Method Article

Генерация центромер-ассоциированных белков-E CENP-E-/- нокаутных клеточных линий с использованием системы CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье сообщается о построении центромер-ассоциированных протеин-Е (CENP-E) нокаутных клеток с использованием системы CRISPR/Cas9 и трех стратегий скрининга на основе фенотипа. Мы использовали линию нокаутных клеток CENP-E для разработки нового подхода к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E, что полезно для разработки лекарств и биологических исследований.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 стала мощным инструментом для точного и эффективного редактирования генов у различных организмов. Центромер-ассоциированный белок-Е (CENP-E) представляет собой положительно-концевой кинезин, необходимый для захвата кинетохорных микротрубочек, выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена. Несмотря на то, что клеточные функции белков CENP-E были хорошо изучены, было трудно изучить прямые функции белков CENP-E с использованием традиционных протоколов, поскольку абляция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке клеточного цикла и гибели клеток. В этом исследовании мы полностью нокаутировали ген CENP-E в клетках HeLa человека и успешно сгенерировали клетки CENP-E-/- HeLa с помощью системы CRISPR/Cas9.

Были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга на основе фенотипа, включая скрининг клеточных колоний, фенотипы выравнивания хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP-E, которые эффективно повышают эффективность скрининга и успешность экспериментов нокаутных клеток CENP-E . Важно отметить, что делеция CENP-E приводит к рассогласованию хромосом, аномальному расположению белков серин/треонинкиназы B (BubR1) митотической контрольной точки BUB1 и митотическим дефектам. Кроме того, мы использовали модель нокаута клеток HeLa CENP-E для разработки метода идентификации специфических ингибиторов CENP-E.

В этом исследовании был разработан полезный подход к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E. Кроме того, в данной работе представлены протоколы редактирования генов CENP-E с использованием системы CRISPR/Cas9, которые могут стать мощным инструментом для исследования механизмов деления клеток CENP-E. Кроме того, линия нокаутных клеток CENP-E будет способствовать открытию и валидации ингибиторов CENP-E, которые имеют важное значение для разработки противоопухолевых препаратов, изучения механизмов клеточного деления в клеточной биологии и клинического применения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерное редактирование генома опосредует целенаправленные модификации генов в различных клетках и организмах. У эукариот сайт-специфический мутагенез может быть введен путем применения последовательно-специфических нуклеаз, которые стимулируют гомологичную рекомбинациюДНК-мишени 1. В последние годы было разработано несколько технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs)2,3, эффекторные нуклеазы активатора транскрипции (TALENs)4,5 и самонаводящиеся мегануклеазы 6,7, но эти подходы требуют сложной белковой инженерии и избыточных экспериментальных процедур. Исследования показали, что кластеризованная прокариотическая система с регулярными интервальными короткими палиндромными повторами (CRISPR)/Cas II типа является эффективной технологией редактирования генов, которая специфически опосредует РНК-управляемое, сайт-специфическое расщепление ДНК в широком спектре клеток и видов 8,9,10,11. Технология нокаута генов CRISPR/Cas9 произвела революцию в области фундаментальной биологии, биотехнологиии медицины.

Бактерии и большинство архей развили адаптивную иммунную систему на основе РНК, которая использует белки CRISPR и Cas для идентификации и уничтожениявирусов и плазмид. Streptococcus pyogenes Эндонуклеаза Cas9 (SpCas9) содержит RuvC-подобную резольвазу перехода Холлидея (RuvC) и домен His-Asn-His (HNH), которые могут эффективно опосредуть последовательно-специфичные двухцепочечные разрывы (DSB), обеспечивая синтетическую однонаправляющую РНК (sgRNA), содержащую CRISPR-РНК (crRNA) и транс-активирующую crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB могут быть репарированы с помощью индел-образующего пути негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологии-направленной репарации (HDR), который приводит к множественным мутациям, включая вставки, делеции или однонуклеотидные замены без рубцов, в клетках млекопитающих 1,8. Как подверженный ошибкам NHEJ, так и высокоточный HDR-путь могут быть использованы для опосредования нокаута генов путем вставок или делеций, которые могут вызвать мутации со сдвигом фрейма и преждевременные стоп-кодоны10.

Кинезин-7 CENP-E необходим для прикрепления кинетохорных микротрубочек и выравнивания хромосом во время деления клеток 17,18,19. Микроинъекция антител 20,21, истощение миРНК22,23, химическое ингибирование 24,25,26 и генетическая делеция 27,28,29 CENP-E приводит к рассогласованию хромосом, активации контрольной точки сборки веретена и митотическим дефектам, что приводит к анеуплоидии и хромосомной нестабильности 19,30. У мышей делеция CENP-E приводит к аномальному развитию и эмбриональной летальности на самых ранних стадиях развития 27,29,31. Генетическая делеция CENP-E обычно приводит к рассогласованию хромосом и гибели клеток 26,27,29, что является препятствием в изучении функций и механизмов белков CENP-E.

В недавнем исследовании была создана условная клеточная линия с нокаутом CENP-E с использованием ауксин-индуцируемого метода редактирования генов CRISPR/Cas932, который обеспечивает быструю деградацию белков CENP-E за относительно короткое время33. Однако на сегодняшний день стабильные клеточные линии с нокаутом CENP-E не установлены, что является нерешенной технической проблемой в биологии CENP-E. Принимая во внимание генетическую устойчивость34, генетические компенсационные реакции 35,36,37 и сложную внутриклеточную среду, поскольку прямые последствия полной делеции CENP-E могут быть сложными и непредсказуемыми, важно установить нокаутные клеточные линии CENP-E для исследования механизмов выравнивания хромосом, контрольной точки сборки веретена и нисходящих сигнальных путей.

Открытие и применение ингибиторов CENP-E имеет важное значение для лечения рака. К настоящему времени обнаружено и синтезировано семь типов ингибиторов CENP-E, в том числе GSK923295 и его производные24,25, PF-277138,39, производные имидазо[1,2-a]пиридинового каркаса40,41, соединение-А42,43, синтелин44,45, UA6278446 и производные бензо[d]пирроло[2,1-b]тиазола47. Среди этих ингибиторов GSK923295 аллостерический и эффективный ингибитор CENP-E, который связывается с моторным доменом CENP-E и ингибирует активность АТФазы, стимулированной микротрубочками CENP-E, сKi 3,2 ± 0,2 нМ 24,25. Однако, по сравнению с ингибирующим действием GSK923295 на культивируемые раковые клетки, терапевтические эффекты GSK923295 у пациентов с клиническим раком не идеальны48,49, что также вызвало опасения по поводу специфичности GSK923295 для CENP-E. Кроме того, специфичность и побочные эффекты других ингибиторов CENP-E на белки CENP-E являются ключевыми вопросами в исследованиях рака.

В этом исследовании мы полностью нокаутировали ген CENP-E в клетках HeLa с помощью системы CRISPR/Cas9. Для повышения эффективности скрининга и успешности редактирования гена CENP-E были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга, основанные на фенотипах, включая скрининг клеточных колоний, фенотипы выравнивания хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP-E. Кроме того, нокаутные клеточные линии CENP-E могут быть использованы для тестирования специфичности соединений-кандидатов на CENP-E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Построение векторов нокаута гена CRISPR/Cas9

  1. Выберите целевую последовательность геномной ДНК на гене CENP-E человека (GenBank Accession No. NM_001286734.2) и спроектировать sgRNA с помощью онлайн-инструмента проектирования CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
  2. Введите одну геномную последовательность, выберите геном "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" и выберите протоспейсер рядом с мотивом "20 bp-NGG-spCas9". Выберите две направляющие последовательности, включая sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' и sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', в соответствии с показателями специфичности50, прогнозируемой эффективности10 и минимальными отклонениями от целевых показателей.
  3. Упорядочивание и синтез одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов (ssODNs). Разбавьте ssODNs в ddH2O до конечной концентрации 100 мкМ. Для фосфорилирования и отжига олигов sgRNA добавляют 1 мкл прямого олиго, 1 мкл обратного олиго, 0,5 мкл полинуклеотидкиназы Т4, 1 мкл полинуклеотидкиназного буфера Т4 и 6,5 мкл воды, не содержащей РНКазы, в пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и инкубируют пробирку при 37 °C в течение 30 мин, 95 °C в течение 5 мин; затем уменьшите температуру до 25 °C при 5 °C мин-1.
  4. Расщепляют плазмиду pX458 с помощью фермента рестрикции Bbsfigure-protocol-1 . Добавьте 1 мкг плазмиды pX458, 2 мкл 10-кратного буфера G, 1 мкл Bbsfigure-protocol-2 и добавьте свободный от РНКазы ddH2Oдо 20 мкл в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C в течение 2 ч. Затем очистите линейную плазмиду с помощью набора для экстракции геля ДНК в соответствии с протоколами производителя.
  5. Лигируют олигосодержащие sgRNA в плазмиду pX458 (плазмида pSpCas9(BB)-2A-зеленого флуоресцентного белка (GFP), Addgene ID. 48138). Добавьте 1 мкл отожженных олигонуклеотидов, 25 нг линейной плазмиды, 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования ДНК Т4, 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4 (350 ед/мкл) и получите до 10 мкл с ddH2O в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Инкубируют лигирующий раствор при 16 °С в течение 2 ч.
  6. Инкубируют 10 мкл сконструированной плазмиды с соответствующими клетками DH5α на льду в течение 30 мин, подвергают тепловому шоку при 42 °C в течение 45 с и сразу же помещают на лед на 5 мин. Добавьте 500 мкл среды Лурии-Бертани (LB) и засейте клетки на планшет LB, содержащий ампициллин (100 мкг/мл). Инкубируют при температуре 37 °C в течение 16 ч и просеивают устойчивые клоны.
  7. Отобрать 5-10 единичных колоний стерилизованным наконечником пипетки и перенести их в культуру 1 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл). Инкубируют культуру при 37 °С и встряхивают при 180 об/мин в течение 12-16 ч.
  8. Выделите плазмидную ДНК с помощью набора для экстракции плазмид в соответствии с протоколами производителя. Валидация плазмидной ДНК каждой колонии методом секвенирования по Сэнгеру из промоторного сайта U6 с использованием праймера U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Экстрагируйте и очищайте плазмиды с помощью набора ДНК без эндо-свободных плазмид в соответствии с протоколами производителя.

2. Трансфекция, выделение и скрининг нокаутных клеток HeLa CENP-E

  1. Культивирование клеток HeLa в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
  2. Инкубируют клетки HeLa с использованием 0,25% трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 °C в течение 2-3 мин, диссоциируют клетки путем осторожного пипетирования, а затем засеивают клетки в новые планшеты в соотношении разбавления 1:4 для прохождения клеток.
  3. Высейте клетки в 12-луночный планшет и культивируйте до 60-70% слияния перед трансфекцией. Трансфицировать плазмиды pX458-sgRNA в клетки HeLa с помощью референтных реагентов в соответствии с протоколами производителя (см. таблицу материалов).
    1. Осторожно смешайте 1 мкг валидированной плазмиды pX458-sgRNA и 50 мкл восстановленной сывороточной среды в пробирке А. Затем осторожно смешайте 2 мкл реагента для трансфекции и 50 мкл восстановленной сывороточной среды в пробирке В. Инкубируйте пробирки А и В отдельно при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Осторожно смешайте пробирку А и пробирку В и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавьте смесь в 12-луночную тарелку, инкубируйте клетки в течение 6 ч и замените среду свежей средой DMEM.
  4. Исследуйте клетки HeLa через 24 ч или 48 ч с помощью флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности трансфекции. После трансфекции в течение 48 ч полностью диссоциируют трансфицированные клетки HeLa, используя 0,25% трипсин/ЭДТА при 37 °C в течение 3-5 мин, подсчитывают количество клеток с помощью камеры Нойбауэра или автоматизированного счетчика клеток и распределяют клетки по трем отдельным 96-луночным планшетам для каждой трансфицированной популяции в соответствии с методами серийного разведения10.
  5. Верните клетки в увлажненный инкубатор и затем культивируйте их еще 1-2 недели. Меняйте питательную среду один раз в 3 дня. Для скрининга на основе фенотипа и валидации нокаута CENP-E диссоциируют и расширяют клетки в 24-луночных или 12-луночных планшетах в течение 5-7 дней.
  6. Скрининг мутантных клеток с меньшим диаметром клеточных колоний с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного объективами 10x и 20x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мутации CENP-E обычно приводят к значительному увеличению количества делящихся клеток в клеточных колониях, что может быть одним из ключевых показателей для скрининга мутантных клеток CENP-E .
  7. Соберите клетки для экстракции ДНК с помощью набора для экстракции геномной ДНК животных в соответствии с протоколами производителя. Настройте ПЦР-реакции следующим образом: 0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл 10-кратного буфера (Mg2+ plus), 4 мкл смесей dNTP, 500 нг матрицы ДНК, 1 мкл прямого олиго, 1 мкл обратного олиго, и отрегулируйте ddH2O до 50 мкл. Используйте следующие настройки программы ПЦР для амплификации генов: 98 °С, 10 с; 98 °C, 10 с, 55 °C, 30 с, 72 °C, 60 с в течение 33 циклов; 72 °С, 10 мин, а затем выдержка при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные праймеры для клонирования целевого локуса перечислены следующим образом: CENP-E мишень F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E мишень R1, 5'-AGATCTCCCCGATCCCCCCCTGTC-3'; CENP-E мишень F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E мишень R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Лигировать ДНК-мишень в вектор pMD18-T в соответствии с протоколами производителя. Трансфицируют лигированную плазмиду в компетентные клетки DH5α и культивируют для отбора клонов.
  9. Выполните секвенирование по Сэнгеру для определения типов нокаута CENP-E . Выделите плазмидную ДНК с помощью набора для экстракции плазмид в соответствии с протоколами производителя. Проводят секвенирование плазмидной ДНК каждой колонии по Сэнгеру с использованием прямого и обратного праймеров М13. Капсюль M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; Грунтовка M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Высевают мутантные клетки HeLa дикого типа и CENP-E на 12-миллиметровые стеклянные покровные стекла в 24-луночном планшете соответственно. Удалите всю среду DMEM и зафиксируйте клетки в 4% растворе фиксатора параформальдегида/фосфатного буфера физиологического раствора (PBS) при комнатной температуре в течение 10 мин.
  11. Окрасьте ядра раствором 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) при комнатной температуре в течение 5 мин. Скрининг и валидация мутантных клеток CENP-E на основе фенотипа выравнивания хромосом с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0,75.
  12. Скрининг и валидация нокаутных клеток CENP-E с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа (см. раздел 3) белков CENP-E.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия высокого разрешения

  1. Зафиксируйте клетки 4% раствором параформальдегида/фиксатора PBS при комнатной температуре на 10 мин и погрузите на 2 x 5 мин в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки находятся в здоровом состоянии, а клетки аккуратно собраны и зафиксированы, чтобы избежать отслоения метафазных клеток.
  2. Пермеабилизируйте клетки 0,25% Triton X-100/PBS при комнатной температуре на 10 мин и погрузите их в 1x PBS на 2 x 5 мин.
  3. Блокируйте клетки 1% BSA/PBST (0,1% Tween 20 in PBS) при комнатной температуре в течение 1 ч. Первичные антитела разбавляют 1% BSA/PBST и инкубируют образцы при 4 °C в течение 12 ч.
  4. Растворы первичных антител выбросить, промыть клетки 3 x 5 мин 1x PBS и инкубировать клетки с разбавленными вторичными антителами при комнатной температуре в течение 2 ч.
  5. Отбросьте вторичные антитела и промойте клетки в 1x PBS в течение 3 x 5 мин.
  6. Окрасьте ядра DAPI при комнатной температуре в течение 5 мин. Установите направляющие с помощью монтажного носителя. Запечатайте предметные стекла лаком для ногтей.
  7. Наблюдайте и записывайте флуоресцентные изображения с помощью сканирующего конфокального микроскопа, оснащенного объективом 63x/NA 1.40.

4. Хромосомная подготовка и анализ кариотипа

  1. Культивирование клеток дикого типа и клеток CENP-E-/- HeLa в полной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в течение 24 ч, а затем инкубируют клетки дикого типа и CENP-E-/- HeLa с колхицином 300 нМ в течение 5 ч.
  2. Инкубируют клетки с 0,25% трипсином/ЭДТА при 37 °C в течение 3 мин и собирают клетки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
  3. Центрифугируют клетки при 1000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, выбрасывают надосадочную жидкость, добавляют 1,2 мл раствора KCl 0,075 моль/л и инкубируют при 37 °C в течение 20 мин.
  4. Центрифугируют клетки при 1000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, выбрасывают надосадочную жидкость, добавляют 0,2 мл фиксирующего раствора (метанол: ледяная уксусная кислота = 3:1) для префиксации и осторожно перемешивают в течение 1 мин.
  5. Центрифугируют клетки при 1000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, собирают гранулы, добавляют 1,5 мл фиксирующего раствора комнатной температуры в течение 10 мин, а затем центрифугируют при 1000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Надосадочную жидкость выбросить, добавить 0,6 мл фиксирующих растворов и приготовить клеточную суспензию. Добавьте 3-5 капель клеточной суспензии с высоты 35-40 см на ледяные горки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высота выпуска клеточных суспензий на предметные стекла должна составлять 35-40 см; В противном случае хромосомы могут быть слишком рассредоточены или не отделены друг от друга.
  7. Немедленно высушите предметные стекла спиртовой лампой, окрасьте образцы 10% раствором окрашивания Гимзы в течение 7 мин, промойте предметные стекла проточной водой в течение 2 мин и наблюдайте образцы с помощью светового микроскопа, оснащенного объективом Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Анализ образования клеточных колоний

  1. Готовят клеточные суспензии в 6-луночных планшетах при плотности клеток 1000-2000 клеток/лунку. Аккуратно встряхните пластины, чтобы равномерно распределить ячейки.
  2. Поместите 6-луночные планшеты в инкубатор сСО2 и инкубируйте в течение 2-3 недель при температуре 37 °C с 5%СО2. Меняйте питательную среду один раз в 5 дней. Записывайте изображения с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного объективами с 10-кратным и 20-кратным увеличением. Собирайте клетки, когда видны колонии (сотни клеток в клоне).
  3. Для изучения эффектов GSK923295 культивируют клетки в 6-луночных планшетах в течение 24 ч и добавляют 2 мл GSK923295 в конечных концентрациях 10, 25, 50, 100 и 200 нМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте чашку для культивирования на ранней стадии формирования клонов, чтобы избежать выпадения клеток, которое может привести к образованию новых клонов и повлиять на скрининг трансфицированных клеток.
  4. Выбросьте питательную среду и зафиксируйте клетки с 1% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин. Окрасьте колонии 0,1% раствором кристаллического фиолетового красителя при комнатной температуре в течение 15 мин. Промойте образцы 1x PBS три раза. Записывайте изображения клеточных колоний и количественно определяйте диаметры каждой колонии с помощью программного обеспечения ImageJ. Выберите инструмент Выделение по прямой линии , щелкните Анализ, выберите Измерить и запишите длину.
  5. Промыть колонии 1 мл 10% раствора уксусной кислоты в течение 5 мин. Перенесите 200 мкл надосадочных растворов в 96-луночный планшет и измерьте значения поглощения с помощью микропланшетного спектрофотометра придлине волны 600 нм.

6. Анализ жизнеспособности клеток

  1. Высевают клетки в 24-луночные планшеты и культивируют клетки в течение 48 ч до 80-90% плотности.
  2. Инкубируют клетки со 100 мкл 0,25% трипсина/ЭДТА при 37 °C в течение 3 мин.
  3. Смешайте 400 мкл PBS с ячейками с помощью пистолета-пипетки. Перенесите 100 мкл клеточных суспензий в 96-луночный планшет.
  4. Добавьте 20 мкл раствора МТС в каждую лунку с конечной концентрацией 317 мкг/мл и аккуратно перемешайте в соответствии с протоколами производителя. Образцы инкубируют при 37 °C в течение 1-3 ч в инкубаторе CO2 .
  5. Запишите значения поглощения каждой лунки на пике поглощения А490 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра. Используйте эталонную длину волны A630 нм для вычитания фона, вносимого клеточным мусором и неспецифической абсорбцией (жизнеспособность клетки = A490 нм -A 630 нм).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки CENP-E-/- HeLa были успешно получены с помощью системы CRISPR/Cas9 (рис. 1). Временная шкала и критические экспериментальные этапы этого метода показаны на рисунке 1. Сначала мы спроектировали и синтезировали CENP-E-специфичные sgRNA, отожгли и лигировали sgRNA в плазмиду pX458, трансфицировали плазмиду в клетки HeLa и культивировали их в течение 48 часов. Трансфицированные клетки диссоциировали и засевали в 96-луночный планше...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кинезин-7 CENP-E является ключевым регулятором выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена во время деления клеток 17,19,20. Генетическая делеция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке клеточного цикла и гибели клеток 27,29,51,52. Таким образом, по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех сотрудников Лаборатории цитоскелета Фуцзяньского медицинского университета за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линь, Чжи-Хун Хуана, Лин Линь, Ли-Ли Панга, Линь-Ин Чжоу, Си Линя и Мин-Ся Ву из Центра обслуживания государственных технологий Медицинского университета Фуцзянь за их техническую помощь. Мы благодарим Си-И Чжэна, Ин Линя и Ци Кэ из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Фуцзяньского медицинского университета за их поддержку. Данное исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (гранты No 82001608 и 82101678), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Объединенные фонды инноваций в области науки и технологий, провинция Фуцзянь, Китай (номер гранта 2021Y9160) и Фуцзяньский медицинский университет (грант No XRCZX2017025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% трипсин-ЭДТАGibco25200056
1,5 мл центрифужная пробиркаAxygenMCT-150-C
24-луночный планшетCorning3524
4S Gelred, 10 000x в водеSangon Biotech (Шанхай)A616697
50 мл центрифужная пробиркаCorning430828
6 см чашка ПетриCorning
95% этанолХимический реагент Sinopharm10009164
96-луночной пластинеCorning3599
Уксусная кислотаХимический реагент Sinopharm10000218растворите в H2O для приготовления 10% рабочего раствора.
AgaroseSangon Biotech (Шанхай)A620014
Alexa Fluor 488-меченый козий антимышиный IgG(H+L)BeyotimeA0428для иммунофлюоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:500.
Alexa Fluor 488-меченый козий антикролик IgG(H+L)BeyotimeA0423для иммунофлуоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:500.
Alexa Fluor 555-меченый Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0460Для иммунофлюоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:500.
Безводный этанолSinopharm Химический реагент100092690
Анти-BubR1 кроличье моноклональное антителоAbcamab254326Для иммунофлюоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:100 
Мышиное моноклональное антитело Anti-CENP-BSanta Cruz Biotechnologysc-376392Для иммунофлуоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. 1:50 разбавление.
Моноклональное антитело кролика Anti-CENP-EAbcamab133583Для иммунофлюоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:100.
Антивыцветающий монтажный носительBeyotimeP0131Замедление гашения флуоресцентных сигналов.
Анти-&альфа;-тубулин мышиное моноклональное антителоAbcamab7291Для иммунофлуоресценции. Растворить в 1% BSA/PBST. Разведение 1:100.
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerBiotek InstrumentsBiotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)Sinopharm Химический реагент69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 водный анализ пролиферации клеток с одним растворомPromegaG3580
CentrifugeEppendorf5424BK745380
КолхицинSinopharm Химический реактив61001563
конфокальный сканирующий микроскопLeicaLeica TCS SP8
CoverslipCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α компетентные клеткиSangon Biotech (Шанхай)B528413
DL2000 DNA markerTaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Мини-набор плазмид без эндо figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Column Набор для очистки геномной ДНК животныхSangon Biotech (Шанхай)B518251
Фетальная бычья сывороткаZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Горечавка фиолетовогоSinopharm Химический реактив71019944растворить в PBS для получения 0,1% горечавки фиолетовой/PBS.
Раствор для окрашивания ГимзыSinopharm Chemical Reagent71020260
GraphPad Prism версии 8.0 программное обеспечениеGraphPadwww.graphpad.comСтатистический анализ.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Клеточная линия HeLaATCCCCL-2
Увлажненный инкубаторHeal ForceHF90 / HF240
Image J программное обеспечениеНациональных институтов здравоохраненияhttps://imagej.nih.gov/ij/обработка и анализ изображений.
Инвертированный микроскопNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB порошок агараSangon Biotech (Шанхай)A507003
реактив для трансфекции Lipo6000BeyotimeC0526
Nikon Ti-S2 микроскопNikonTi-S2
Opti-MEM  Сокращено  Сыворотка  среднийGibco31985070
ПараформальдегидSinopharm Химический реагент80096618растворить в PBS для получения 4% параформальдегида/PBS.
Пенициллин-стрептомицин растворHyCloneSV30010
колонке SanPrep набор для экстракции ДНК-геляSangon Biotech (Шанхай)B518131
SanPrep  Рубрика  Плазмида  мини-препсы  наборSangon Biotech (Шанхай)B518191
T4 ДНК-лигазаTaKaRa2011A
T4 полинуклеотидкиназаTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm химический реагент30188928растворить в PBS для получения 0,25% Triton X-100/PBS.
Твин 20Химический реагент Sinopharm30189328растворить в PBS для получения 0,1% Tween 20/PBS.
430166

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764(2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056(2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358(2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675(2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010(2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381(2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CENP E KnockoutCRISPR Cas9HeLa CellsGene EditingChromosome AlignmentPhenotype ScreeningMitotic DefectsFluorescence MicroscopyKaryotype AnalysisCell Cycle Arrest

Related Articles