Стратегии количественной оценки, оценки жизнеспособности и визуализации биопленок Acinetobacter

Summary

Этот протокол описывает подготовку посевного материала, количественное определение биопленки на микротитровых планшетах с использованием кристаллического фиолетового красителя, количество жизнеспособных веществ в биопленках и визуализацию биопленок Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и его образование биопленки может способствовать выживанию на сухих поверхностях, таких как больничные условия. Таким образом, количественная оценка и визуализация биопленки являются важными методами оценки способности штаммов Acinetobacter вызывать внутрибольничные инфекции. Биопленки, образующиеся на поверхности микропланшета, могут быть количественно оценены с точки зрения объема и количества клеток. Объемы биопленки могут быть количественно определены путем окрашивания с помощью кристаллического фиолетового, промывки, обесцвечивания с использованием этанола, а затем измерения солюбилизированного красителя с помощью микропланшетного ридера. Чтобы количественно определить количество клеток, встроенных в биопленки, биопленки соскребают с помощью клеточных скребков, собирают в физиологическом растворе, энергично перемешивают в присутствии стеклянных шариков и наносят на агар Acinetobacter. Затем планшеты инкубируют при 30 °C в течение 24-42 ч. После инкубации красные колонии нумеруются, чтобы оценить количество клеток в биопленках. Этот жизнеспособный метод подсчета также может быть полезен для подсчета клеток Acinetobacter в биопленках смешанных видов. Биопленки Acinetobacter можно визуализировать с помощью флуоресцентных красителей. Коммерчески доступная микропланшет, предназначенная для микроскопического анализа, используется для формирования биопленок. Затем биопленки, прикрепленные к нижней поверхности, окрашивают красителями SYTO9 и пропидидом пропидия, промывают и визуализируют с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Introduction

Известно, что Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и все^{чаще регистрируется} заражение людей, особенно в медицинских учреждениях1. Он широко распространен в больницах, медицинских учреждениях и пищевых продуктах ^2,3,4. Он может выживать в течение длительного периода времени в различных средах, включая больничные поверхности, такие как поручни кроватей, прикроватные тумбочки, поверхность аппаратов искусственной вентиляции легких и раковины⁴. Такая персистенция на поверхностях окружающей среды может быть одним из существенных факторов, способствующих внутрибольничным инфекциям Acinetobacter⁴.

Биопленка представляет собой форму микробной жизни и представляет собой микробный матрикс, состоящий из живых микробных клеток и внеклеточных полимерных веществ (ЭПС) из клеток⁵. Микробные клетки встроены в матрикс и часто обладают высокой устойчивостью к воздействиям окружающей среды, таким как жара, соли, сухость, антибиотики, дезинфицирующие средства и силы сдвига ^6,7.

Acinetobacter может образовывать биопленки на поверхностях, что позволяет предположить, что он может способствовать увеличению выживаемости на поверхностях окружающей среды, включая больничные поверхности, и повышению устойчивости к лечению антибиотиками ^8,9. Кроме того, образование биопленки Acinetobacter может быть тесно связано с клиническими исходами у человека⁸. Таким образом, формуемость биопленки штаммов Acinetobacter может быть одним из показателей в прогнозировании экологической выживаемости и инфекций человека ^8,10.

Биопленки, прикрепленные к поверхности, могут быть количественно оценены и визуализированы для оценки формуемости биопленки. Для количественного определения прикрепленных к поверхности биопленок биопленки обычно окрашивают красителями, окрашивающими биопленку, такими как кристаллический фиолетовый, а красители элюируют в растворе и измеряют оптическую плотность¹¹. Визуализация биопленок является еще одним хорошим подходом к оценке формуемости биопленки¹¹. Метод визуализации с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), использующий специфичность с использованием флуоресцентных красителей, может быть более полезным для характеристики морфологии биопленки по сравнению с другими методами, такими как SEM^12,13.

Количество жизнеспособных клеток в биопленках можно подсчитать, чтобы оценить количество жизнеспособных клеток в биопленках¹¹. Жизнеспособные клетки, встроенные в биопленки, отделяют, разбавляют, распределяют по агаровым пластинам, инкубируют и нумеруют. Поскольку большее количество клеток, вероятно, соответствует инфекционной дозе, это может предоставить более подробную информацию о биопленках, например, о потенциале инфекции, связанном с количеством клеток^13,14.

В этой статье представлены пошаговые протоколы для (1) количественной оценки поверхностно-прикрепленных биопленок, (2) подсчета жизнеспособных клеток в биопленках и (3) визуализации биопленок с помощью CLSM Acinetobacter. В представленных протоколах описаны методы оценки формуемости биопленки изолятов Acinetobacter и характеристика их биопленок.

Protocol

1. Подготовка бактериального посевного материала

1. Снимите флакон с глицерином, хранящийся при температуре -80 °C.
2. Удалить бактериальный штамм (2-10 мкл) из флакона с помощью стерильного наконечника пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются штаммы Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) и A. ursingii (24-1).
3. Засейте бактериями коммерчески доступную пластину кровяного агара (триптический соевый агар с добавлением 5% овечьей крови, см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать другие среды, такие как питательный агар или агар МакКонки.
4. Прорисуйте поверхность агара стерильной петлей с прерывистым пламенем, чтобы разбавить ее.
5. Поместите агаровую пластину вверх дном в инкубатор и инкубируйте при 30 °C в течение ночи в течение 20-24 ч.
6. Стерильной иглой отбирают одну колонию бактериальной культуры и инокулируют 5 мл стерильного инфузионного бульона для мозгового сердца (BHI, см. таблицу материалов) с культурой.
7. Инкубируйте инокулированный бульон во встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °C в течение ночи в течение 20-24 ч при частоте вращения около 150 об/мин.
8. Переложите 1 мл ночной культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте ночную культуру при 6 000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
9. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
10. С помощью вихря ресуспендируйте гранулу в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS).
11. Центрифугу при 6 000 × г в течение 10 мин при RT и удалить надосадочную жидкость.
12. Ресуспендируйте гранулу в стерильном десятикратно разбавленном BHI с помощью вихря до оптической плотности около 0,1 при длине волны 600 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность около 0,1 эквивалентна примерно 10,7 КОЕ/мл.

2. Количественное определение биопленки с использованием кристаллического фиолетового

1. Добавьте 200 мкл посевного материала в каждую лунку стерильной полистирольной 96-луночной пластины (см. таблицу материалов) и добавьте 200 мкл деионизированной воды в каждую из крайних лунок, чтобы предотвратить высыхание внутренних лунок¹⁵.
2. Добавьте 200 мкл десятикратно разбавленного BHI в каждую лунку той же пластины в качестве отрицательного контроля.
3. Инкубируйте планшет при температуре 25 °C в течение 24 ч.
4. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальная пипетка часто более удобна для нескольких образцов.
5. Осторожно добавьте 300 мкл PBS в каждую лунку и удалите надосадочную жидкость пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальная пипетка часто более удобна для нескольких образцов.
6. Повторите шаг 2.5 еще два раза.
7. Добавляют 200 мкл раствора кристаллического фиалка (1%) (см. таблицу материалов) в каждую лунку и инкубируют при RT в течение 30 мин.
8. Повторите шаги 2.4-2.6.
9. Добавьте 200 мкл абсолютного этанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 минут при RT. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
10. Перенесите элюирование 100 мкл из каждой лунки на новую 96-луночную планшет.
11. Измерьте поглощение при длине волны 595 нм с помощью микропланшетного ридера (см. таблицу материалов).
12. Когда абсорбция превысит 2,0, произведите надлежащее разбавление образца до абсорбции ниже 2,0 в абсолютном этаноле и измерьте его, как показано на этапе 2.11. Затем рассчитайте абсорбцию образца (конечное значение), умножив наблюдаемое значение на коэффициент разбавления.
13. Рассчитайте истинное поглощение образцов путем вычитания среднего значения отрицательного контроля из значения каждой лунки испытуемых образцов на той же луночной пластине.

3. Подсчет жизнеспособности биопленки

1. Добавляют 1 мл посевного материала (шаг 1) в каждую лунку стерильной полистирольной 12-луночной планшета¹⁵. Инкубируйте планшет при температуре 25 °C в течение 24 ч. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
2. Осторожно добавьте в каждую лунку по 1,5 мл стерильного ПБС и удалите надосадочную жидкость пипеткой. Добавьте 1 мл стерильного PBS в каждую лунку.
3. Соскребите дно и стенки колодца с помощью встроенных скребков.
4. Полученную клеточную суспензию переложить в стерильную пластиковую пробирку (10-1), содержащую 9 мл физиологического раствора (0,85% NaCl) и ^10-20 стеклянных шариков (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы собрать любой остаточный мусор биопленки, оставшийся на нижней поверхности лунки, его можно ресуспендировать и перенести пипеткой с использованием физиологического раствора из трубки ^10-1 .
5. Вихрь трубки ^10-1 в течение 60 с с максимальной скоростью.
6. Проводят 10-кратное последовательное разведение, перенося 1 мл в следующую стерильную пробирку (10-2), содержащую 9 мл физиологического раствора (0,85 % NaCl), до ^10-7.
7. Распределите по 100 мкл из каждого разведения на агар Acinetobacter (см. таблицу материалов) и инкубируйте агаровые планшеты при 30 °C в течение 24-42 ч.
8. Вручную подсчитайте количество типичных красных колоний на каждой пластине в диапазоне от 10 до 250.
9. Рассчитайте количество жизнеспособных клеток в биопленке каждой лунки, используя приведенное ниже уравнение:
   Жизнеспособные клетки = Количество колоний × Коэффициенты разведения × 10

4. Визуализация биопленки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ)

1. Добавьте 200 мкл посевного материала в каждую лунку стерильной 96-луночной планшета, предназначенной для микроскопического анализа.
2. Инкубируйте планшет при температуре 25 °C в течение 24 ч.
3. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
4. Осторожно добавьте в каждую лунку 300 мкл стерилизованной фильтром деионизированной воды и удалите надосадочную жидкость пипеткой.
5. Повторите шаг 4.4.
6. Приготовьте смесь SYTO 9 и йодида пропидия (см. таблицу материалов), разведенную в фильтрованной деионизированной воде до конечной концентрации 10 мкМ и 60 мкМ соответственно.
7. Добавьте смесь в каждую лунку по 200 мкл и инкубируйте планшет в течение 20-30 минут при RT в темноте.
8. Повторите шаги 4.3-4.4
9. Визуализируйте биопленки, прикрепленные к нижней поверхности, с помощью CLSM с длиной волны возбуждения 488 нм и 561 нм и диапазоном длин волн излучения 499-535 нм и 568-712 нм соответственно.

Results

В соответствии с протоколом, биопленки изолятов Acinetobacter , первоначально выделенных с кухонных поверхностей, формировали на полистирольной 96-луночной пластине, окрашивали кристаллическим фиолетовым, а красители растворяли в этаноле и измеряли по массе биопленки (рис. 1). Количество биопленок сильно варьировало в зависимости от штаммов и составляло от 0,04 до 1,69 (рис. 1). На основании критериев, установленных Stepanović et ^al.16...

Discussion

С помощью описанного протокола измеряли, визуализировали биопленкообразование изолятов Acinetobacter в разной степени и оценивали жизнеспособные клетки в биопленках (рис. 1, рис. 2 и рис. 3).

В этом протоколе использовались две разные температуры: 30 °C для роста и 25 °C для образования биопленки Acinetobacter. 30 °C была использована потому, что во многих исследованиях использовалась бо...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-луночная клеточная культуральная пластина	SPL	30096	Полистироловая 96-луночная пластина
BHI (Brain Heart Infusion) бульон	Merck KGaA	1.10493.0500
Базовая пластина для кровяного агара	KisanBio	MB-B1005-P50	Питательная среда для Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Селективная пластина для Acinetobacter
Crystal violet раствор	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD набор для обеспечения жизнеспособности биопленки	Invitrogen	L10316	SYTO9 и пропидия йодида
Считыватель микропластин	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Измерение биопленки
RBC Стеклянные бусины	RBC	RG001	Стеклянные бусины
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Микропланшет предназначен для CLSM