS или любом другом физиологическом растворе, совместимом с флуоресценцией.
2. Моделирование света и визуализация живых клеток
- Проводите культивирование клеток и манипуляции с клетками, экспрессирующими NLS-bPAC-nLuc, в темноте. Чтобы избежать воздействия длин волн <500 нм, используйте красную лампу безопасного света (Таблица материалов) с янтарной компактной люминесцентной лампой мощностью 13 Вт (Таблица материалов).
- Проводите эксперименты на моторизованном двухдековом микроскопе (Table of Materials), оснащенном 6-линейным мультисветодиодным световым модулем (Table of Materials), колесом фильтра излучения (Table of Materials), XY-столиком (Table of Materials), цифровой CMOS-камерой ORCA-Fusion (Table of Materials) и масляным объективом 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Получение изображений с помощью программного обеспечения для цифровой микроскопии (Table of Materials). Эта установка способна стимулировать клетки и выполнять измерения FRET одновременно с использованием независимого светового тракта, оснащенного дихроичным фильтром ZT458rdc (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любую установку регистрации, если она позволяет одновременно проводить оптогенетическую стимуляцию и FRET/интенсиометрическую визуализацию с совместимым датчиком. - Включите геосистему UGA - 42. Включите микроскоп и настройте его с соответствующими параметрами, которые будут получены с помощью датчика H208 FRET. Конфигурация сбора данных будет зависеть от уровней экспрессии датчика FRET. Типичными параметрами являются время моделирования 40 мс для YFP/mScarletI, мощность светодиода 15% и частота 0,5 Гц.
- Откройте программное обеспечение SysCon и программное обеспечение для обработки изображений, которое управляет микроскопом.
- В окне «Камера» выберите вкладку «Калибровка» и выберите длину волны лазера, совместимую с оптогенетическим белком. Для стимуляции bPAC-nLuc используют длину волны 445 нм.
- Калибруйте систему перед каждым использованием. Это важно, потому что небольшие колебания в настройке или даже изменения комнатной температуры (RT) могут изменить точность стимуляции.
- В окне камеры выберите вкладку Камера и нажмите кнопку <Начать съемку> чтобы начать съемку из программного обеспечения для визуализации.
- В окне Image Viewer визуализируйте визуальную или предварительную регистрацию флуоресценции клеток, полученную из программного обеспечения для визуализации, которая будет определять позиционирование объектов стимуляции.
- Используйте режим «Щелчок и огонь», чтобы быстро оценить реакцию отдельной ячейки перед началом эксперимента.
- В окне Sequence-Manager выберите <добавить> чтобы создать новую последовательность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться в правильности калибровки системы, нарисуйте различные формы и размеры в окне просмотра изображений. Они должны точно соответствовать шаблонам стимуляции, проецируемым на клетки, обеспечивая точное согласование с предполагаемой конструкцией. - В окне просмотра изображений выберите значок «Круглый» на панели инструментов слева, чтобы нарисовать объекты круговой стимуляции.
- Создайте несколько небольших одинаковых кругов и равномерно распределите их, чтобы обеспечить однородное покрытие всей цитоплазмы стимулируемых клеток.
- Щелкните правой кнопкой мыши по каждому из них, чтобы проверить однородность объектов круговой стимуляции. Появится окно; С его помощью можно изучить их радиус, положение и т.д.
- Установите радиус от 1 до 5, в зависимости от используемой цели и размера ячейки.
- Чтобы обеспечить равномерное расстояние между кругами и их выравнивание, используйте кнопку <Привязка к сетке> в подокне «Вид». Кроме того, задайте свойства сетки с помощью кнопки <Задать сетку>
- Убедитесь, что сетка или матрица равномерно расположенных круговых объектов стимуляции полностью покрывает клетку, а ее размер (например, 6 x 6 или 10 x 10) определяется размером клетки. В качестве контроля для нулевой стимуляции, которая не должна вызывать никаких клеточных событий, включите несколько кругов, расположенных за пределами клетки.
- Каждый объект, созданный в окне «Просмотрщик изображений», будет отображаться в окне «Временная шкала».
- В подокне Время объекта настройте временные свойства каждого объекта стимуляции (время начала, продолжительность, задержка).
- В подокне Источник света настройте длину волны и интенсивность каждого объекта. Для этого протокола убедитесь, что каждый объект использует одинаковую длину волны и идентичен по длительности и интенсивности. Время начала будет разным для каждого объекта, а задержка между ними может варьироваться в зависимости от ожидаемого результата, чтобы избежать наложения эффекта различных стимулов.
- В окне «Временная шкала» при необходимости измените последовательность, в которой будет активирован каждый объект стимуляции. Настраивайте стимуляции в обычном порядке (например, слева направо, сверху вниз) или в случайном порядке, в зависимости от конкретного эксперимента.
- Загрузите последовательность в систему и настройте количество циклов (прогонов) последовательности, которые будет выполнять система.
- Разместите области интереса (ROI) в программном обеспечении для обработки изображений в нужных местах.
- Начните получение флуоресцентных изображений с помощью микроскопа и нажмите в окне UGA-42.
3. Анализ данных
- Несмотря на то, что программное обеспечение, предоставляемое системой стимуляции, позволяет сохранять последовательности для дальнейшего использования, оно не записывает фактическую информацию об эксперименте. Поэтому тщательно задокументируйте все детали, связанные с точками стимуляции и последовательностями, используемыми во время эксперимента, включая такие параметры, как положение, интенсивность, продолжительность, количество запусков и т. д. Задокументируйте любые другие соответствующие экспериментальные условия, такие как фармакологические препараты или конкретные растворы.
- Во время эксперимента расположите назначенные ROI в программном обеспечении для визуализации, чтобы зафиксировать изменения интенсивности флуоресценции всей клетки или определенных мест внутри клеток.
- Обратите особое внимание на расположение ROI относительно точек стимуляции. Измерьте изменения интенсивности флуоресценции в пределах или далеко от стимулируемых областей. Отрегулируйте положение ROI после эксперимента, предоставив программное обеспечение для обработки изображений, позволяющее сохранять изображения, полученные во время эксперимента, а не только значения интенсивности ROI.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты, представленные на рисунке 1, показывают, что только стимуляция, направленная на ядро клетки, приводила к заметному повышению уровня cAMP. Это подтверждает, что NLS-bPAC-nLuc экспрессируется исключительно в ядерном компартменте клеток HC-1. С помощью такого сеточного/матричного паттерна можно точно стимулировать оптогенетический белок для картирования его внутриклеточного распределения. Кроме того, более выраженное повышение уровня cAMP в центре яд...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цель этого исследования состояла в том, чтобы точно контролировать внутриклеточное распределение оптогенетического белка и оценить его эффективность в пределах определенного цитоплазматического компартмента. Мы также показали точные возможности стимуляции системы точечного сканирования клеток, экспрессирующих оптогенетический белок. Для достижения этой цели мы использовали нацеленный на ядро bPAC-nLuc с высоким уровнем экспрессии, но очень ограниченным распределением, ограниченным ядром. Результаты показали, что точки ст...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Финансирование было предоставлено грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 GM099775 и GM130612 D.L.A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Янтарная компактная люминесцентная лампа мощностью 13 Вт - фотонные разработки с низким уровнем синего света | |||
| 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-линейный мультисветодиодный люменкор спектры x | люменкор | 6-строчный мультисветодиодный световой модуль | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Обычная фетальная бычья сыворотка | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Чехол для очков: круги | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 темно-красный фильтр safelight 5.5" | Kodak | 1416827 | Красная лампа безопасного света |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | разбавлен до 1x, скорректированный pH |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-глутамин | Thermo Fischer | BW17605E | |
| липофектамин 3000 | Thermo Fischer | L3000001 | |
| Olympus IX83 моторизованный двухпалубный Микроскоп | Olympus | Моторизованный двухдековый микроскоп | |
| Opti-MEM, без фенола красного | Thermo Fischer | 11058021 | |
| цифровой CMOS камерой ORCA-fusion | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| фосфатный буферный раствор (1x) | Lonza | 17516F | |
| Prior emission emission wheel и фильтрующие комплекты | Prior Scientific, Inc. | Колесо фильтра выбросов | |
| Приор Proscan XY stage | Prior Scientific, Inc. | XY сцена | |
| Slidebook 6 | Инновации в области интеллектуальной визуализации Программное | обеспечение для цифровой микроскопии | |
| Программное обеспечение SysCon | Программное | Программное обеспечение, предоставляемое системой стимуляции | |
| УГА-42 Гео | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA масляный объектив (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dichroic | Chroma Technology Corp | BS, длина волны (CWL): 498 нм |
Ссылки
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
