Двухфотонная кальциевая визуализация активности переднего мозга у взрослых рыбок данио-рерио

Флуоресцентная визуализация кальция с генетически кодируемыми индикаторами или синтетическими красителями является мощным методом измерения активности нейронов у животных, включая нечеловекообразных приматов, грызунов, птиц и^{насекомых.} Активность сотен клеток, расположенных на глубине примерно до 800 мкм под поверхностью мозга, может быть измерена одновременно с помощью многофотонной визуализации ^2,3. Активность определенных типов клеток также может быть измерена путем экспрессии показателей кальция в генетически определенных популяциях нейронов. Применение метода визуализации для моделей мелких позвоночных открывает новые возможности в области нейронных вычислений в разных областях мозга.

Рыбки данио-рерио являются широко используемой модельной системой в исследованиях в области нейробиологии. Личинки рыбок данио-рерио примерно через 6 дней после оплодотворения были использованы для визуализации кальция из-за их миниатюрного мозга и прозрачного^тела. Молодь рыбок данио-рерио (3-4 недели) также используется для изучения нейронных механизмов, лежащих в основе сенсомоторных путей ^5,6. Тем не менее, максимальный уровень производительности для сложного поведения, включая ассоциативное обучение и социальное поведение, достигается в старшем возрасте ^7,8 лет. Таким образом, требуется надежный протокол для изучения множественных когнитивных функций в мозге взрослых рыбок данио с помощью методов визуализации. В то время как личинки данио-рерио и молодые рыбки данио-рерио могут быть помещены в агарозу для визуализации in vivo, взрослые рыбки данио-рерио в возрасте 2 месяцев и старше страдают от гипоксии в таких условиях и физически слишком сильны, чтобы их можно было сдержать агарозой. Поэтому требуется хирургическое вмешательство, чтобы стабилизировать мозг и дать возможность животному свободно дышать через жабры.

Здесь мы опишем протокол подголовника, который включает в себя новую конструкцию одной дуги. Сокращение времени операции на 25 минут в два раза быстрее, чем при предыдущем методе⁹. Описана также конструкция записывающей камеры (полушестигранного бака), головного столика и быстросъемного механизма для совмещения двух частей⁹. Наконец, описывается установка для представления иммерсивного визуального стимула для изучения визуально запускаемой активности мозга и поведения. В целом, процедуры, описанные здесь, могут быть использованы для выполнения двухфотонной визуализации кальция в генетически определенных клеточных популяциях у взрослой рыбки данио с ограниченной головой, что позволяет исследовать активность мозга во время различных поведенческих парадигм.

Все процедуры для животных были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Academia Sinica. Подробную информацию об инструментах исследования можно найти в Таблице материалов.

1. Подготовка записывающей камеры

1. Подготовьте полушестигранный резервуар, опорную плиту и головную ступень (Рисунок 1А; Дополнительные файлы 1-3). Головная ступень состоит из двух металлических стоек, прикрепленных к круглой пластине. Круглая пластина содержит канавки, которые можно зафиксировать на опорной плите. После склеивания головная ступень и опорная плита укладываются на дно полушестигранного резервуара.
2. Поместите полушестигранный резервуар на экспериментальную площадку микроскопа. Платформа должна иметь возможность двигаться в направлениях X и Y, не упираясь в предел этапа трансляции.
3. Направьте инфракрасный (ИК) свет с длиной волны 810 нм и камеру на головной столик для записи поведения. Убедитесь, что поле зрения камеры достаточно велико, чтобы вместить взрослую рыбку данио.
   1. Чтобы двухфотонный лазер и визуальный стимул не мешали поведенческой записи, установите перед камерой короткочастотный фильтр с длиной волны 875 нм и длинночастотный фильтр с длиной волны 700 нм соответственно.
4. Чтобы представить визуальный стимул, прикрепите пленки обратной проекции к внутренней стороне трех стенок полушестиугольного резервуара (рис. 1А).
5. Направьте три прожектора на три поверхности резервуара. Три изображения должны быть выровнены, чтобы сформировать непрерывную визуальную сцену. Чтобы предотвратить загрязнение сигнала флуоресценции кальция светом проектора, поместите фильтр нейтральной плотности и фильтр красного цвета (600 нм, длиннопроходный) перед каждым проектором, а полосовой фильтр (510/80 нм) перед фотоумножителем (ФЭУ).

Рисунок 1: Инструменты, необходимые для операции с подголовником. (A) Быстросъемный механизм между круглой пластиной головной ступени и опорной плитой внутри полушестигранного резервуара. Файлы систем автоматизированного проектирования (САПР) деталей, изготовленных по индивидуальному заказу, можно найти в Дополнительных файлах 1-4. (B) Ω-образная перекладина для подголовника. (C) Трехосевой микроманипулятор, используемый для позиционирования головки шины к месту крепления. Врезка: ориентация головного стержня в глине. (D) Пушка для удержания рыбы во время операции. Врезка: ориентация рыбы внутри пушки. (E) Модуль загрузки рыбы и микроманипулятор, используемый для загрузки рыбы на головную ступень. Врезка: ориентация рыбы в модуле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Операция с подголовником

1. Подготовьте Ω-образную планку головы (Рисунок 1Б; Дополнительный файл 4) для подголовника данио-рерио. Для этого приложите кусочек пластилина на масляной основе к трехосевому микроманипулятору. Убедитесь, что глина достаточно твердая, чтобы удерживать перекладину головы, но достаточно мягкая, чтобы отсоединиться от перекладины после подголовника.
2. Вставьте кронштейн головного бруска в глину и сориентируйте головной брусок горизонтально (Рисунок 1C). Это гарантирует, что последующее крепление перекладины головы к рыбке данио-рерио будет ровным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Головной стержень может быть изготовлен из титана (24 мг) или нержавеющей стали (43 мг) и может быть повторно использован для нескольких экспериментов. Материал перекладины для головы не влияет на поведение взрослых рыбок данио (вес колеблется в пределах 300-1000 мг) под подголовником.
3. Подготовьте пушку, полую трубку для удержания тела рыбы на месте во время операции (рис. 1D).
4. Приготовьте 0,03% и 0,01% трикаина метансульфоната (ТМС; см. таблицу материалов) в воде аквариума. Он будет использоваться для анестезии и поддержания рыбы в седативном состоянии во время операции.
5. Подготовьте четыре тканевых тампона, чтобы удалить лишнюю кожу и воду из мест прикрепления на черепе. Чтобы подготовить каждый тампон, разрежьте бумажное полотенце на квадрат диаметром 3 см и сложите по диагонали, чтобы получилась трубообразная структура. Скрутите концы трубки в тонкую точку. Место прикрепления очень маленькое, поэтому тонкая точка позволяет более точно контролировать тампон.
6. Подготовьте модуль загрузки рыбы для микроманипулятора (рис. 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль состоит из двух стальных стоек, скрепленных между собой угловым зажимом. Одна стойка крепится к микроманипулятору, а другая стойка удерживает вращающийся зажим стойки, который несет рыбу. Модуль используется для позиционирования рыбы на головной столик с точным контролем. Вращающийся зажим стойки служит регулятором шага для изменения угла наклона рыбы.
7. Обезболивайте рыб 0,03% ТМС в воде аквариума. На следующих этапах используйте шприц для введения 0,01% ТМС в воде аквариума в рот короткими импульсами каждые 90 с. Поток воды из перфузии должен вызывать движение жабр. Это позволит рыбе выжить более 40 минут во время операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Tg[neuroD:GCaMP6f] используется из-за его широкой экспрессии индикатора кальция в переднем мозге как на личиночной, так и на взрослой стадиях¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию используйте гравитационную перфузию, чтобы обеспечить постоянный приток воды в рот во время операции, когда заняты обе руки.
8. Заверните рыбу в капсулу (Рисунок 2А), которая удерживает рыбу внутри пушки.
   1. Заверните рыбу, находящуюся под наркозом, в кусок влажной бумажной ткани, начиная от кончика хвоста примерно на 1 мм от хвоста до жабр. Убедитесь, что упаковка плотно затянута, чтобы предотвратить выскальзывание рыбы из ткани.
   2. Оберните мягкую пластиковую трубку с продольной прорезью (например, термоусадочную трубку среднего размера, разрезанную) вокруг бумажной ткани, чтобы покрыть рыбу от конца хвоста примерно до 2 мм хвоста до жабры. Трубка гарантирует, что тело рыбы остается прямым на протяжении всей операции.
   3. Оберните бумажное полотенце вокруг трубки до диаметра, который примерно равен диаметру пушки.
   4. Оберните вокруг бумажного полотенца мягкую пластиковую трубку, вырезанную из колбы пластиковой пипетки. Это обеспечивает плавную загрузку капсулы в пушку.
   5. Загрузите рыбу в пушку.
9. С помощью скальпеля удалите кожу, покрывающую места прикрепления, два треугольных участка черепа ростролатерально по отношению к мозжечку и над жабрами (Рисунок 2B), затем удалите кожу, покрывающую область между местами прикрепления. Используйте тканевые тампоны, чтобы высушить места прикрепления и очистить оставшуюся кожу.
   1. Используйте регулируемую платформу для поддержки головы во время удаления кожи, но платформа не должна соприкасаться с глазами, чтобы избежать травмы глаз во время операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное удаление кожи в местах прикрепления имеет решающее значение для уменьшения артефактов движения во время визуализации.
10. Нанесите каплю тканевого клея (см. Таблицу материалов) в центр каждого места крепления с помощью наконечника для пипетки объемом 10 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевый клей покрывает места крепления и быстро высыхает. Тканевый клей обеспечивает связующее звено между черепом и стоматологическим цементом, используемым для приклеивания стержня головы, и предотвращает попадание воды из жабр в место крепления.
11. Поставьте туловище рыбы в вертикальное положение и расположите планку головы немного выше и каудально к местам крепления, готовясь к приклеиванию головного стержня.
12. Приготовьте стоматологический цемент (см. Таблицу материалов) и сразу же используйте его, чтобы приклеить головной стержень к черепу (Рисунок 2C). Процедура зависит от времени и должна быть проведена в течение 45 секунд.
    1. Смешайте одну маленькую ложку полимера с четырьмя каплями быстрого мономера и одной каплей катализатора V. Равномерно перемешивайте смесь в течение 15 с.
    2. С помощью микропипетки и наконечника для пипетки объемом 10 мкл нанесите смесь на места прикрепления и область между ними. Не закрывайте жабры и глаза.
    3. Аккуратно прижмите головной стержень к цементу с помощью микроманипулятора. Покройте верхний брусок оставшимся цементом.
    4. Подождите 12 минут, чтобы стоматологический цемент затвердел. Избегайте попадания воды на цемент.
13. Чтобы улучшить оптический доступ к переднему мозгу для визуализации кальция, удалите кожу над предмозговым мозгом. Удаление кожи может быть выполнено за 3 минуты с помощью пяти надрезов с помощью скальпеля (рис. 2D). Убедитесь, что липидные капли, прилипшие к поверхности черепа, удалены.
14. После застывания удалите глину с головного бруска.
15. Перенесите всю капсулу из пушки в регулятор тангажа в рыбопогрузочном модуле микроманипулятора.
16. Используйте микроманипулятор для позиционирования рыбы. Головной стержень должен располагаться поверх металлических стоек головного столика. Немного увеличьте угол тангажа рыбы, чтобы поверхность переднего мозга могла быть лучше выровнена по оптической плоскости во время двухфотонной визуализации.
17. Приклейте планку головы к металлическим стойкам с помощью клея, отверждаемого ультрафиолетом (УФ). Для отверждения достаточно 15-секундного воздействия ультрафиолета.
18. Вытащите рыбу из капсулы и зафиксируйте головную ступень на опорной пластине в полушестиугольном резервуаре.
19. Погрузите животное в воду аквариума. Рыба должна начать дышать и прийти в себя после наркоза в течение 1-2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию используйте шприцевую перфузию для подачи пресной воды в рот.

Рисунок 2: Основные этапы операции по установке подголовника . (А) Состав капсюля внутри пушки. (Б) Места прикрепления на черепе (красные). Красными стрелками обозначены места расположения кровеносных сосудов. (C) Вверху: перекладина головы, прикрепленная к черепу рыбы. Дно: рыба, загруженная на головную ступень. (D) Разрезы, необходимые для удаления кожи над передним мозгом. Цифры обозначают последовательность резки. Избегайте удаления шкуры в отмеченном месте (наконечник стрелы), чтобы предотвратить кровотечение животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Двухфотонная визуализация

1. Включите лазер и подождите 30 минут, пока мощность стабилизируется. Установите длину волны 920 нм и мощность около 50 мВт на образце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерный луч, управляемый резонансным сканером, медленно движется в точках поворота траектории сканирования. Чтобы предотвратить повреждение тканей, используется ячейка Поккельса, которая снижает мощность лазера в точках оборота.
2. Поместите записывающую камеру, содержащую рыбку данио-рерио со скованной головой, на экспериментальную платформу (Рисунок 3A). Платформа должна иметь возможность двигаться в направлениях X и Y, не упираясь в предел этапа трансляции.
3. Расположите линзу объектива как можно ближе к поверхности переднего мозга. Объектив должен быть направлен на передний край зрачка (рис. 3Б).
4. Откройте лазерный затвор и включите ФЭУ. Постепенно поднимайте линзу объектива (~1 мм) до тех пор, пока на флуоресцентном изображении не будет видна тыльная часть переднего мозга (рис. 3C).
5. Чтобы увеличить количество регистрируемых нейронов, используйте пьезопривод для получения изображений на разной глубине (шесть плоскостей изображения, расположенных на расстоянии 15 мкм друг от друга). Это увеличит выход данных за счет частоты кадров. Включите быстрое сканирование по оси Z для управления пьезоприводом (равномерный режим, количество срезов = 6, размер шага = 15 мкм, форма сигнала = пилообразный, время обратного хода = 4 мс, задержка привода = 8 мс).
6. Для регистрации поведения включите инфракрасные (ИК) индикаторы с длиной волны 810 нм с обеих сторон резервуара. Отрегулируйте угол, чтобы осветить все тело, которое должно быть хорошо видно в камере.
7. Включите проекторы.
8. Начните запись данных.

Рисунок 3: Установка для визуализации кальция, записи поведения и отображения визуальных стимулов . (A) Три проектора подают визуальный стимул на стенки полушестиугольного резервуара. ИК-лампы сбоку используются для подсветки тела рыбки данио. (B) Позиционирование объектива. Слева: вид спереди. Справа: вид сбоку. Расстояние между 16-кратным объективом и целевой областью мозга составляет около 2,5 мм. (C) Пример двухфотонного изображения. Слева: максимальная проекция всего дорсального переднего мозга в Tg[neuroD:GCaMP6f]. Справа: увеличенное изображение для выявления нейронов в нескольких областях мозга. Врезка: большее увеличение из другой области мозга. Изображения представляют собой среднее значение 10 с данных, записанных с частотой 5 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протокол состоит из двух частей: операция на подголовнике и двухфотонная кальциевая визуализация активности нейронов в переднем мозге. Успех операции определяется выживаемостью животного и устойчивостью подголовника. Выживаемость может быть значительно улучшена за счет частой перфузии 0,01% раствора ТМС через рот во время операции. Рыбы должны оправиться от наркоза и активно дышать в течение 1-2 минут после погружения в воду аквариума. Двухфотонная кальциевая визуализация позволяет регистрировать активность отдельных нейронов в дорсальном отделе переднего мозга на глубине до 200 мкм от поверхности мозга через интактные черепа (~40 мкм в толщину). Этот диапазон визуализации охватывает несколько зон дорсального конечного мозга (D), включая медиальную зону (Dm), ростральную часть центральной зоны (rDc), каудальную часть центральной зоны (cDc) и латеральную зону (Dl). Вместе они составляют 30% конечного мозга взрослых рыбок данио-рерио (рис. 3C). При объемной визуализации с использованием пьезопривода мы обычно регистрируем активность 150 нейронов в Dl или cDc и 300 нейронов в Dm и rDc в Tg[neuroD:GCaMP6f]10. Во время визуализации мозга выполняется одновременная поведенческая запись, которая позволяет идентифицировать нейрональные корреляты двигательных выходов (рис. 4).

Во время двухфотонной визуализации движения хвоста не должны вызывать видимый артефакт движения на изображении. Небольшое (<1 мкм) и преходящее движение может наблюдаться во время экстремальной борьбы. Эти движения, как правило, обратимы, поэтому визуализацию можно продолжить впоследствии. Мы также наблюдаем медленный дрейф (<1 мкм мин-1) в боковом и осевом направлениях9. Чтобы предотвратить потерю нейронов из-за дрейфа осевого образца, мы обычно ограничиваем сеанс визуализации 10 минутами. Фотообесцвечивание кальциевого индикатора не должно наблюдаться после 10-минутного сеанса визуализации при указанной мощности лазера.

Рисунок 4: Отслеживание поведения и паттерн нейронной активности у взрослых рыбок данио. (А) Пример кадра, записанного камерой поведения (вентральный вид). (B) Активность нейронов переднего мозга (ΔF/F, черный) и интенсивность движения хвоста (синий). Интенсивность движения хвоста количественно определялась средним значением абсолютной попиксельной разницы между последовательными видеокадрами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Проектирование опорной плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Конструкция круглой пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Конструкция полушестигранного резервуара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Конструкция головной планки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Сведения об устранении неполадок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.