Здесь мы обсуждаем рабочий процесс подготовки, препарирования, монтажа и изображения живого мозга эксплантата личинок третьего возраста Drosophila melanogaster для наблюдения за клеточной и субклеточной динамикой в физиологических условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация живых клеток личинки Drosophila melanogaster третьего возраста
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нервные стволовые клетки дрозофилы (нейробласты, далее NB) подвергаются асимметричному делению, регенерируя самообновляющийся нейробласт, а также образуя дифференцирующую ганглионарную материнскую клетку (GMC), которая претерпевает одно дополнительное деление, чтобы дать начало двум нейронам или глии. Исследования NB раскрыли молекулярные механизмы, лежащие в основе полярности клеток, ориентации веретена, самообновления и дифференцировки нервных стволовых клеток. Эти асимметричные клеточные деления легко наблюдаются с помощью визуализации живых клеток, что делает личинки NB идеально подходящими для исследования пространственно-временной динамики асимметричного деления клеток в живой ткани. При правильном препарировании и визуализации в среде, обогащенной питательными веществами, NB в мозге эксплантата надежно делятся в течение 12-20 часов. Ранее описанные методы технически сложны и могут быть сложными для новичков в этой области. Здесь описан протокол подготовки, вскрытия, монтажа и визуализации живых эксплантатов личинок третьего возраста с использованием добавок жирового тела. Также обсуждаются потенциальные проблемы и приводятся примеры того, как можно использовать эту технику.
Введение
Асимметричное деление клеток (ACD) - это процесс, при котором субклеточные компоненты, такие как РНК, белки и органеллы, неравномерно распределяются между дочерними клетками 1,2. Этот процесс обычно наблюдается в стволовых клетках, которые подвергаются ACD, чтобы дать начало дочерним клеткам с различными судьбами развития. Дрозофила NB делятся асимметрично, образуя один NB, который сохраняет свою стволовость, и одну ганглионарную материнскую клетку (GMC). GMC подвергается дальнейшим делениям с образованием дифференцирующих нейронов или глии3. Асимметрично делящиеся NB в изобили....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны материалы, необходимые для проведения этого исследования.
1. Соображения и подготовка к эксперименту
- Не допускайте переполнения личинок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество мозга эксплантата личинок напрямую связано со здоровьем и качеством личинок до вскрытия. Личинки, которые недоедают из-за перенаселенности, обычно дают мозг более низкого качества30.- Убедитесь, что на одно блюдо с крышкой для еды приходится не более 20-30 личинок, чтобы избежать недоедания. Примеры этого можно увидеть на рисунке 2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Вскрытие и визуализация НБ центральной доли мозга, экспрессирующих Pins::EGFP и Cherry::Jupiter
Чтобы продемонстрировать этот протокол, личинки экспрессируют управляемый UAS Cherry::Jupiter13 и эндогенно помеченные Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) визуализировали в течение 4 ч с использованием описанного протокола с использованием многолуночных слайдов визуализации (рис. 5C, D
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе изложен один из подходов к визуализации живого мозга эксплантатов личинок Drosophila melanogaster . Описанный здесь протокол позволяет наблюдать за мозгом эксплантата в течение 12-20 часов в правильных экспериментальных условиях. Особое внимание должно быть уделено подготовке образцов и планированию желаемых экспериментов. Как уже говорилось выше, одним из наиболее важных факторов, определяющих качество рассеченной ткани, является здоровье личинок. Чтобы добиться максимально возможного качества,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет финансовой информации, которую они могли бы декларировать.
Благодарности
Это исследование поддерживается R35GM148160 (C.C.) и Национальным институтом здравоохранения (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R.C.S.)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 & микро; m полиэфирсульфон (PES) Мембрана | Genesee | 25-231 | Вакуумные фильтры |
| Agar | Genesee | 20-248 | гранулированный агар |
| Аналитический компьютер | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU с двумя процессорами 3,80 ГГц под управлением Windows 10 на 64-битной операционной системе |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Конфокальный микроскоп Ibidi | 80826 | |
| Nikon | NA | ||
| Изготовленный на заказ металлический предметный стек | NA | NA Смотрите Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) для спецификаций | |
| Диссекционная посуда | Fisher Scientific | 5024343 | 3-х луночная фарфоровая микроточечная пластина |
| Щипцы для препарирования | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Диссекционный микроскоп | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Клетка для сбора эмбрионов | Genesee | 59-100 | |
| Flypad с доступом к CO2 для обезболивания взрослых мух | Genesee | 59-172 | |
| Газопроницаемая мембрана | YSI | 98095 | Газопроницаемая мембрана |
| Glass Cover Предметные стекла | Электронная микроскопия Sciences | 72204-03 | # 1,5; 22 мм x 40 мм стеклянные покровные стекла |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Альтернативы: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Быстрорастворимые дрожжи | Saf-Instant | NA | |
| Патока | Genesee | 62-117 | |
| Чашка Петри | Greiner Bio-One | 628161 | 60 мм x 15 мм чашка Петри |
| Вазелин | вазелин | NA | |
| Среда для насекомых Schneider's с L-глутамином и бикарбонатом натрия жидкость | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook Программное обеспечение для сбора данных | 3i | NA | |
| Вакуумная фильтрационная установка с 0,22 &; &микро; м Мембранный фильтр PES | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Ссылки
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
