Method Article

Картирование клеточного распределения оптогенетического белка с помощью светостимулирующей сетки

DOI:

10.3791/65471

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Addgene

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол включает в себя трансфекцию датчиков cAMP и bPAC-nLuc, оптогенетического белка, для точного отслеживания его клеточного распределения и реакции на световую стимуляцию. Инновационный подход к созданию карты ответа цАМФ с использованием системы точечного сканирования имеет потенциал для продвижения исследований оптогенетических белков в различных областях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша цель состояла в том, чтобы точно отследить клеточное распределение оптогенетического белка и оценить его функциональность в определенном цитоплазматическом месте. Для достижения этой цели мы провели котрансфекцию клеток с ядерными сенсорами цАМФ и разработанным в лаборатории оптогенетическим белком, бактериальной фотоактивируемой аденилатциклазой-нанолюциферазой (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc при стимуляции светом с длиной волны 445 нм или люциферазными субстратами генерирует аденозин-3',5'-циклический монофосфат (цАМФ). Мы использовали твердотельный лазерный осветитель, подключенный к системе точечного сканирования, что позволило нам создать сетчатый/матричный узор из небольших освещенных пятен (~1мкм2) по всей цитоплазме клеток HC-1. Таким образом, мы смогли эффективно отслеживать распределение bPAC-nLuc, нацеленных на ядерные технологии, и создать всеобъемлющую карту ответных мер cAMP. Эта карта точно отражала клеточное распределение bPAC-nLuc, и его реакция на световую стимуляцию варьировалась в зависимости от количества белка в освещенном пятне. Этот инновационный подход способствует расширению набора методов, доступных для исследования клеточных оптогенетических белков. Возможность картографировать его распространение и реакцию с высокой точностью имеет далеко идущие перспективы и может продвинуть вперед в различных областях исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптогенетика, рожденная как инструмент, который произвел революцию в нейронауках, теперь является растущей областью исследований и растущей технологией, регулярно используемой многими лабораториями по всему миру и в различных областях исследований в биологии. Мы разработали bPAC-nLuc, универсальный оптогенетический белок, путем слияния светочувствительной аденилциклазы (AC) из Beggiatoa sp. (бактериальная фотоактивируемая аденилциклаза; bPAC) с нанолюциферазой (nLuc)1,2,3. При стимуляции синим светом bPAC продуцирует второй мессенджер 3',5'-циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). nLuc - это недавно разработанная маленькая люцифераза, которая в присутствии одного из своих субстратов может генерировать биолюминесценцию и активировать cAMP production4. Таким образом, этот оптогенетический белок может быть активирован временно с помощью коротких световых импульсов или устойчиво с помощью фуримазина или других субстратов люциферазы, что позволяет нам имитировать различные сигнальные паттерны цАМФ и оценивать клеточные реакции (активация факторов транскрипции, экспрессия генов, пролиферация клеток, миграция и т. д.). Последние достижения в области передачи сигналов2-го мессенджера подчеркивают важность событий, происходящих в очень ограниченных цитозольных областях (например, эндосомальная продукция цАМФ для фосфорилирования белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB) или микродомены Ca2+ для транслокации ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT) в ядро)5,6. Поэтому важно разработать последовательные и систематические стратегии для оценки, имитации и блокирования передачи сигналов из этих компартментов в живых клетках. Чтобы продемонстрировать способность bPAC-nLuc специфически активироваться в различных клеточных компартментах, мы совместно трансфицировали клеточную линию гепатомы (HC-1) с bPAC-nLuc, нацеленным на ядро, и H208, резонансным датчиком передачи энергии Фёрстера (FRET) cAMP (NLS-BPAC-NLuc; NLS-H208). Клетки HC-1, полученные из линии HTC, лишены поддающейся анализу активности AC, что приводит к очень низким базальным уровням цАМФ, что делает их идеальными для измерения предполагаемой продукции цАМФ, используя при этом преимущества полного динамического диапазона датчиков FRET7,8. Используя твердотельный лазер (445 нм, LDI-7, 89 North), подключенный к системе сканирования точек (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), мы описываем протокол систематической стимуляции очень маленьких круглых областей или пятен (~1мкм2) в отдельных клетках. Система сканирования точек была подключена к одному из бэкпортов двухдекового микроскопа, что позволило стимулировать клетки и выполнять измерения FRET одновременно по независимому световому тракту. В этом протоколе мы представляем метод, в котором программное обеспечение SysCon Geo, поставляемое с системой стимуляции Rapp OptoElectronic, используется для выполнения комплексного сканирования цитоплазмы клеток. Этот подход включает в себя создание карты реакции цАМФ путем настройки последовательности включений, которые стимулируют клетки в виде сетки (Рисунок 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток HC-1 и подготовка к визуализации

  1. Поддерживайте клетки HC-1 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 МЕ/л), стрептомицина (100 мг/л) и L-глутамина в 10-сантиметровых чашках и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2, в 95% увлажненном воздухе.
  2. Пропускайте клетки каждые 2-4 дня, как только клетки слияются на ~90%, используя разведения 1:5 или 1:10.
  3. Затравочные клетки для трансфекции на стеклянных покровных листах за 2 дня до эксперимента.
    1. Работая в стерильных условиях в капюшоне для культуры тканей с предварительно подогретыми средами и PBS, отсасывайте среду из почти сливающейся чашки клеток и аккуратно промойте 5 мл PBS.
    2. Аспирируйте PBS и добавьте 1 мл трипсина. Инкубировать при 37 °C в течение 3-5 минут, пока клетки не отделятся.
    3. Ресуспендируйте клетки в 4 мл среды и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. С помощью гемоцитометра подсчитывают количество клеток и рассчитывают плотность клеток.
    5. Разбавьте клетки до плотности 1,5 х 104 ячейки/мл.
    6. Пипетку 2 мл клеточной суспензии на стеклянные покровные стекла толщиной 25 мм с покрытием из поли-D-лизина в 6-луночной чашке.
    7. Инкубируйте клетки в течение примерно 24 ч в инкубаторе до 70% слияния.
  4. Трансфектируют клетки с помощью трансфекционного набора в соответствии с инструкциями производителя в соотношении 0,25 г ДНК NLS-bPAC-nLuc/0,75 г ДНК NLS-H208 на 3 мкл реагента для трансфекции и 2 мкл реагента P3000, разведенного в среде Opti-MEM без фенолового красного.
  5. Поместите клетки в инкубатор на ~48 часов, чтобы обеспечить достаточную экспрессию bPAC-nLuc, необходимую для производства обнаруживаемых уровней cAMP.
    Примечание: Минимально необходимый уровень экспрессии bPAC-nLuc будет варьироваться в зависимости от мощности системы стимуляции и параметров стимуляции.
  6. Подготовьте ячейки на покровных листах для визуализации.
    1. Отсадите среду из одной лунки и дважды промойте 2 мл PBS.
    2. Осторожно поднимите покровный лист с помощью щипцов и поместите его в камеру визуализации.
    3. Добавьте 1 мл Opti-MEM с недостаточным феноловым красным в камеру визуализации. Клетки также могут быть визуализированы в HBSS или любом другом физиологическом растворе, совместимом с флуоресценцией.

2. Моделирование света и визуализация живых клеток

  1. Проводите культивирование клеток и манипуляции с клетками, экспрессирующими NLS-bPAC-nLuc, в темноте. Чтобы избежать воздействия длин волн <500 нм, используйте красную лампу безопасного света (Таблица материалов) с янтарной компактной люминесцентной лампой мощностью 13 Вт (Таблица материалов).
  2. Проводите эксперименты на моторизованном двухдековом микроскопе (Table of Materials), оснащенном 6-линейным мультисветодиодным световым модулем (Table of Materials), колесом фильтра излучения (Table of Materials), XY-столиком (Table of Materials), цифровой CMOS-камерой ORCA-Fusion (Table of Materials) и масляным объективом 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Получение изображений с помощью программного обеспечения для цифровой микроскопии (Table of Materials). Эта установка способна стимулировать клетки и выполнять измерения FRET одновременно с использованием независимого светового тракта, оснащенного дихроичным фильтром ZT458rdc (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любую установку регистрации, если она позволяет одновременно проводить оптогенетическую стимуляцию и FRET/интенсиометрическую визуализацию с совместимым датчиком.
  3. Включите геосистему UGA - 42. Включите микроскоп и настройте его с соответствующими параметрами, которые будут получены с помощью датчика H208 FRET. Конфигурация сбора данных будет зависеть от уровней экспрессии датчика FRET. Типичными параметрами являются время моделирования 40 мс для YFP/mScarletI, мощность светодиода 15% и частота 0,5 Гц.
  4. Откройте программное обеспечение SysCon и программное обеспечение для обработки изображений, которое управляет микроскопом.
  5. В окне «Камера» выберите вкладку «Калибровка» и выберите длину волны лазера, совместимую с оптогенетическим белком. Для стимуляции bPAC-nLuc используют длину волны 445 нм.
  6. Калибруйте систему перед каждым использованием. Это важно, потому что небольшие колебания в настройке или даже изменения комнатной температуры (RT) могут изменить точность стимуляции.
  7. В окне камеры выберите вкладку Камера и нажмите кнопку <Начать съемку> чтобы начать съемку из программного обеспечения для визуализации.
  8. В окне Image Viewer визуализируйте визуальную или предварительную регистрацию флуоресценции клеток, полученную из программного обеспечения для визуализации, которая будет определять позиционирование объектов стимуляции.
  9. Используйте режим «Щелчок и огонь», чтобы быстро оценить реакцию отдельной ячейки перед началом эксперимента.
  10. В окне Sequence-Manager выберите <добавить> чтобы создать новую последовательность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться в правильности калибровки системы, нарисуйте различные формы и размеры в окне просмотра изображений. Они должны точно соответствовать шаблонам стимуляции, проецируемым на клетки, обеспечивая точное согласование с предполагаемой конструкцией.
  11. В окне просмотра изображений выберите значок «Круглый» на панели инструментов слева, чтобы нарисовать объекты круговой стимуляции.
  12. Создайте несколько небольших одинаковых кругов и равномерно распределите их, чтобы обеспечить однородное покрытие всей цитоплазмы стимулируемых клеток.
  13. Щелкните правой кнопкой мыши по каждому из них, чтобы проверить однородность объектов круговой стимуляции. Появится окно; С его помощью можно изучить их радиус, положение и т.д.
  14. Установите радиус от 1 до 5, в зависимости от используемой цели и размера ячейки.
  15. Чтобы обеспечить равномерное расстояние между кругами и их выравнивание, используйте кнопку <Привязка к сетке> в подокне «Вид». Кроме того, задайте свойства сетки с помощью кнопки <Задать сетку>
  16. Убедитесь, что сетка или матрица равномерно расположенных круговых объектов стимуляции полностью покрывает клетку, а ее размер (например, 6 x 6 или 10 x 10) определяется размером клетки. В качестве контроля для нулевой стимуляции, которая не должна вызывать никаких клеточных событий, включите несколько кругов, расположенных за пределами клетки.
  17. Каждый объект, созданный в окне «Просмотрщик изображений», будет отображаться в окне «Временная шкала».
    1. В подокне Время объекта настройте временные свойства каждого объекта стимуляции (время начала, продолжительность, задержка).
    2. В подокне Источник света настройте длину волны и интенсивность каждого объекта. Для этого протокола убедитесь, что каждый объект использует одинаковую длину волны и идентичен по длительности и интенсивности. Время начала будет разным для каждого объекта, а задержка между ними может варьироваться в зависимости от ожидаемого результата, чтобы избежать наложения эффекта различных стимулов.
  18. В окне «Временная шкала» при необходимости измените последовательность, в которой будет активирован каждый объект стимуляции. Настраивайте стимуляции в обычном порядке (например, слева направо, сверху вниз) или в случайном порядке, в зависимости от конкретного эксперимента.
  19. Загрузите последовательность в систему и настройте количество циклов (прогонов) последовательности, которые будет выполнять система.
  20. Разместите области интереса (ROI) в программном обеспечении для обработки изображений в нужных местах.
  21. Начните получение флуоресцентных изображений с помощью микроскопа и нажмите в окне UGA-42.

3. Анализ данных

  1. Несмотря на то, что программное обеспечение, предоставляемое системой стимуляции, позволяет сохранять последовательности для дальнейшего использования, оно не записывает фактическую информацию об эксперименте. Поэтому тщательно задокументируйте все детали, связанные с точками стимуляции и последовательностями, используемыми во время эксперимента, включая такие параметры, как положение, интенсивность, продолжительность, количество запусков и т. д. Задокументируйте любые другие соответствующие экспериментальные условия, такие как фармакологические препараты или конкретные растворы.
  2. Во время эксперимента расположите назначенные ROI в программном обеспечении для визуализации, чтобы зафиксировать изменения интенсивности флуоресценции всей клетки или определенных мест внутри клеток.
  3. Обратите особое внимание на расположение ROI относительно точек стимуляции. Измерьте изменения интенсивности флуоресценции в пределах или далеко от стимулируемых областей. Отрегулируйте положение ROI после эксперимента, предоставив программное обеспечение для обработки изображений, позволяющее сохранять изображения, полученные во время эксперимента, а не только значения интенсивности ROI.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты, представленные в Рисунок 1, показывают, что только стимуляция, направленная на ядро клетки, могла вызвать измеримые повышения цАМФ. Это подтверждает, что NLS-bPAC-nLuc экспрессируется исключительно в ядерном компартменте клеток HC-1. С помощью этой сетки/матрицы можно точно стимулировать оптогенетический белок, чтобы отобразить его внутриклеточное распределение. Кроме того, более высокие высоты цАМФ по направлению к ядерному центру отражают более высокую массу bPAC-nLuc, моделируемую центральными пятнами, по сравнению с теми, которые расположены на ядерной периферии (Рисунок 1).

figure-results-1
Рисунок 1: Протокол стимуляции сетки и карта ответов cAMP. Последовательная стимуляция синим светом (445 нм; интервал между импульсами 30 с; последовательность импульсов: 50 мс, общая продолжительность 500 мс, 10 Гц, 7% мощности лазера) на клетках HC-1, трансфицированных с помощью NLS-H208 (датчик cAMP) и NLS-bPAC-nLuc. На левой панели отображается флуоресценция желтого флуоресцентного белка (YFP) из H208, которая была наложена на реальные световые импульсы, захваченные камерой sCMOS, представленные в одном изображении. На трассах справа показано увеличение переходного цАМФ, вызванное стимуляцией NLS-bPAC-nLuc в каждой точке стимуляции. Флуоресценцию NLS-H208 с вычитанием фона измеряли с использованием одного ROI, охватывающего все ядро, и рассчитывали нормализованные отношения (R/R0). Ответы во внешних областях (строки 1 и 7, столбцы A и G) были отрицательными и не отображались. Bar = 3 μm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого исследования состояла в том, чтобы точно контролировать внутриклеточное распределение оптогенетического белка и оценить его эффективность в пределах определенного цитоплазматического компартмента. Мы также показали точные возможности стимуляции системы точечного сканирования клеток, экспрессирующих оптогенетический белок. Для достижения этой цели мы использовали нацеленный на ядро bPAC-nLuc с высоким уровнем экспрессии, но очень ограниченным распределением, ограниченным ядром. Результаты показали, что точки стимуляции, разделенные всего ~1 мкм, могут либо запускать продукцию цАМФ, либо нет, в зависимости от клеточного распределения оптогенетического белка; только стимуляция, направленная на ядро, была способна повысить уровень цАМФ. В этом протоколе цель состояла не в том, чтобы создать локализованное повышение цАМФ, а скорее в том, чтобы показать, что кратковременные световые стимуляции могут быть достаточно точными для активации оптогенетических белков в очень ограниченных областях клетки без стимуляции окружающих белков. Тем не менее, этот подход представляет собой необходимый контроль для изучения других оптогенетических белков с диффузным распределением и/или генерацией локализованных подъемов цАМФ. Это может быть достигнуто путем варьирования уровней экспрессии оптогенетического белка, интенсивности и частоты стимуляции и т.д. Для точного измерения этих локализованных сигналов решающее значение имеет тщательный учет параметров сбора данных и характеристик датчиков. Это включает в себя выбор подходящих положений и размеров ROI, определение частоты сбора данных, а также выбор FRET/интенсиометрических датчиков с оптимальным сродством, интенсивностью, динамическим диапазоном и константой диссоциации.

В недавно опубликованной статье мы использовали аналогичную стратегию, чтобы функционально продемонстрировать распределение нацеленного на ядро bPAC-nLuc и способность модифицированной фосфодиэстеразы (ФДЭ; ΔRI-ФДЭ8) устранять повышение цАМФ в клеточной линии, полученной из щитовидной железы9. В этой статье мы проводили стимуляцию клеток по прямой линии, а не по сетке, а пятна освещения располагались относительно клеточных ориентиров (например, ядерного центра, ядерного края и т. д.), а не в виде систематической схемы. Примечательно, что даже стимуляции, направленные на ядерный край, были недостаточны для запуска обнаруживаемого ответа цАМФ. Мы предположили, что это, вероятно, связано со стимуляцией недостаточной массы NLS-bPAC-nLuc9. Тем не менее, в настоящем протоколе некоторые стимуляции, направленные в окрестности ядерного края, вызывали обнаруживаемое увеличение цАМФ. Это расхождение может быть связано с различными факторами, включая уровни экспрессии bPAC-nLuc, характеристики стимуляции, морфологию ядра, наличие эндогенных ФДЭ, буферных белков и т. д.

В то время как другие целевые или нецелевые оптогенетические белки могут демонстрировать более диффузное распределение, этот систематический подход позволяет делать значимые выводы путем тщательной постановки экспериментов и анализа данных. Кроме того, этот подход позволяет нацеливаться на специализированные клеточные структуры (например, ламеллиподии, дендриты, первичные реснички и т.д.), облегчая сравнение реакций в дистальной и проксимальной областях этих структур и/или клеточного тела.

Эта стратегия также может быть использована для оценки активации нижележащих элементов в пути цАМФ, таких как протеинкиназа А (PKA) или обменный белок, непосредственно активируемый цАМФ (EPAC1). Кроме того, поскольку bPAC-nLuc не подвержен влиянию тех же модуляторов, что и эндогенные АС, на которые могут влиять локальные взаимодействия с белками или другие факторы, можно предположить, что он последовательно генерирует одно и то же количество цАМФ при том же уровне экспрессии. Исследуя снижение повышения цАМФ или снижение уровня цАМФ после временного повышения, этот подход позволяет оценить деградацию цАМФ, диффузию или функциональность и распределение эндогенных или трансфицированных ФДЭ. Эта стратегия оказывается особенно полезной для оценки поведения любого оптогенетического белка в различных клеточных местоположениях, помогая избежать смещения произвольного размещения стимулирующих точек в цитоплазме.

Важно учитывать, что размер пятна стимуляции и его энергия в конечном итоге будут зависеть от конкретных характеристик используемой установки (световых путей, объективов, системы сканирования и т. д.). Для обеспечения точных результатов при проведении каждого эксперимента в каждой конкретной системе следует учитывать относительную экспрессию оптогенетического белка, чувствительность клеток к используемой длине волны и любые другие параметры. Также важно отметить, что мы не изучили в полной мере, в какой степени система может быть задействована в реализации меньших точек стимуляции и/или более плотных сеток (т.е. менее разнесенных точек стимуляции) для систематической оценки более мелких клеточных структур с повышенной точностью. Кроме того, мы протестировали эту стратегию, используя только систему сканирования точек UGA-42 Geo. Такой подход может быть возможен при использовании различных систем, при условии, что они могут воспроизводимо генерировать равномерно расположенные локализованные пятна. Каждая система должна быть оптимизирована для получения одинаковых результатов.

Наконец, следует тщательно оценить потенциальную стимуляцию датчиков FRET системой стимуляции. Например, голубой флуоресцентный белок (CFP) обязательно будет стимулироваться или даже отбеливаться лазером с длиной волны 445 нм, используемым в этом протоколе. Использование лазерных фильтров с более высокой интенсивностью лазера (или фильтров с более высоким коэффициентом пропускания нейтральной плотности (ND)) увеличит вероятность стимуляции флуоресцентных сенсоров и внесения ложной информации в эксперимент и/или создания проблем с анализом данных. Также следует тщательно оценить нормальное фотообесцвечивание FRET/интенсиометрических датчиков. Наконец, поскольку bPAC может быть чувствителен к окружающему свету и генерировать цАМФ даже в темных условиях (темновая активность bPAC была измерена как 33 ± 5 пмоль/мин/мг белка3), после трансфекции bPAC-nLUC следует осторожно манипулировать клетками, чтобы избежать светового загрязнения (например, в инкубаторе, до и/или во время экспериментов и т. д.). Необязательно, клетки можно инкубировать с ингибитором ФДЭ (например, 3-изобутил-1-метилксантином; IBMX10) для определения исходной активности bPAC-nLuc и подтверждения того, что используемые условия освещения являются достаточно темными.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 GM099775 и GM130612 D.L.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Янтарная компактная люминесцентная лампа мощностью 13 Вт - фотонные разработки с низким уровнем синего света 
3-изобутил-1-метилксантин (IBMX)SigmaI7018
6-линейный мультисветодиодный люменкор спектры xлюменкор 6-строчный мультисветодиодный световой модуль 
Corning - DMEM Thermo FischerMT10013CMEA
Corning - Обычная фетальная бычья сывороткаThermo FischerMT35011CV
Чехол для очков: кругиThermo Fischer12545102P
GBX-2 темно-красный фильтр safelight 5.5" Kodak1416827Красная лампа безопасного света   
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) 10xThermo Fischer14185052разбавлен до 1x, скорректированный pH
LDI-789 North
L-глутаминThermo FischerBW17605E
липофектамин 3000 Thermo FischerL3000001 
Olympus IX83 моторизованный  двухпалубный  Микроскоп OlympusМоторизованный двухдековый микроскоп 
Opti-MEM, без фенола красногоThermo Fischer11058021
цифровой CMOS камерой ORCA-fusion HamamatsuC14440-20UP
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Thermo Fischer15140122
фосфатный буферный раствор (1x)Lonza17516F
Prior emission emission wheel и фильтрующие комплектыPrior Scientific, Inc.Колесо фильтра выбросов 
Приор  Proscan XY stagePrior Scientific, Inc.XY сцена 
Slidebook 6Инновации в области интеллектуальной визуализации Программноеобеспечение для цифровой микроскопии
Программное обеспечение SysConПрограммноеПрограммное обеспечение, предоставляемое системой стимуляции 
УГА-42  Гео Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100xOlympus100x/1.4 NA масляный объектив (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroic Chroma Technology CorpBS, длина волны (CWL):  498 нм
Набор для трансфекции обеспечение SysCon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
  2. Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
  3. Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
  4. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  5. Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
  6. Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
  7. Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
  8. Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
  9. Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
  10. Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Protein MappingLight Stimulation GridCyclic AMP SignalingbPAC nanoluciferaseNuclear Targeted ProteinFRET MeasurementsFluorescence ImagingSubcellular ActivationMotorized MicroscopeCellular Distribution

Related Articles