Методическая статья

Двойная иммунофлуоресценция γH2AX и 53BP1 в периферических лимфоцитах человека

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65472

⸱

14 июля 2023 г.

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод оценки образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем одновременного обнаружения очагов γH2AX и 53BP1 в интерфазных ядрах периферических лимфоцитов человека, обработанных блеомицином.

Аннотация

Двухцепочечные разрывы (DSB) являются одним из самых тяжелых поражений, которые могут возникнуть в ядрах клеток, и, если их не восстановить, они могут привести к тяжелым последствиям, включая рак. Таким образом, клетка снабжена сложными механизмами для восстановления DSB, и эти пути включают гистон H2AX в его фосфорилированной форме в Ser-139 (а именно γH2AX) и p53-связывающий белок 1 (53BP1). Поскольку оба белка могут образовывать очаги на участках DSB, идентификация этих маркеров считается подходящим методом для изучения как DSB, так и их кинетики репарации. В соответствии с молекулярными процессами, которые приводят к образованию очагов γH2AX и 53BP1, было бы более полезно исследовать их совместную локализацию вблизи DSB, чтобы создать альтернативный подход, позволяющий количественно оценивать DSB путем одновременного обнаружения двух маркеров повреждения ДНК. Таким образом, этот протокол направлен на оценку геномного повреждения, индуцированного в лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином из-за присутствия очагов γH2AX и 53BP1 в двойной иммунофлуоресценции. Используя эту методологию, мы также очертили изменение количества очагов γH2AX и 53BP1 с течением времени в качестве предварительной попытки изучить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB.

Введение

Повреждение ДНК постоянно индуцируется агентами, которые могут быть эндогенными, такими как АФК, образующиеся в результате клеточного окислительного метаболизма, или экзогенными, как химическими, так и физическими1. Среди наиболее вредных поражений двухцепочечные разрывы (DSB) играют фундаментальную роль, способствуя геномной нестабильности, поскольку они вызывают хромосомные аберрации, которые, в свою очередь, могут инициировать процесс канцерогенеза. Таким образом, клетки обеспечены сложными и эффективными механизмами репарацииDSB 2.

Когда возникает DSB, клетка запускает реакцию повреждения ДНК (DDR), где вместе с комплексом MRE11 / RAD50 / NBS1 рекрутируются киназы ATM или ATR для активации других белков, которые замедляют или останавливают клеточный цикл3. Важной мишенью этих киназ является гистон H2AX, который фосфорилируется на Ser-139 в пределах нескольких мегабаз от DSB (а именно γH2AX), тем самым позволяя рекрутировать несколько факторов репарации, таких как, среди прочего, BRCA1 и p53-связывающий белок 1 (53BP1)3. Позже запускается один путь между гомологичной рекомбинацией (HR), негомологичным соединением концов (NHEJ) или одноцепочечным отжигом (SSA) для восстановления DSB 4,5. Таким образом, 53BP1 участвует в диктовке выбора между HR или NHEJ, в основном способствуя активации NHEJ, а не HR6. Более того, как фосфорилированная форма гистона H2AX, так и 53BP1 могут образовывать очаги на участках DSB. Поскольку эти очаги сохраняются до тех пор, пока целостность двойной цепи не будет восстановлена, оценка появления/исчезновения очагов γH2AX или 53BP1 в течение интервала времени считается полезным методом оценки возникновения и репарации DSB в клеточной системе 6,7. Однако, согласно описанным выше молекулярным процессам, поскольку ожидается, что очаги γH2AX и 53BP1 будут локализоваться вблизи DSB во время DDR8,9, может быть полезно одновременно обнаруживать присутствие этих маркеров в двойной иммунофлуоресценции.

Таким образом, цель данной рукописи состояла в том, чтобы оценить пригодность одновременного количественного определения очагов γH2AX и 53BP1 для оценки геномных повреждений, индуцированных в периферических лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином. Используя ту же методологию, мы также попытались очертить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB в соответствии с ранее установленной экспериментальной процедурой10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование было одобрено этическим комитетом Пизанского университета, и от каждого донора было получено информированное и подписанное согласие.

1. Образование очагов γH2AX и 53BP1

  1. Подготовка проб и мутагенная обработка
    1. Соберите образцы цельной крови путем венепункции у здоровых взрослых людей в пробирках для сбора крови (например, Vacutainer), содержащих гепарин лития в качестве антикоагулянта.
    2. Чтобы гарантировать надлежащую сохранность образца крови, начните процедуру в течение 24 часов после забора пробы.
    3. Добавьте 300 мкл образца в пробирку, содержащую 4,7 мл полной среды (0,5% пенициллина-стрептомицина, 0,75% фитогемагглютинина, 10% предварительно инактивированного FBS, 88,75% RPMI 1640).
    4. Затем добавьте блеомицина сульфат до конечной концентрации 5 мкг/мл.
      ВНИМАНИЕ: Блеомицин сульфат является мутагеном. Избегайте контакта с кожей и вдыхания. Приготовьте раствор и добавьте образец под колпак.
    5. Для каждого образца установите отрицательный контроль (отсутствие мутагена).
    6. Поместите трубку в термостат при температуре 37 °C на 2 часа.
  2. Фиксация
    1. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу с помощью вихря.
    3. Добавьте 5 мл гипотонического раствора (2,87 г KCl, растворенного в 500 мл деионизированной воды) и 400 мкл предварительно фиксирующего раствора (5: 3 уксусная кислота: метанол), чтобы вызвать гемолиз эритроцитов.
    4. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 5 мл метанола при комнатной температуре в течение не менее 30 мин, чтобы зафиксировать клетки.
    6. В качестве альтернативы храните ячейки при температуре -20 °C до использования.
  3. Подготовка слайдов
    1. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 5 мл раствора метанола: уксусной кислоты в соотношении 3:1. Повторите эти действия еще раз.
    3. В конце снова центрифугируют раствор при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Снова аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя достаточное количество раствора (0,5 мл) для ресуспендирования гранулы, энергично пипетку, капните ресуспендированную клеточную гранулу на предметные стекла и высушите на воздухе. Хранить предметные стекла при температуре 4 °C.
  4. Иммунофлюоресценция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресценция представляет собой иммунологический метод идентификации специфических клеточных мишеней с использованием первичного антитела, связывающего саму мишень, и флуоресцентного вторичного антитела, связывающего первичную мишень, что позволяет локализовать мишень11. В этом случае в качестве первичных антител используются мышиный моноклональный анти-53BP1 (1:50) и поликлональный анти-γH2AX кролика (1:50), в то время как AlexaFluor568 анти-мышь (1:400) и DyLight488 анти-кролик (1:200) используются в качестве вторичных антител соответственно.
    1. Промойте предметные стекла два раза в 50 мл 1x PBS в течение 5 минут в банке для муфты (16 слайдов подряд).
    2. Затем держите их в течение 30 мин в блокирующем растворе (10 мл FBS, 10 мл 10x PBS, 80 мл деионизированной воды, 300 мкл Triton-X).
    3. Добавляют к каждому предметному стеклу по 10 мкл каждого из двух растворов, содержащих первичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накройте предметные стекла парафиновой лентой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение ночи.
    4. После инкубации проведите три промывки в 1x PBS в течение 5 мин.
    5. Добавляют к каждому предметному стеклу по 10 мкл каждого из двух растворов, содержащих вторичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накрывают предметные стекла парафином и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч.
    6. Выполните три стирки в 1x PBS в течение 5 минут.
    7. Перед сборкой добавьте 2,5 мкл противозатухающего раствора с DAPI на покровных стеклах, чтобы скрыть ядра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки кинетики очагов процедура аналогична описанной с 1,1 по 1,4, отмечая, что сбор клеток и двойная иммунофлюоресценция выполняются через 0 часов после лечения блеомицином, а затем, после удаления мутагена, через 4 часа, 6 часов и 24 часа после обработки.

2. Анализ с помощью флуоресцентного микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения. Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами, заставляя их излучать свет с более длинными волнами12. AlexaFluor568 и DyLight 488 поглощают свет примерно 568 и 488 нм и излучают свет 603 и 520 нм соответственно. Таким образом, они видны как красная или зеленая флуоресценция с использованием фильтра TRITC или FITC соответственно.

  1. Оцените наличие фокусов на каждом слайде под объективом 100-кратного погружения (рис. 1).
  2. Оцените 200 ядер на предметное стекло и подсчитайте количество очагов γH2AX/53BP1 в каждом ядре.
  3. Экспресс-результаты в пересчете на среднее количество очагов на общее количество набранных ядер. К ним относятся как положительные (показывающие, по крайней мере, один сигнал флуоресценции), так и отрицательные (не показывающие сигнал флуоресценции) ядра γH2AX/53BP1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данные, полученные с помощью флуоресцентного микроскопического анализа периферических лимфоцитов, позволяют оценить три основных аспекта: эффективность лечения блеомицином в увеличении количества очагов γH2AX и 53BP1 (и, следовательно, DSB) за счет его мутагенного эффекта, степень локализации обоих очагов в месте DSB, а также временной ход очагов γH2AX и 53BP1 для определения кинетики репарации блеомицин-индуцированных DSB. Как и ожидалось, очень высокая частота очагов γH2AX и 53BP1 наблюдалась между необработанными и об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Иммунофлуоресцентный анализ очагов γH2AX и 53BP1 является подходящим методом оценки геномных повреждений в интерфазных ядрах клеточной системы. Эта процедура имеет несколько критических моментов, которые могут повлиять на исход экспериментов, в основном, на агенты, используемые при фиксации и пермеабилизации, тип антител и факторы их разбавления, а также на концентрацию мутагена.

Поддержание целостности белка имеет основополагающее значение, поскольку метод иммунофлуоресценции предполагает иде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы благодарны донорам цельной крови и всему медицинскому персоналу, который взял образцы крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AlexaFluor 568 козий антимышиный IgG (γ 1)InvitrogenA2112453BP1 вторичное антитело
BleoprimSanofiблеомицина сульфат (мутаген)
Пенициллин-стрептомицин раствор 100XEurocloneECB3001Dантибиотики для культуральных сред
PBS 10XTermofisher14200075фосфатно-солевой буфер
FBSEurocloneEC20180Lфетальная сыворотка крупного рогатого скота для иммунофлюоресценции
козий антикроличьи IgG (H+L) DyLight 488 ConiugatedTermofisher#35552γ H2AX вторичное антитело
мышь анти-53BP1 моноклональное антителоMerckMAB 380253BP1 первичное антитело
Labophot 2Nikonфлуоресцентный микроскоп
P-гистон H2AX (Ser139) антитело кроликаCell Signaling#2577γ H2AX первичное антитело
ФитогемоагглютининTermofisherR30852801компонент питательной среды
Prolong gold antifade reagent with DAPICell Signaling#8961Antifade solution with DAPI для противоокрашивания
RPMI 1640EurocloneECB9006LCulture medium
Triton-X100SigmaT9284Nonionic Моющее средство для Пермеабилизация

Ссылки

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853(2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

gamma H2AX 53BP1

Похожие статьи