Method Article

Базовая трехмерная (3D) система моделей кишечника с иммунным компонентом

DOI:

10.3791/65484

⸱

September 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы опишем построение базовой трехмерной (3D) системы моделирования кишечной клеточной линии и протокола встраивания парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов. Окрашивание выбранных белков позволяет анализировать несколько визуальных параметров из одного эксперимента для потенциального использования в доклинических скрининговых исследованиях лекарственных средств.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отмечается рост использования моделей кишечника in vivo и in vitro для изучения патофизиологии воспалительных заболеваний кишечника, для фармакологического скрининга потенциально полезных веществ и для исследований токсичности потенциально вредных пищевых компонентов. Актуально то, что в настоящее время существует потребность в разработке клеточных моделей in vitro для замены моделей на животных. Здесь представлен протокол для базовой, «здоровой» трехмерной (3D) эквивалентной модели кишечника с использованием клеточных линий, обладающий двойным преимуществом, обеспечивающим как экспериментальную простоту (стандартизированная и легко воспроизводимая система), так и физиологическую сложность (энтероциты Caco-2 с поддерживающим иммунным компонентом моноцитов U937 и фибробластов L929). Протокол также включает в себя введение парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов, тем самым обеспечивая преимущество анализа нескольких визуальных параметров в одном эксперименте. Окрашенные гематоксилином и эозином (H&E) срезы, показывающие столбчатые клетки Caco-2, образующие плотный и регулярный монослой в контрольных процедурах, используются для проверки эффективности модели в качестве экспериментальной системы. Используя глютен в качестве провоспалительного компонента пищи, параметры, анализируемые из срезов, включают уменьшение толщины монослоя, а также разрушение и отслоение от нижележащего матрикса (H&E), снижение экспрессии белка плотного соединения, как показано при окклюдиновом окрашивании (количественно поддающееся статистической оценке), и иммунную активацию мигрирующих клеток U937, о чем свидетельствует окрашивание кластера дифференцировки 14 (CD14) и дифференцировка, связанная с CD11b, в макрофаги. Как показано при использовании липополисахарида для моделирования воспаления кишечника, дополнительными параметрами, которые могут быть измерены, являются повышенное окрашивание слизи и экспрессия цитокинов (таких как мидкин), которые могут быть извлечены из среды до фиксации. Базовая трехмерная (3D) модель слизистой оболочки кишечника и фиксированные срезы могут быть рекомендованы для исследований воспалительного статуса и целостности барьера с возможностью анализа нескольких визуальных количественных параметров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителиальный барьер кишечника, внутренняя оболочка толщиной в одну клетку, содержащая различные типы эпителиальных клеток, представляет собой первый физический защитный барьер или интерфейс между внешней и внутренней средой тела 1,2. Энтероциты столбчатого типа представляют собой наиболее распространенный тип эпителиальных клеток. Они отвечают за поддержание целостности эпителиального барьера за счет взаимодействия между несколькими компонентами барьера, включая плотные соединения (ТЖ), играя значительную роль в уплотнении барьера 1,3. Структура TJ состоит из внутриклеточных белков бляшек, таких как zonula occludens (ZO) и цингулин, взаимодействующих с трансмембранными белками, включая окклюдины, клаудины и молекулы соединительной адгезии (JAM), которые образуют структуру, подобную молнии, плотно связывающую соседние клетки 3,4. Трансмембранные белки регулируют пассивную параклеточную диффузию мелких соединений и исключают токсичные крупные молекулы.

Потенциально токсичные пищевые соединения и пищевые загрязнители стимулируют воспалительную продукцию цитокинов, которые нарушают проницаемость эпителия, активируя иммунные клетки и вызывая хроническое воспаление тканей кишечника 5,6,7. Напротив, сообщалось, что различные антиоксидантные и противовоспалительные фитохимические вещества снижают экспрессию воспалительных цитокинов и улучшают целостность кишечного барьера TJ за счет восстановления экспрессии и сборки белка TJ 4,6,8. Таким образом, регуляция целостности эпителиального барьера как полезными, так и вредными соединениями привела к увеличению использования моделей как in vivo, так и in vitro, направленных на имитацию кишечного барьера для фармацевтического скрининга и исследований токсичности. Это особенно актуально с учетом растущего интереса к пониманию патофизиологии кишечных заболеваний кишечника (ВЗК), некротизирующего энтероколита и рака, которые могут быть смоделированы на экспериментальных моделях 8,9,10.

Существует спрос на разработку клеточных моделей in vitro для достижения цели «3R» в испытаниях на животных. К ним относятся альтернативы использованию животных, сокращение числа используемых животных и совершенствование методов смягчения дистресса 11,12,13. Более того, молекулярные, клеточные и физиологические механизмы, лежащие в основе человеческих и мышиных моделей (грызуны являются наиболее широко используемыми видами), различны, что приводит к спорам относительно эффективности мышиных моделей в качестве предикторов в человеческих реакциях12,13. Многочисленные преимущества моделей человеческих клеточных линий in vitro включают эксперименты с ограничением мишеней, прямое наблюдение и непрерывный анализ13.

Монослои одноклеточного типа в двумерных (2D) культурах послужили мощными моделями. Однако они не могут точно воспроизвести физиологическую сложность человеческих тканей 8,13,14. В результате, системы 3D-культивирования разрабатываются с постоянно растущими улучшениями для повторения физиологической сложности как здоровых, так и больных тканей кишечника в качестве инструментария для оценки риска следующего поколения13,14. Эти модели включают в себя 3D-каркасы Transwell с различными клеточными линиями, органоидными культурами и микрофлюидными устройствами (кишечник на чипе), использующими как клеточные линии, так и органоиды (полученные как из здоровых, так и из больных тканей)8,13,14.

Трехмерный протокол «здоровой ткани» кишечного эквивалента, представленный в настоящем исследовании, был основан на нахождении баланса между физиологической сложностью и экспериментальной простотой13. Модель представляет собой 3D-каркас Transwell, состоящий из трех клеточных линий (энтероциты [линия Caco-2 золотого стандарта аденокарциномы толстой кишки] с поддерживающим иммунным компонентом [моноциты U937 и фибробласты L929]), представляющие собой стандартизированную и легко воспроизводимую систему, применимую для предварительного скрининга интересующих пищевых молекул на целостность эпителиального барьера кишечника и иммунный ответ. Протокол включает введение парафина для световой микроскопической оценки целостности эпителиального барьера с использованием фиксированных кишечных эквивалентов. Преимущество данного подхода заключается в том, что в рамках одного эксперимента можно окрасить множество участков внедренных тканей по нескольким параметрам.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка базовой 3D реконструированной модели слизистой оболочки кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в стерильном ламинарном колпаке. Все этапы процедуры, связанные с использованием клеточного инкубатора, означают, что культуры инкубируются при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%CO2 (если иное не указано в протоколе).

  1. Предварительная подготовка клеточных линий, используемых в кишечной модельной системе
    1. Высейте клетки фибробластов мыши L929 в концентрации 5 x 10,5 в 5 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, содержащей 2 мМ L-глютамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptomycin) в колбе F25 и культивируйте ее в инкубаторе за 4 дня до создания кишечных моделей. Через 48 ч удалите средство с помощью пипетки. Затем добавляют свежую среду (5 мл) и продолжают инкубировать клетки в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ячейки должны сливаться на 80%.
    2. Высевают клетки Caco-2 (концентрация 2 х10,6) в 10 мл среды DMEM (с 10% FBS и 1% Pen-Strep) в колбу с клетками F75 и культивируют в инкубаторе за 4 дня до построения модели слизистой оболочки кишечника. Через 48 ч сменить среду, как описано в шаге 1.1.1, и далее инкубировать в течение 48 ч до слияния 80%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны находиться в активной фазе пролиферации: не слишком разреженные и не слишком сливающиеся. Рекомендуется слияние 50-60%. Клетки не следует сеять за день до создания модели, потому что это может замедлить пролиферативную способность клеток, которые затем не приживутся идеально в реконструированной 3D-модели.
    3. Добавьте клетки U937, растущие в суспензии (концентрация 1 x 106), в 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (содержащей 2 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 10% FBS и 1% стрептококка Pen) в колбу с клетками F75 за 2 дня до установки модели и поместите в инкубатор на 48 ч.
  2. Подготовка вкладышей в планшеты для совместной культуры Transwell
    1. Выберите 24-луночный планшет со вставками с фильтрами 0,4 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр 0,4 мкм является стандартным выбором в исследованиях переноса лекарственных средств. Размеры фильтров 3 мкм и 8 мкм не рекомендуются для предотвращения возможных потерь клеток, встроенных в коллаген.
    2. С помощью пипетки увлажните фильтры Transwell (далее именуемые мембранными вставками) 500 мкл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) под и над фильтрующей вставкой.
    3. Закройте многолуночную тарелку и поместите ее в инкубатор минимум на 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембранные вставки могут оставаться в HBSS до 24 часов. Эту операцию можно выполнить за день до построения модели. Важно, чтобы мембранные вставки были полностью гидратированы, а фильтр не пересыхал, так как это может затруднить правильное прилипание образца.
    4. Выньте пластины из инкубатора через 2 ч (или 24 ч). Осторожно аспирируйте HBSS сверху и снизу мембранных вкладышей с помощью пипетки и дайте ему высохнуть в течение 10 минут.
  3. Подготовка собственной бесклеточной коллагеновой пластинки базовой системы 3D модели кишечника (ДЕНЬ 1)
    1. Приготовьте бесклеточный раствор коллагена в стерильной пробирке на льду объемом 50 мл, содержащий следующие компоненты в DMEM: 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 200 мМ L-глютамин, 1% бикарбонат натрия и 1,35 мг/мл коллаген из крысиного хвоста 1 типа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти компоненты необходимо держать на льду и добавлять в DMEM с охлажденными наконечниками для пипеток. Коллаген крысиного хвоста 1-го типа должен добавляться в последнюю очередь, так как он полимеризуется с повышением температуры и pH. Количество приготовленного бесклеточного коллагенового раствора будет зависеть от количества необходимых кишечных эквивалентов.
    2. Добавьте 250 мкл раствора в каждую пластину-вкладыш (над мембранным фильтром) для количества выбранных кишечных эквивалентов и накройте многолуночный планшет крышкой. Дайте раствору коллагена полимеризоваться при комнатной температуре (RT) под ламинарным колпаком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо перехода в более твердую фазу, полимеризация также проявляется в изменении цвета с желтого на розовый. Полимеризация обычно завершается в течение 10-15 минут.
  4. Подготовка, подсчет клеток и добавление клеток фибробластов (L929) и моноцитов (U937) в модельную систему (ДЕНЬ 1)
    1. Извлеките культуру клеток L929 (шаг 1.1.1) из инкубатора. С помощью вакуумного насоса аспирируйте среду, замените ее 5 мл стерильного фосфатного буферного раствора (PBS; без Ca и Mg) и промойте клетки.
    2. Аспирируйте PBS с помощью вакуумного насоса. Добавьте 2 мл предварительно приготовленного раствора трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА в ПБС) и поместите в инкубатор на 3-5 мин.
    3. Используйте инвертированный микроскоп (например, Eclipse Ts2, Nikon), чтобы установить, отделяются ли клетки от поверхности адгезии. Если это происходит, немедленно добавьте 2 мл DMEM (содержащего 10% FBS), чтобы заблокировать реакцию трипсина и промыть клетки.
    4. Перелейте клеточный раствор в стерильную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 645 x g в течение 5 мин. С помощью вакуумного насоса отсасывайте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не потревожить гранулу. Эффект DMEM был протестирован на клетках L929 и U937 и не оказал неблагоприятного влияния на рост.
    5. Добавьте 1 мл DMEM в гранулу и поднимите клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть однородно взвешены в растворе.
    6. Удалите 20 мкл клеток в DMEM и добавьте 20 мкл раствора трипанового синего. Удалите 20 мкл смеси и оцените плотность клеток под микроскопом с помощью камеры для подсчета клеток.
    7. Извлеките клеточную культуру U937 (шаг 1.1.3) из инкубатора. Центрифугируйте клеточный раствор при 645 x g в течение 5 мин. С помощью вакуумного насоса отсасывайте надосадочную жидкость, чтобы не повредить гранулу.
    8. Суспендировать клетки в 1 мл RPMI. Как и в случае с ячейками L929, убедитесь, что клетки однородно взвешены в растворе.
    9. Аналогичным образом установите плотность ячеек, как указано в шаге 1.4.6.
    10. Приготовьте раствор коллагена, как описано в шаге 1.3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раствора, которое должно быть приготовлено, должно учитывать 450 мкл для каждой пластины (или модели).
    11. Приготовьте раствор DMEM, содержащий 50 000 клеток L929 и 15 000 клеток U937 соответственно в объеме 50 мкл для каждой модели кишечного эквивалента, которую необходимо построить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек является критическим фактором. Слишком большое количество клеток обоих типов привело бы к тому, что собственная пластинка была бы чрезмерно заполнена клетками, которые не были бы должным образом организованы. Меньшее количество фибробластов (которые генерируют коллаген) приведет к менее компактной собственной пластинке, в то время как слишком малое количество моноцитов будет препятствовать иммунному ответу на стимулы. При условии правильного подсчета ячеек в каждой аликвоте объемом 50 мкл общий объем 600 мкл может быть приготовлен для 12 фильтрующих вставок, присутствующих в каждой 24-луночной пластине.
    12. Добавьте каждые 50 мкл аликвоты, содержащие клетки, к 450 мкл раствора коллагена на этапе 1.4.10. Тщательно перемешайте.
    13. Наложите на предварительно покрытую бесклеточную коллагеновую пластинку с 500 мкл коллагенсодержащего клеточного раствора для каждой модели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быстро добавлять объемы к каждой вставке, поэтому рекомендуется ограничить количество реконструированных моделей слизистой оболочки кишечника до 12 или менее за один раз.
    14. Закройте тарелку и поместите в инкубатор на 2 ч, чтобы раствор схватился.
  5. Подготовка, подсчет клеток и добавление эпителиальных клеток Caco-2 в модель кишечника (ДЕНЬ 1)
    1. Извлеките культуру клеток Caco-2 (шаг 1.1.2) из инкубатора. Повторите процедуры, описанные в шаге 1.4.1, используя 10 мл PBS для предварительного полоскания. Затем добавляют 5 мл заранее приготовленного раствора трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА в ПБС, не содержащих Ca- и Mg) и помещают в инкубатор на 5-8 мин.
    2. Повторите шаги 1.4.3 (но с использованием 5 мл DMEM для блокирования реакции трипсина) по 1.4.6 для подсчета клеток с помощью камеры подсчета клеток.
    3. Приготовьте раствор DMEM, содержащий 150 000 клеток Caco-2 в 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемых ячеек является критическим моментом. Превышение 150 000 клеток может привести к компактному дезорганизованному эпителиальному слою, в то время как при слишком малом количестве (менее 100 000) клетки борются за рост и не покрывают должным образом базальную мембрану, создавая прерывистый эпителиальный слой кишечника. Убедитесь, что клетки надежно подвешены. Наконечник пипетки объемом 200 мкл можно использовать для обеспечения однородного распределения. Учитывая, что в любой момент времени может быть построено 12 моделей, можно приготовить клеточный раствор на 600 мкл.
    4. По истечении 2 ч, требуемых на этапе 1.4.14, добавьте 50 мкл клеток Caco-2, взвешенных в DMEM, в середину каждой базальной мембраны. Закройте крышку многолуночной пластины.
    5. Инкубируют под стерильным ламинарным колпаком в течение 10 мин. Затем переложить в инкубатор на 30 мин.
    6. Приготовьте раствор DMEM, содержащий 10% FBS и 1% Pen/Strep.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы использовать объем 1 мл на модель.
    7. Добавьте 500 мкл среды над реконструированной моделью и 500 мкл под фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении среды над фильтром необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать отделения или напряжения ячеек.
    8. Закройте систему многолуночных планшетов и поместите ее в инкубатор.
  6. Подготовка/формирование и использование модели (ДЕНЬ 2 - ДЕНЬ 6)
    1. ДЕНЬ 2: Осторожно удалите раствор как над восстановленной моделью, так и под фильтром с помощью пипетки. Замените свежим 500 мкл свежего DMEM (10% FBS и 1% Pen/Strep) над и под фильтром соответственно.
    2. ДЕНЬ 3: Повторите, как описано выше, в шаге 1.6.1.
    3. ДЕНЬ 4: Повторите, как описано выше, в шаге 1.6.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель кишечника представляет собой статическую клеточную модель; Поэтому, чтобы способствовать высвобождению молекул, росту и стимуляции клеток, очень важно, чтобы среда менялась каждый день.
    4. ДЕНЬ 5: К этому моменту модель полностью сформирована/разработана. Используйте эти модели для дальнейших исследований.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшее время для использования модели - 5 дней. Хотя клетки могут храниться в инкубаторе в течение более длительных периодов времени, чем больше времени проходит, тем больше вероятность того, что эпителиальные клетки могут расти неконтролируемым образом, что приведет к неорганизованному и компактному слою, который трудно использовать.
    5. Через 5 дней инкубируйте модели либо с токсичными (глютен или липополисахарид [ЛПС]), либо с полезными компонентами (полифенолы), представляющими интерес. Добавьте их в верхнюю часть реконструированной модели, подвешенной в среде DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая концентрация каждого интересующего компонента должна быть рассчитана и взвешена в среде DMEM. Необработанные контрольные группы, содержащие только DMEM-среду, должны быть настроены для сравнения с экспериментальными моделями.
    6. Инкубируют контрольную и экспериментальную модели в течение 24 ч в инкубаторе.
    7. ДЕНЬ 6: Удалите средство над и под фильтром с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может быть сохранена для последующих иммуноферментных анализов (ИФА) для измерения высвобождения воспалительных цитокинов. Для этого среду необходимо добавлять в стерильные флаконы и хранить при температуре -20°С для дальнейшего анализа.

2. Парафиновое введение реконструированных моделей слизистой оболочки кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться под химическим вытяжным шкафом. Каждый шаг и соответствующее распределение времени должны строго соблюдаться. По этой причине важно, чтобы все реагенты были подготовлены заранее.

  1. Установите парафиновый аппарат на 58 °C, чтобы он был готов к использованию.
  2. Перенесите мембранные вкладыши в чистые лунки с помощью плоскогубцев в стерильную 24-луночную пластину.
  3. Добавьте 500 мкл 37% буферного формалина в PBS над фильтром и 1 мл под фильтром. Закройте крышку и оставьте под химическим вытяжным шкафом на 2 часа при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать 4% буферизованный формалин в течение 1 ч.
  4. Удалите формалин и добавьте раствор HBSS как выше, так и ниже фильтра. Затем снимите HBSS.
  5. Отделите собственную пластинку от мембранной вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки слизистой оболочки кишечника обычно очень легко отделяются от мембранной вставки, так как они не прикреплены к последней. Кроме того, два отсека образца (апикальный и базальный) остаются прикрепленными, сохраняя 3D-структуру. Если по какой-то причине они не легко отделяются, важно использовать стерильное одноразовое лезвие скальпеля для удаления слизистой оболочки кишечника из мембранной вставки. Мембранную вставку можно разрезать, тем самым отделив ее от пластика. Будьте осторожны и никогда не прикасайтесь к образцу скальпелем. Мотив для удаления мембранной вставки из клеток, внедренных в коллаген, заключается в том, что этот фильтр может отслоиться на последующих этапах фиксации или внедрения парафина, что делает сравнения между моделями слизистой оболочки кишечника непропорциональными. Кроме того, мембранные вставки внутри закладной секции имеют различную консистенцию, что может мешать секционированию.
  6. Поместите стаканы объемом 100 мл под химический вытяжной шкаф, каждый из которых правильно промаркирован, чтобы включить одну реконструированную модельную систему слизистой оболочки кишечника, которую исследуют. Добавьте 25 мл 35% ETOH в каждый стакан, а затем добавьте реконструированную слизистую оболочку кишечника. Выдерживать 10 мин.
  7. Замените 35% этанол 25 мл 50% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  8. Замените 50% этанол 25 мл 70% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  9. Замените 70% этанол 25 мл 80% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  10. Замените 80% этанол 25 мл 95% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  11. Замените 95% этанол 25 мл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  12. Замените 100% этанол другим 25 мл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
  13. Поместите стаканы объемом 100 мл под вытяжной шкаф, каждый из которых имеет правильную маркировку, чтобы включить одну исследуемую модель. Добавьте 50 мл ксилола или гистологического очистителя на 10-20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать Histo-Clear (гистологический очиститель), так как он повышает чистоту и яркость ацидофильных пятен. Время очищения может варьироваться от одного реконструированного образца слизистой оболочки кишечника к другому и должно проверяться на прозрачность внешнего вида каждые 2-3 минуты.
  14. Как только образцы станут прозрачными, поместите их в кассетный держатель из металлической ткани, который затем погружают в жидкий парафин внутри нагретой машины на 45 минут.
  15. Замените парафин и оставьте образцы внутри нагретой машины еще на 45 минут.
  16. Снимите держатель кассеты для салфеток и положите на лед, чтобы он остыл. Когда охлажденные блоки образцов отделяются от металлического держателя, их можно дополнительно охладить при комнатной температуре.
  17. Храните блоки в RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цель состоит в том, чтобы подготовить секции немедленно, то блоки можно поместить при температуре 4 ° C, чтобы они хорошо охладились при использовании.
  18. Отрежьте срезы размером 4 мкм с помощью микротома.
  19. Срезанные срезы поместите на горки и высушите их в духовке при температуре 37 ° C в течение 24 часов.
  20. Слайды готовы к использованию. Хранят их в РТ до тех пор, пока не будет выполнено либо гистологическое окрашивание H&E, либо окрашивание по иммунно-гистохимической реакции (тип антиген-антитело).
    1. Для иммуногистохимического окрашивания выберите интересующие антитела (либо для исследования белков TJ, таких как окклюдин, либо для активации, миграции и дифференцировки моноцитов) и определите экспрессию (с помощью окрашивания) с помощью коммерческих наборов.
    2. Точно так же измерьте слизь с помощью набора для окрашивания алкиановой синей и периодической кислоты-Шиффа (PAS).
    3. Количественно определите окрашенные белки TJ, такие как окклюдин, путем вычисления процента положительных пикселей на микрофотографиях, взятых с микроскопа.
    4. Проанализируйте изображения ячеек с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, программного обеспечения ImageJ2 [Wayne Rasband, версия 2.9.0/1.53t]).
      1. Чтобы выполнить анализ пикселей, обработайте цифровые изображения до 300 пикселей/дюйм и преобразуйте их в 8 бит. Затем обработайте бинарные изображения с помощью плагина Color Deconvolution , чтобы проанализировать окрашивание интересующего белка, в данном случае перманентное красное окрашивание окклюдина.
      2. Сохраните выбранное изображение в формате tiff и подвергните его процедуре «очистки» для устранения артефактов с помощью графического редактора (например, Adobe PhotoshopCC [версия 20.0.4]).
      3. После этого измерьте все поля интереса с помощью приложения Analyze Particle of ImageJ2 и сообщите данные в виде количества пикселей.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый эксперимент должен выполняться в трех экземплярах с тремя внутренними полями репликации, анализируемыми для каждой репликации. Для количественного определения слизи тот же принцип измерения пикселей может быть применен к изображениям, полученным из нейтральных муцинов, окрашенных в пурпурный цвет, и кислотной слизи, окрашенной в ярко-синий цвет, соответственно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первым важным аспектом является определение приемлемости базового 3D слизистой оболочки кишечного эквивалента для экспериментальных целей. Это делается с помощью наиболее широко используемых красителей в гистологических и гистопатологических лабораториях, а именно гематоксилина (окрашивает ядерный материал в темно-сине-фиолетовый цвет) и эозина (окрашивает цитоплазматический материал различными оттенками розового). Окрашивание H&E сначала выполняется на необработанном контроле, который культивируется в тех же условиях и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленная здесь базовая реконструированная система моделирования слизистой оболочки кишечника (рис. 6) сочетает в себе физиологическую сложность (более физиологически релевантные 3D-клеточные культуры, содержащие монослой Caco-2 с богатой ECM опорой из собственной пластинки, содержащей фибробласты и моноциты) с экспериментальной простотой (использование коммерческих клеточных линий человека для создания стандартизированной и легко воспроизводимой системы)13. Таки...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спасибо Фонду Умберто Веронези за стипендию, поддерживающую исследовательскую работу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Комплект Alcian Blue/PASScyTek Laboratories, Inc.APS-1, APS-2Набор для иммуногистохимического окрашивания
Раствор Blue TrypanТермо Фишер15250061Анализ количества клеток
Клетки колоректальной аденокарциномы Caco-2ATCCATCC HTB-37Клеточная линия
Citro-Histo-Clear на основе лимоненаГистолинальные лабораторииR0050CITROРеагент для вложения парафина
Dulbecco' Модифицированный Eagle Medium (DMEM)GIBCO11965092Клеточный реагент Colture
Центр встраиванияГистолинальные лабораторииTEC2900Инструмент для вложения парафина
Сыворотка для плода быка (FBS)GIBCOA5256701Клеточный реагент Colture
Хэнкс' Сбалансированный сольный раствор (HBSS)GIBCO12350039Клеточный реагент Colture
Набор для ELISA для человека MidkineКогезионные бионаукиCEK1270комплект ELISA
Инвертированный микроскопEclipse Ts2, NikonMFA34100микроскоп
Мышиные фибробласты L929ATCCATCC ®-CCL1Клеточная линия
LC3-IINovus BiologicalsNB910-40752SuperNovusPackАнтитела
L-глутаминGIBCOA2916801Клеточный реагент Colture
ОкклюдинNovus BiologicalsNBP1-87402Антитела
Парафин Lab-O-Wax PLUS 56 и #176; C– 58 и #176; CГистолинальные лабораторииR0040 PLUSИнструмент для вложения парафина
Пенициллин-стрептомицинGIBCO15070063Клеточный реагент Colture
Пенициллин-стрептомицинGIBCO15070063Клеточный реагент Colture
Коллаген типа I крысиного хвостаGIBCOA1048301Клеточный реагент Colture
Средняя среда Мемориального института Росвелл-Парк (RPMI)GIBCO21870076Клеточный реагент Colture
Пируват натрияGIBCO11360070Клеточный реагент Colture
Thermo Fisher Countess II FL Автоматизированный счетчик ячейокТермо ФишерTF-CACC2FLИнструмент для подсчёта клеток
ТрансвеллКостар Корнинг3413Пластик для клеточного кольчура
ТрипсинGIBCO15090046Клеточный реагент Colture
U937 — промоноцитарная линия миелоидного лейкоза человекаATCCATCC CRL-1593.2Клеточная линия
Набор для окрашивания UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (постоянный красный)ScyTek Laboratories, Inc.AMH080Набор для иммуногистохимического окрашивания

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17(2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357(2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135(2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611(2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172(2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155(2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030(2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038(2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131(2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591(2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3(2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Intestinal ModelIn Vitro IntestineCaco 2 CellsU937 MonocytesL929 FibroblastsParaffin EmbeddingTight Junction ProteinsGluten Induced InflammationOccludin StainingImmune Cell Migration

Related Articles